青鳉prdm14的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及其應(yīng)用

李玲玉 方 健 于 淼 陳天圣

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

青鳉prdm14的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及其應(yīng)用

李玲玉 方 健 于 淼 陳天圣

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

青鳉(Oryzias latipes)是研究遺傳發(fā)育和細(xì)胞多能性的重要模式魚類, 為探究prdm14同源基因的潛在作用, 實(shí)驗(yàn)將青鳉prmd14經(jīng)原核表達(dá)后制備了兔抗Prdm14多克隆抗體。首先, 將prdm14基因的部分編碼區(qū)連接到pET32a質(zhì)粒中, 構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-prdm14?600。隨后將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 經(jīng)異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)誘導(dǎo)表達(dá), 獲得分子量為60 kD的Prdm14重組蛋白。接著大量誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并切膠純化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后獲得陽(yáng)性抗體, 最后通過ELISA和Western blot檢測(cè)抗體效價(jià)及其特異性。結(jié)果顯示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)3h的條件下, 可獲得Prdm14重組蛋白的高效表達(dá); 制備的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗體能夠特異性識(shí)別青鳉組織中表達(dá)的Prdm14蛋白以及在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。綜上所述, 研究首次制備了一種能有效識(shí)別青鳉Prdm14的多克隆抗體, 該抗體的獲得為后續(xù)研究prdm14基因在魚類多能性干細(xì)胞中的作用提供了有力工具。

青鳉; Prdm14; 原核表達(dá); 多克隆抗體; 干細(xì)胞

細(xì)胞的多能性調(diào)控和分化的分子機(jī)制是干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要問題。研究表明PRDM家族成員參與了細(xì)胞早期的分化, 它們能通過組蛋白酶的激活或者相互作用來調(diào)控目的基因的表達(dá), 從而參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和染色體的表觀修飾過程[1,2]。作為PRDM家族中重要的一員, PRDM14包含一個(gè)PR/SET結(jié)構(gòu)域和6個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。人類PRDM14在胚胎干細(xì)胞中表達(dá), 能直接靶向干細(xì)胞因子OCT4的近端增強(qiáng)子從而調(diào)控OCT4的表達(dá), 同時(shí)能與干細(xì)胞中一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG、SOX2、KLF4等結(jié)合, 激活細(xì)胞多能性基因同時(shí)抑制細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá), 是干細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心因子, 在胚胎干細(xì)胞多能性狀態(tài)的維持, 體細(xì)胞潛在全能性的重新獲得及表觀遺傳學(xué)重編程中具有重要作用[3—6]。在小鼠中, prdm14在胚胎干細(xì)胞中具有相似的功能[7,8], 同時(shí)它也在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)并對(duì)生殖細(xì)胞的特化和發(fā)育有至關(guān)重要的影響[9], 實(shí)驗(yàn)表明prdm14缺失小鼠雌性和雄性均不育[10,11]。PRDM14也是一個(gè)重要的原癌基因, 在許多癌細(xì)胞中高度表達(dá), 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并降低其對(duì)化療藥物的敏感性[12—14], 對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化也具有重要的作用[15]。

作為一個(gè)新近才被發(fā)掘的基因, 相對(duì)于小鼠和人prdm14的諸多研究, 其他物種的同源基因被鑒定的較少, 目前魚類中僅斑馬魚(Danio rerio)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的同源基因有過報(bào)道[16,17]。序列分析表明prdm14基因在結(jié)構(gòu)域的區(qū)段具有較高的保守性, 斑馬魚和牙鲆prdm14的結(jié)構(gòu)域和小鼠的同源性均可達(dá)到68%[16,17]。但是目前對(duì)魚類prdm14同源基因的研究數(shù)據(jù)有限, 它是否具有干細(xì)胞多能性的維持和生殖細(xì)胞的特化等功能還有待深入研究。

