脈沖場凝膠電泳技術及其在細菌感染性疾病中的應用

豆清婭(DOU Qing-ya)，吳安華(WU An-hua)

(中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

·綜述·

脈沖場凝膠電泳技術及其在細菌感染性疾病中的應用

Pulsed-field gel electrophoresis and its application in bacterial infectious diseases

豆清婭(DOU Qing-ya)，吳安華(WU An-hua)

(中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

脈沖場凝膠電泳； PFGE； 應用； 基因分型； 追蹤傳染源

為研究細菌的流行特征、追蹤傳染源，國內外廣泛采用的方法是對相關菌株進行分型，分析菌株間的同源性關系。細菌分型方法分為表型分型和基因分型兩種，表型分型主要有根據(jù)菌落形態(tài)和生化特征等的生物分型、抗菌藥物藥敏譜分型、血清分型、噬菌體分型，基因分型包括質粒分型、核糖體分型、染色體DNA限制性內切核酸酶圖譜分析(REA)、限制片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、脈沖場凝膠電泳分型(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)、隨機引物PCR(AP-PCR)、重復片段PCR分型、多位點序列分型(MLST)等，其中PFGE是分子分型技術的“金標準”，其結果重復性好，分辨率高，易于標準化，被國內外研究者廣泛接受。本文就PFGE技術及其在細菌感染性疾病中的應用進行綜述。

1 原理

1984年,美國科學家Schwartz等[1]發(fā)明了PFGE技術，該技術是用合適的限制性核酸內切酶對整個細菌的全基因組DNA進行消化，產生數(shù)量有限(一般5～20個)長度不等的DNA片段，在普通瓊脂糖凝膠中電泳分離。DNA片段超過一定大小時，DNA雙螺旋的半徑超過凝膠的孔徑，在普通瓊脂糖中的電泳速度達到極限，此時不能按照分子大小分離DNA分子。但大片段DNA分子可在不斷變化的脈沖電場中進行電泳，不斷重新定向，在凝膠中分離開，通過比較DNA分子的電泳條帶圖譜，判斷細菌型別。PFGE技術是對細菌的全基因組DNA進行原位酶切，可以反映細菌的整個基因情況，包括基因組的微小變化，如酶切位點的突變、基因序列的丟失或插入造成的條帶改變等，對細菌的遺傳特征研究有重要意義。

2 結果判斷

(1)PFGE圖譜條帶大小和數(shù)量相同為同一型別；(2)2～3個條帶出現(xiàn)差異的為親緣關系密切；(3)4～6個條帶差異者為可能相關；(4)7個或以上條帶不同為無親緣關系[2]。圖譜常用BioNumerics軟件進行分析，結果用百分率表示，由于細菌之間有變異性，在圖譜分析中相似值在85%以上的菌株認為流行病學相關。

3 主要影響因素

(1)緩沖液溫度：溫度升高，電泳速度加快，電泳時間縮短，條帶的分辨率下降；溫度較低時條帶的分辨率提高，電泳時間延長，溫度一般設置在14 ℃。(2)脈沖角度：降低脈沖角度，DNA電泳速度加快，條帶的分辨率高。因此，大片段DNA分子電泳時，減小脈沖角度可以提高電泳速度和條帶的分辨率，但分子量小的DNA分子電泳時若采用較小的脈沖角度，條帶會被壓縮，脈沖角度一般選擇120°。(3)脈沖時間：若DNA分子變換方向的時間小于脈沖周期，DNA分子可根據(jù)分子量大小分離開。DNA分子越大，重排需要的時間越長，脈沖時間越長；DNA越小，重排需要的時間越短，需要的脈沖時間越短。(4)電泳時間：由DNA片段的遷移率決定，同時受脈沖角度、脈沖時間、電壓梯度等影響，需在保證條帶分辨率的前提下，優(yōu)化電泳時間。

4 應用

4.1 研究菌株間的遺傳差異 Xie等[3]收集21株來自腹瀉患者的沙門菌株，發(fā)現(xiàn)3株來自上海和4株來自南京的H2S實驗陰性沙門菌PFGE分型圖譜有96%的相似度，說明H2S實驗陰性的沙門菌可能存在跨地區(qū)的傳播。Ciofi等[4]對來自25例患者的多重耐藥銅綠假單胞菌進行PFGE分型，共分為5型即A—E型，其中21株為A型，A型可分為6個亞型(A1—A6型)，A1型為主要型別，各亞型之間的相似度≥95%，9株A1型菌株分離自2011年3月—2012年1月，6株A4型菌株分離自2012年3—9月，B—E型均為散發(fā)的菌株。潘偉光等[5]收集3株金黃色葡萄球菌，1株分離自臍炎新生兒的臍分泌物，另2株分離自該新生兒健康母親左右兩側乳房分泌的乳汁，進行PFGE基因分型，發(fā)現(xiàn)3株菌的圖譜相似度為100%，推測金黃色葡萄球菌在母嬰間傳播的可能性大。近年來，耐碳青霉烯類藥物的肺炎克雷伯菌不斷增多，2013年Ma等[6]在臺灣首次分離到4株攜帶OXA-48基因的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌，PFGE分型分為3型，其中2株菌屬于同一型，有流行病學關系，與其余2株菌無相關性。Zhao等[7]收集24株多重耐藥肺炎克雷伯菌，發(fā)現(xiàn)所有菌株β-內酰胺酶基因KPC-2均為陽性，同時攜帶2～3種超廣譜β-內酰胺酶基因， PFGE分為13型，其中分離自血液科患者(患急性白血病和高血壓)的39號菌與來自重癥監(jiān)護病房(ICU)患者的35號菌均屬于G型，此兩例患者曾同期在ICU進行治療，可能ICU是病原菌傳播的重要場所，病菌通過患者傳播到其他病房，在患者抵抗力低下時造成感染，甚至導致死亡。因此，PFGE技術對常見細菌進行分型，結合菌株臨床資料分析菌株間的遺傳關系，有利于進一步分析菌株間的傳播和擴散情況。