模式魚類青鳉(Oryzias latipes)具有生殖周期短, 易室內(nèi)飼養(yǎng), 胚胎發(fā)育過程易觀察, 遺傳背景多樣, 基因組信息完善等優(yōu)點(diǎn)[18], 是研究基因功能及魚類遺傳育種的重要材料[19—21]。目前青鳉的胚胎干細(xì)胞[22]、單倍體干細(xì)胞[23]、生殖干細(xì)胞[24]均已獲得, 它是除小鼠之外研究干細(xì)胞和生殖細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的理想模式生物。由于在高等動(dòng)物中prdm14是干細(xì)胞多能性網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)重要調(diào)控因子, 因此青鳉的prdm14基因也可能參與了細(xì)胞多能性的調(diào)控和生殖細(xì)胞的特化等過程, 這有待進(jìn)一步的分析和驗(yàn)證。前期我們已經(jīng)鑒定了青鳉的prdm14基因(結(jié)果另文發(fā)表), 本實(shí)驗(yàn)制備了特異性的兔抗青鳉源Prdm14多克隆抗體, 該抗體能有效地檢測(cè)內(nèi)源的和過表達(dá)的青鳉Prdm14蛋白。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司; 質(zhì)粒pIRES-DsRed、pET32a、pCAG-EGFP均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建或保存; 野生型青鳉從中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所獲得; 人肝癌細(xì)胞系HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 Prdm14原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)中青鳉prdm14基因的序列(ENSORLG 00000008105)設(shè)計(jì)引物F1(5′-AAAGAATTCATGT GGCTGTCCCTCTCCTGCTC-3′)和R1582(5′-AAACCGCGGTTAATTCCAGGGTCGATATT CAGAATT-3′), 以青鳉卵巢的cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增得到prdm14全長(zhǎng)編碼序列(1761 bp), 并構(gòu)建真核表達(dá)載體pPrdm14-IRES。將pET32a載體及pPrdm14-IRES質(zhì)粒分別取1 μg用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ (NEB, 美國(guó))雙酶切, 所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切取prdm14目的片段以及pET32a骨架質(zhì)粒進(jìn)行膠回收, 再用T4 DNA連接酶(NEB, 美國(guó))進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α, 挑取克隆后用Omega (美國(guó))質(zhì)粒提取試劑盒提質(zhì)粒, 并用HindⅢ、NotⅠ和EcoRⅤ, PmlⅠ和EcoRⅠ分別酶切鑒定。經(jīng)驗(yàn)證的pET32a-prdm14質(zhì)粒取1 μg, 酶切去除兩個(gè)SacⅠ位點(diǎn)之間的600 bp序列, 切膠回收剩余片段, 再通過DNA連接酶環(huán)化,得到包含部分prdm14 CDS (1161 bp)的原核表達(dá)載體pET32a-prdm14?600。最后用擴(kuò)增CDS全長(zhǎng)的引物F1和R1582以1 ng質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證, 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸2min, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10min。

1.3 誘導(dǎo)Prdm14原核表達(dá)

將pET32a-prdm14及pET32a-prdm14?600質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Rosetta (DE3)菌中, 涂含Amp (100 μg/mL)的抗性平板, 挑取單克隆至3 mL LB培養(yǎng)液, 于37℃下200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12h, 再按1‰、2‰、3‰、5‰、7‰和10‰體積分別轉(zhuǎn)入含有2 mL LB培養(yǎng)液的搖菌管中, 37℃培養(yǎng)2h后加入0.6 mmol/L異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)誘導(dǎo), 同時(shí)以未誘導(dǎo)組及轉(zhuǎn)入pET32a空載體組為對(duì)照。誘導(dǎo)3h后取1 mL菌液離心沉淀, 加入80 μL Tris-EDTA以及20 μL SDS蛋白上樣緩沖液煮沸10min, 1000 r/min離心5min后取上清進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 康為世紀(jì)), 最后用考馬斯亮藍(lán)染色并觀察菌體蛋白表達(dá)情況。

1.4 融合蛋白純化及抗體制備

將Prdm14融合蛋白條帶從膠上切下, 放入液氮中充分研磨, 加入等體積的PBS緩沖液混勻至乳膠狀態(tài)。取1只家兔, 腹部多點(diǎn)皮下注射抗原200 μg。每隔2周時(shí)間, 按照以上步驟進(jìn)行加強(qiáng)免疫注射, 共免疫注射3次; 另取1只家兔不做任何處理, 作為陰性對(duì)照。第3次免疫后7d, 對(duì)家兔進(jìn)行頸動(dòng)脈采血。將離心管中的血液室溫靜置2h后, 再置4℃冰箱內(nèi)過夜。待血液凝固血塊收縮后, 2500 r/min離心30min, 取上清分裝于干凈的離心管中, –20℃保存, 同時(shí)取部分抗血清經(jīng)抗原親和純化抗體, 再經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。實(shí)驗(yàn)中抗體的免疫制備過程由上海佑隆生物有限公司完成。

1.5 Prdm14: EGFP融合表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證抗體的特異性, 我們構(gòu)建了融合EGFP的表達(dá)系統(tǒng)。設(shè)計(jì)引物fusion-F (5′-CATC ATTTTGGCAAAGAATTCATGTCGGTGTC CCTCTCCTG-3′)、fusion-R (5′-GCTCACCATGG TGGCGAATTCATTCCAGGGTCGATATTCAG-3′), 去除prdm14基因的TAA終止密碼子以便將基因閱讀框融合到EGFP蛋白中, 并在連接處各設(shè)計(jì)1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。以pPrdm14-IRES質(zhì)粒為模板擴(kuò)增prdm14 基因CDS, 同時(shí)將pCAG-EGFP載體用EcoRⅠ酶切, PCR產(chǎn)物及線性化質(zhì)粒通過1%瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收后用一步法In-Fusion PCR擴(kuò)增試劑盒(Vazyme, 南京)融合, 構(gòu)建Prdm14: EGFP融合表達(dá)載體, 最后再用EcoRⅠ單酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)后, 大量提取質(zhì)粒以備后用。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將HepG2細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于六孔板中,培養(yǎng)條件: DMEM(Hyclone, 美國(guó))培養(yǎng)液, 含10%已滅活胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, 四季青, 杭州)及100 kU/L青霉素和100 kU/L鏈霉素; 37℃, 5%CO2。培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)液為不含血清的DMEM以提高轉(zhuǎn)染效率, 然后用LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美國(guó))轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 每孔加入6 μL轉(zhuǎn)染試劑及2 μg去除內(nèi)毒素的pCAG-prdm14EGFP質(zhì)粒, 對(duì)照組加入pCAG-EGFP空載體; 處理3h后, 再次更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng); 48h后在倒置熒光顯微鏡(Ti-S, Nikon)下觀察并拍照。

1.7 動(dòng)物組織及細(xì)胞總蛋白提取

分別取性成熟青鳉精巢(Testis)、卵巢(Ovary)、腦(Brain)組織各0.5 g, 以及上述轉(zhuǎn)染后2種細(xì)胞各1×107個(gè), 用動(dòng)物組織或細(xì)胞蛋白提取試劑盒(生工,上海)提取總蛋白, 經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì), 北京)測(cè)定蛋白濃度, 最后加入1/4體積SDS上樣緩沖液, 煮沸10min, 于1000 r/min離心5min, 取上清液置–20℃保存待用。

1.8 Western blot檢測(cè)

將菌體蛋白或組織及細(xì)胞蛋白經(jīng)10% SDSPAGE電泳后, 置半干電轉(zhuǎn)儀(Bio-Red, 美國(guó))中18 V電壓轉(zhuǎn)膜25min, 5%脫脂奶粉封閉過夜; 再加入制備的兔多抗αPrdm14 (1鯰1000)或其他一抗(αHis, 1鯰1500; αβ-Actin, 1鯰1200; αGFP, 1鯰1000, Vazyme)置3D搖床上孵育2h (室溫)或4℃過夜; 用Tris-HCl吐溫緩沖溶液(TBS+0.1% Tween, TBST)洗膜6次, 每次10min; 隨后用辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1鯰10000)或鼠二抗(1鯰10000)室溫孵育1h; 再經(jīng)TBST洗膜3次, 每次10min; 最后用ECL發(fā)光試劑盒(Thermo, 美國(guó))顯色并用GE化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)成像觀察。