4.2 對疑似暴發(fā)或已確認疫情進行傳染源追蹤 可利用PFGE技術對疑似暴發(fā)或已經確定的暴發(fā)疫情進行分析，尋找傳染源，控制感染，防止疫情的進一步擴散。新生兒重癥監(jiān)護病房暴發(fā)了無乳鏈球菌引起的感染，Al-Maani 等[8]收集相關臨床菌株并對病房環(huán)境進行采樣，同一病房分離的3株臨床菌株和其中一例患者的監(jiān)控儀按鈕中分離的菌株相同，通過PFGE分型發(fā)現(xiàn)4株菌屬于同一型別，可能原因為監(jiān)控儀按鈕被污染后保潔人員未進行合適的清潔，醫(yī)務人員在治療過程中使用監(jiān)護器，未執(zhí)行正確手衛(wèi)生便進行臨床護理；采取相應措施后未出現(xiàn)新發(fā)病例。Seara等[9]在西班牙發(fā)現(xiàn)7株NDM-7陽性的肺炎克雷伯菌，除粘菌素和磷霉素外對其余抗菌藥物幾乎全部耐藥，PFGE分型為同一型且屬于ST437型，7株菌來自3所醫(yī)院，其中3株來自一所醫(yī)院同一個病房，在此病房的水槽、淋浴裝置中均檢測到肺炎克雷伯菌，另外2所醫(yī)院有2例患者曾在該院住院，可能高齡或患有慢性疾病患者的頻繁轉院，以及菌株在環(huán)境中長期存在，導致了NDM-7陽性肺炎克雷伯菌的暴發(fā)流行，通過環(huán)境干預感染得到控制。2013年6月韓國一所學校暴發(fā)了腸黏附性大腸埃希菌(EAEC型)相關的食物中毒，有54例患胃腸炎，對其中22例患者和4名無癥狀廚師的糞便標本分離的大腸埃希菌進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)PFGE分型相同，可能是廚師污染了食物引起感染的暴發(fā)[10]。同年，某醫(yī)院暴發(fā)一起由洋蔥伯克霍爾德菌引起的感染，產科連續(xù)出現(xiàn)剖宮產產婦的手術切口感染，實驗室檢測均確認為洋蔥伯克霍爾德菌,且在B超探頭、三維彩超探頭、普通型醫(yī)用超聲耦合劑中檢出PFGE分型相同的洋蔥伯克霍爾德菌，可能是洋蔥伯克霍爾德菌污染了超聲耦合劑，通過直接接觸污染了B超探頭及產婦，同時產婦術前消毒不徹底導致感染的發(fā)生[11]。某院同一天上午3例患者先后做白內障手術，術后眼睛均感染銅綠假單胞菌，賈磊等[12]對可能引起感染的環(huán)境物體表面、醫(yī)療器械、藥物以及洗手用水等進行采樣和細菌培養(yǎng)，利用PFGE技術對從患者和環(huán)境中分離的菌株進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)3例患者分離的銅綠假單胞菌和3處洗手用水分離的菌株分型相同，患者感染的細菌來源于洗手用水。2012年美國發(fā)生一起由李斯特菌引起的感染暴發(fā)事件，發(fā)現(xiàn)是使用某品牌的奶酪引起，對與該品牌奶酪生產相關6個廠家進行環(huán)境采樣，有3家檢測到同種菌，且細菌的PFGE分型相似度為100%[13]。韓國一所學校一周內5名學生出現(xiàn)腹瀉，3名學生的直腸拭子中分離到志賀菌，同時從其室友(無臨床癥狀)的直腸拭子也分離到志賀菌，且PFGE分型相同，研究發(fā)現(xiàn)，5株志賀菌均攜帶超廣譜β-內酰胺酶基因CTX-M-15，該基因位于質粒IncI1上，可通過接合實驗傳遞給大腸埃希菌J53，耐藥質粒在細菌間轉移可能是導致此次感染暴發(fā)的原因[14]。綜上所述，在疑似暴發(fā)或感染暴發(fā)時，可以收集相關菌株，同時對環(huán)境或各個環(huán)節(jié)進行多次采樣和培養(yǎng)，采用PFGE技術研究菌株的同源性，結合菌株的資料分析，可以鑒定是否為暴發(fā)，暴發(fā)時有利于發(fā)現(xiàn)傳染源，對控制感染暴發(fā)的進一步擴大，降低損失有重要意義。