2 結(jié)果

2.1 原核重組載體構(gòu)建

如圖 1A所示。通過酶切pPrdm14-IRES質(zhì)粒得到含prdm14全長(zhǎng)編碼序列(1761 bp)的片段, 并將該片段插入pET-32a載體(圖 1B), 構(gòu)建重組載體pET32a-prdm14。質(zhì)粒分別經(jīng)HindⅢ、NotⅠ和EcoRⅤ, PmlⅠ和EcoRⅠ酶切, 分別得到預(yù)期大小的片段。構(gòu)建的載體經(jīng)測(cè)序分析, 確認(rèn)插入片段序列無(wú)移碼突變。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最為常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng), 但是在實(shí)踐過程中外源重組蛋白極易形成沒有生物活性的包涵體[25], 而且復(fù)雜的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)效率降低, 因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)較短的重組蛋白載體pET32a-prdm14?600, 以獲得足量高純度的目的蛋白, 該重組蛋白包含Prdm14的N端及PR結(jié)構(gòu)域, 并能翻譯386個(gè)氨基酸殘基。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了pET32a-prdm14和pET32a-prdm14?600質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組載體結(jié)構(gòu)如圖 1B所示, pET32a-prdm14載體包含prdm14 CDS全長(zhǎng), 含8個(gè)外顯子共1761 bp; pET32a-prdm14?600載體中刪除了prdm14 CDS第4個(gè)外顯子后部至第7個(gè)外顯子之間的600 bp。

2.2 誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)、純化及抗體制備

圖 1 prdm14基因原核表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of prdm14 prokaryotic expression vector

轉(zhuǎn)入pET32a-prdm14載體的細(xì)菌在IPTG誘導(dǎo)后, 經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯現(xiàn)1條83 kD的特異性條帶, 轉(zhuǎn)入pET32a-prdm14?600載體的細(xì)菌則誘導(dǎo)出1條約60 kD的條帶, 均與預(yù)期目的條帶大小一致。同時(shí), 未加IPTG誘導(dǎo)的菌和空載體對(duì)照組沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶。因此, 確認(rèn)Prdm14融合蛋白在Rosetta (DE3)中正確表達(dá)。不同接種濃度的誘導(dǎo)結(jié)果均顯示表達(dá)Prdm14全長(zhǎng)的菌體產(chǎn)生融合蛋白的量明顯比短片段的低, 且按5‰比例接種時(shí)表達(dá)量最高。大量誘導(dǎo)Prdm14?600重組蛋白后切膠純化, 共得到5 mg純化蛋白, 純度>95 %, 滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

免疫家兔6周后獲得多克隆抗體, 經(jīng)ELISA檢測(cè)效價(jià)為1鯰243000, 陽(yáng)性判定點(diǎn)為OD陽(yáng)/OD陰>2.5。

2.3 多克隆抗體特異性檢測(cè)

以轉(zhuǎn)入pET32a載體的細(xì)菌為空白對(duì)照, αHis (1鯰1500)為陽(yáng)性對(duì)照, Western blot結(jié)果顯示, 青鳉Prdm14多克隆抗體(1鯰1000)能夠特異性識(shí)別Prdm14及Prdm14?600重組蛋白(圖 2A)。對(duì)表達(dá)Prdm14?600重組蛋白的細(xì)菌裂解物進(jìn)行10、100、1000和10000倍稀釋, 經(jīng)Western blot檢測(cè), 結(jié)果表明在1鯰1000稀釋的抗體條件下, 該多克隆抗體可識(shí)別1000倍稀釋的Prdm14?600重組蛋白(圖 2B)。此外,青鳉精巢、卵巢、腦蛋白樣品的Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示單一的64 kD條帶, 與青鳉內(nèi)源的Prdm14蛋白大小一致, 而且采用免疫前血清作為一抗時(shí)未出現(xiàn)任何條帶(圖 2C)。以上結(jié)果均證明兔抗青鳉多克隆抗體能夠特異性識(shí)別青鳉Prdm14蛋白。

圖 2 多克隆抗體特異性檢測(cè)Fig.2 Examination of the specificity of Prdm14 polyclonal antibody

2.4 多克隆抗體對(duì)過表達(dá)蛋白的檢測(cè)

為進(jìn)一步檢測(cè)抗體是否能特異識(shí)別過表達(dá)的Prdm14蛋白, 我們構(gòu)建了pCAG-prdm14EGFP融合表達(dá)載體。用高保真PCR聚合酶(Vazyme)擴(kuò)增得到的prdm14編碼序列經(jīng)fusion PCR與線性化的pCAG-EGFP質(zhì)粒連接(圖 3A), 構(gòu)建Prdm14與EGFP融合的表達(dá)載體pCAG-prdm14EGFP (圖 3B)。所獲質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切得到約1.8 kb及6.6 kb的片段, 與預(yù)期大小一致, 說明pCAG-prdm14EGFP載體構(gòu)建成功。

圖 3 EGFP及Prdm14融合EGFP表達(dá)載體圖譜Fig.3 Maps of pEGFP and Prdm14: EGFP fusion protein expression vector

在倒置熒光顯微鏡下觀察, 轉(zhuǎn)染pCAG-prdm 14EGFP質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞約30%呈現(xiàn)明亮的綠色(圖 4A、B和C), 表明Prdm14融合EGFP載體構(gòu)建成功且能正常表達(dá)。同時(shí), 轉(zhuǎn)入pCAG-EGFP質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞也有約50%能觀察到綠色熒光(圖 4D、E和F)。后期提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)(圖 5), 同時(shí)以αβ-Actin (1鯰1200)為內(nèi)參(圖 5C)。以αPrdm14為一抗時(shí), 轉(zhuǎn)染pCAG-prdm14EGFP的細(xì)胞出現(xiàn)一條約90 kD的條帶以及一條63 kD的條帶(圖5A), 分別與融合蛋白及人的PRDM14蛋白大小相符, 而對(duì)照組在相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn), 這說明αPrdm14可特異性識(shí)別細(xì)胞中過表達(dá)的青鳉Prdm14鯰EGFP融合蛋白。以αGFP (1鯰1000)為一抗時(shí), 僅有對(duì)照組出現(xiàn)一條約26 kD的條帶(圖 5B), 大小與EGFP蛋白一致。因此, 該多克隆抗體能用于鑒定體外過表達(dá)的青鳉Prdm14蛋白。

3 討論

在人和小鼠中的研究表明, PRDM14是干細(xì)胞多能性維持, 生殖細(xì)胞形成, 體細(xì)胞重編程過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子, 但在斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn)其與初級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)有關(guān)[16], 是否在細(xì)胞的多能性調(diào)控中有重要作用尚不得而知, 而且魚類干細(xì)胞的多能性調(diào)控分子機(jī)理目前鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以模式魚類青鳉為對(duì)象, 開展青鳉Prdm14原核表達(dá)的研究并制備兔抗青鳉多克隆抗體, 為進(jìn)一步研究prdm14基因的功能奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含基因全長(zhǎng)的重組質(zhì)粒和含較短基因片段的重組質(zhì)粒, 并誘導(dǎo)得到高效表達(dá)的重組蛋白。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源重組蛋白由于缺乏所需要的酶和輔助因子, 溫度、培養(yǎng)基等的影響,或蛋白質(zhì)合成太快不能正確的折疊而容易形成包涵體。包涵體具有高密度, 易于分離純化的優(yōu)點(diǎn),但是不具有生物學(xué)活性[26]。過大的目的蛋白分子量會(huì)使得其難以誘導(dǎo)表達(dá), 或表達(dá)效率降低, 更容易形成包涵體, 而且抗原過大時(shí)免疫所產(chǎn)生的抗體特異性不佳。因此本實(shí)驗(yàn)最終采用小片段的蛋白進(jìn)行免疫并獲得抗體。由短片段得到的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗體能特異性識(shí)別Prdm14重組蛋白(83 kD)及Prdm14?600重組蛋白(60 kD)。

圖 4 pCAG-prdm14EGFP載體在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Expression of pCAG-prdm14EGFP vector in HepG2

研究表明prdm14在小鼠原始生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)[10,27], 而且斑馬魚prdm14在神經(jīng)系統(tǒng)中有表達(dá)[16]。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)青鳉精巢、卵巢、腦組織總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè), 結(jié)果均出現(xiàn)一條64 kD條帶, 與預(yù)期的青鳉Prdm14蛋白大小一致, 說明制備的多克隆抗體能特異性識(shí)別魚體中表達(dá)的Prdm14蛋白, 同時(shí)證明Prdm14在青鳉性腺和腦中都有表達(dá), 與我們所檢測(cè)的其RNA的表達(dá)結(jié)果一致(結(jié)果另文發(fā)表)。

圖 5 Prdm14: EGFP融合蛋白在HepG2細(xì)胞中的檢測(cè)Fig.5 Western blot analysis of Prdm14: EGFP fusion protein in HepG2