4.3 進行分子流行病學調查研究 Cui等[15]利用PFGE對來自新疆、云南、上海的40株1b型福氏志賀菌進行分型，按82%的相似度分為5型，新疆的菌株分為A、D、E型，云南和上海的菌株分別為B和C型，不同地區(qū)的菌株分型不同，同一地區(qū)藥敏結果相似的菌株可分為不同亞型。Wu等[16]收集了深圳市人民醫(yī)院2002—2009年231株攜帶碳青霉烯酶基因的鮑曼不動桿菌，利用PFGE可分為14型，其中A、J、H型為主要型別，分別占43.3%、 42.0%和8.2%，2008年之前主要以A型為主(OXA-58基因陽性)，2007—2008年以H型(ST 229，OXA-23基因陽性)為主,2009年以J型(ST 381，OXA-23基因陽性)為主。Chen等[17]調查中山大學社區(qū)居民和醫(yī)務工作者鼻咽部金黃色葡萄球菌定植情況，從589份標本中分離出138株金黃色葡萄球菌，其中4株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),用PFGE對其中129菌進行分型，共分為23型，其中A、N、E、L、O型為主要型別，4株MRSA屬于不同型別。2010年越南南部暴發(fā)了霍亂弧菌感染，Nguyen等[18]將與暴發(fā)有關的34株菌(來自23例患者，5例接觸者及6株環(huán)境分離菌株)和1999—2004年該地區(qū)暴發(fā)的18株霍亂弧菌菌株進行PFGE分型，發(fā)現(xiàn)兩次暴發(fā)菌株分型不同，說明兩次暴發(fā)不相關。因此，PFGE技術可以對一段時間特定范圍收集的菌株進行同源性分析，結合相關資料研究菌株的時間和地域分布。

4.4 為患者臨床診斷提供實驗室依據(jù) 王亞娟等[19]在不同時間內留取一例患兒血培養(yǎng)的2株人葡萄球菌，PFGE分型一致，明確此患兒為新生兒敗血癥，同時另一例患兒血培養(yǎng)的2株表皮葡萄球菌PFGE分型不同，可以協(xié)助臨床排除敗血癥。

5 不足之處

在細菌感染性疾病中PFGE在分子分型方面有很多優(yōu)點，可研究不同菌株的遺傳關系和傳播關系，對研究細菌的流行病學特征有重要作用，但其也有一些不足之處及需要改進的地方，如PFGE儀器及數(shù)據(jù)分析軟件價格昂貴，一般實驗室難以開展；整個過程耗時長，通常需要2～3 d，分離大片段DNA時可能需要更長的時間；操作者需要較高的技術水平，電泳條件的很小改變就可能影響圖譜中條帶的位置，不同實驗室之間難以標準化；菌株分離后應盡快進行PFGE實驗，防止DNA重排影響結果，實驗中需挑取多個菌落，單一菌落的代表性差[20]；分析條帶的數(shù)目和大小，但相同大小的條帶DNA序列不一定相同，可能兩株菌PFGE圖譜相同，但DNA序列不同；酶切位點變化時可能引起不止一個條帶的變化，當一種限制性內切酶分辨率不佳時可同時采用2種或以上限制性內切酶進行分析[21-22], 與其他常用分型方法比較見表1。

表1 幾種常用細菌分型方法的比較

綜上所述，PFGE技術是分子分型技術的“金標準”，PFGE圖譜分析時需與流行病學資料結合進行分析，同時可與其他方法，如MLST結合對細菌進行分型，研究暴發(fā)菌株是如何擴散的，以及各細菌群隨時間的變化。基于BioNumerics的數(shù)據(jù)分析和監(jiān)測數(shù)據(jù)庫，2004年我國成立了細菌性傳染病分子分型實驗室監(jiān)測網絡(PulseNet China)，其采用標準化的細菌分子分型技術，通過各地的網絡實驗室建立網絡平臺及時交流數(shù)據(jù)進行病原菌的分型監(jiān)測，在細菌感染性疾病暴發(fā)流行的識別、預警中發(fā)揮很大作用。隨著系統(tǒng)的完善和各種病原菌PFGE標準化操作規(guī)程及數(shù)據(jù)庫的建立，PFGE技術將會應用更加廣泛。

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(本文編輯：左雙燕)

2016-12-14

湖南省科技計劃項目(2012SK3200)

豆清婭(1987-)，女(漢族)，河南省漯河市人，初級檢驗技師，主要從事細菌耐藥機制研究。

吳安華 E-mail:dr_wuanhua@sina.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.07.023

R446

A

1671-9638(2017)07-0683-04