在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCAG-prdm14EGFP融合表達(dá)載體及pCAG-EGFP空載體時(shí), 細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光。與對(duì)照組EGFP蛋白廣泛表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中不同的是, 融合蛋白主要被定位在細(xì)胞核中, 這與人類PRDM14作為轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞核定位的特性一致。以αPrdm14為一抗對(duì)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí), 實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)約90和63 kD的條帶, 分別與Prdm14鯰EGFP融合蛋白和人源PRDM14蛋白大小一致, 這說明該抗體可以用來鑒定體外表達(dá)的Prdm14蛋白。值的一提的是, 63 kD條帶的出現(xiàn), 可能是由于HepG2細(xì)胞內(nèi)源人屬PRDM14活化上調(diào)而被檢測(cè)到, 但其中的機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。此外, 在顯微鏡下能觀察到細(xì)胞核中表達(dá)的融合蛋白的熒光, 但是以GFP抗體進(jìn)行蛋白雜交時(shí)卻不能檢測(cè)到預(yù)期的融合蛋白的條帶, 僅在對(duì)照組檢測(cè)到26 kD的EGFP蛋白。在其他試驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)當(dāng)目的基因在EGFP的N端進(jìn)行融合表達(dá)時(shí), GFP抗體經(jīng)常不能檢測(cè)到EGFP融合片段, 而當(dāng)目的基因在C端融合時(shí)卻能被檢測(cè)到?；赟DSPAGE是蛋白變性后的電泳結(jié)果, 理論上不論N端或C端的融合, EGFP抗體都應(yīng)該能檢測(cè)到融合蛋白, 因此N端融合不能被檢測(cè)的原因尚有待研究。

綜上所述, 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了青鳉Prdm14原核表達(dá)載體, 誘導(dǎo)表達(dá)并純化了重組蛋白, 制備了兔抗青鳉源Prdm14多克隆抗體, 并應(yīng)用該抗體識(shí)別了內(nèi)源的Prdm14蛋白和細(xì)胞中過表達(dá)的Prdm14鯰EGFP融合蛋白。該特異性抗體的獲得為下一步闡明青鳉prdm14基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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PROKARYOTIC EXPRESSION, PREPARATION AND APPLICATION OF ANTIPRDM14 POLYCLONAL ANTIBODY OF MEDAKA (ORYZIAS LATIPES) PRDM14

LI Ling-Yu, FANG Jian, YU Miao and CHEN Tian-Sheng
(Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

PRDM14, a member of PRDM family, plays an important role in germ cells and the maintenance of pluripotency in embryonic stem (ES) cells in mice and humans, but its functions in other species are largely unknown.Medaka (Oryzias latipes) is an excellent fish model to study the developmental biology and stem cell pluripotency.In order to study the potential function of medaka prdm14, the recombinant medaka Prdm14 protein was expressed and used to generate the rabbit anti-Prdm14 polyclonal antibody.First, the recombinant expression vector pET32a-prdm14?600was constructed by inserting a part of prdm14 CDS into pET32a vector.Second, the vector was transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3) and the protein (60 kD) was induced by isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG).Third, the protein was purified and used as the antigen to immunize rabbit (Oryctolagus cuniculus).Last, six weeks after injection, the antiserum was collected, and the antibody titer and specificity were detected by ELISA and Western blot.The results showed the recombinant Prdm14 could be highly induced at 37℃ with 0.6 mmol/L IPTG for 3h.The polyclonal anti-Prdm14 antibody reacted specifically with Prdm14 in medaka adult tissues or Prdm14: EGFP fusion protein ectopically expressed in HepG2.In conclusion, we generated a polyclonal antibody for medaka Prdm14, which provides a powerful tool to analyze the underlying function of prdm14 in fish stem cells.

Medaka (Oryzias latipes); Prdm14; Prokaryotic expression; Polyclonal antibody; Stem cells

Q786

A

1000-3207(2017)04-0748-07

10.7541/2017.93

2016-08-03;

2016-11-23

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2013CB967700); 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金(2013RC014和2662015PY049)資助 [Supported by the State Key Development Program for Basic Research of China (2013CB967700); the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2013RC014, 2662015PY049)]

李玲玉(1991—), 女, 河南信陽(yáng)人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)轸~類遺傳育種及干細(xì)胞。E-mail: lilingyu@webmail.hzau.edu.cn

陳天圣, 教授; E-mail: tiansheng.chen@mail.hzau.edu.cn