維生素E對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能、抗氧化性能及抗氨氮脅迫能力的影響

孔有琴 丁志麗 張易祥 羅 娜,2 葉金云*

(1.浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州313000；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，大連116000)

維生素E對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能、抗氧化性能及抗氨氮脅迫能力的影響

孔有琴1丁志麗1張易祥1羅 娜1,2葉金云1*

(1.浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖州313000；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，大連116000)

本試驗(yàn)旨在研究飼料中維生素E水平對(duì)日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)幼蝦生長(zhǎng)性能、抗氧化性能和抗氨氮脅迫能力的影響。選擇健壯、平均初始體重為(0.119±0.004) g的900只日本沼蝦幼蝦，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只。以維生素E乙酯為添加形式，配制6組維生素E實(shí)際含量分別為18.31、37.94、66.07、120.25、212.68和388.96 mg/kg的半純化飼料(分別記為VE1、VE2、VE3、VE4、VE5和VE6組)，飼喂8周，隨后進(jìn)行24 h氨氮脅迫試驗(yàn)。結(jié)果顯示：1)各組日本沼蝦成活率(SR)無(wú)顯著差異(P>0.05)；隨飼料維生素E水平的增加，日本沼蝦增重率(WGR)呈先增加后下降的變化趨勢(shì)，VE4組最高，且顯著高于VE1組(P<0.05)；飼料系數(shù)(FCR)變化趨勢(shì)則與WGR相反，VE4組最低，且顯著低于VE1組(P<0.05)。2)氨氮脅迫前，各組日本沼蝦肝胰腺中丙二醛(MDA)含量隨飼料維生素E水平的增加呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，在VE3組達(dá)到最低，且顯著低于VE1、VE5和VE6組(P<0.05)；各組日本沼蝦肝胰腺總超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力和總抗氧化力(T-AOC)隨飼料維生素E水平的增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。VE1和VE6組日本沼蝦硫氧還蛋白(Trx)mRNA表達(dá)量較高，硫氧還蛋白還原酶(TrxR)mRNA表達(dá)量則較低。VE3組熱休克蛋白60(HSP60)mRNA表達(dá)量顯著低于其他各組(P<0.05)，VE1組熱休克同源蛋白70(HSC70) mRNA表達(dá)量顯著低于其他各組(P<0.05)，VE1和VE2組熱休克蛋白90(HSP90)mRNA表達(dá)顯著高于其他各組(P<0.05)。3)氨氮脅迫后，各組日本沼蝦肝胰腺SOD、CAT、GSH-Px活力，MDA含量，Trx、TrxR和HSC70 mRNA表達(dá)量的變化趨勢(shì)與脅迫前相似，HSP60和HSP90 mRNA表達(dá)量變化與脅迫前相反。氨氮脅迫可降低日本沼蝦肝胰腺GSH-Px活力、T-AOC及Trx、TrxRmRNA表達(dá)量，提高M(jìn)DA含量及VE4、VE5和VE6組SOD活力。由此可見(jiàn)，飼料中添加120.25 mg/kg維生素E對(duì)日本沼蝦的生長(zhǎng)具有積極的促進(jìn)作用，飼料中添加66.07、120.25和212.68 mg/kg的維生素E可提高日本沼蝦抗氧化性能和抗氨氮脅迫能力。

日本沼蝦；維生素E；生長(zhǎng)；抗氧化力；氨氮

維生素E(vitamin E)是維持動(dòng)物體正常生長(zhǎng)和生理功能所必需的一種微量營(yíng)養(yǎng)素[1]。生理上，維生素E參與機(jī)體的抗氧化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、生殖發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、抗應(yīng)激等過(guò)程[2-3]。在水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)生理研究中，維生素E的抗氧化和抗應(yīng)激作用一直備受研究者的關(guān)注。如飼料中添加適量的維生素E可顯著提高斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)活力，降低丙二醛(MDA)含量[4]；顯著提高凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力[5]。與此同時(shí)，維生素E對(duì)農(nóng)藥[6-7]、重金屬污染[8]、擁擠應(yīng)激[9]及高脂飼料[10]等產(chǎn)生的脅迫具有有效的保護(hù)作用。

隨著水質(zhì)污染加劇和集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，氨氮成為水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境中最常見(jiàn)的脅迫因子之一。氨氮脅迫可嚴(yán)重影響機(jī)體的生長(zhǎng)、呼吸、抗氧化和免疫等生理功能[11-13]，過(guò)量的氨氮被認(rèn)為是環(huán)境因素導(dǎo)致蝦蟹疾病的重要原因之一[14]。研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)調(diào)控是緩解脅迫的一種簡(jiǎn)單、有效的技術(shù)手段之一[15]。如維生素E可有效緩解氨氮脅迫對(duì)青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)[16]、云紋石斑魚(yú)(Epinehelusmoara)[17]的不利作用。

日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)俗稱河蝦、青蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)、甲殼綱、十足目、長(zhǎng)臂蝦科、沼蝦屬[18]。日本沼蝦因?yàn)槠淇谖鄂r美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，成為中國(guó)、日本和其他東南亞國(guó)家主要淡水養(yǎng)殖品種之一，在我國(guó)的養(yǎng)殖區(qū)主要集中于長(zhǎng)江中下游一帶，比如浙江、江蘇、安徽等省份[19]。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，2015年全國(guó)日本沼蝦的年產(chǎn)量達(dá)到26.5萬(wàn)t，比2014年增長(zhǎng)了2.88%[20]。日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展推動(dòng)了對(duì)其生物學(xué)特性、營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)研究的需求，但目前對(duì)日本沼蝦的營(yíng)養(yǎng)生理的研究還較滯后，現(xiàn)有的研究多集中于蛋白質(zhì)[19-21]、脂類[22]、部分微量元素[23-24]等，關(guān)于維生素E的營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)研究還鮮有報(bào)道。本文擬用含不同維生素E含量的飼料投喂日本沼蝦幼蝦，探討維生素E對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能、抗氧化性能和抗氨氮脅迫能力的影響，以期為該蝦配合飼料的開(kāi)發(fā)和綠色健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用日本沼蝦購(gòu)自于浙江湖州南潯一養(yǎng)殖場(chǎng)，正式試驗(yàn)前先暫養(yǎng)1周，使日本沼蝦適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。而后選擇健壯活潑、平均初始體重為(0.119±0.004) g的900只日本沼蝦幼蝦，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50只。日本沼蝦幼蝦隨機(jī)放入到18只體積為300 L的水槽中進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)，每個(gè)水槽放50只日本沼蝦。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)共持續(xù)8周。

1.2 試驗(yàn)飼料

以酪蛋白和魚(yú)粉作為蛋白質(zhì)源，魚(yú)油和大豆油作為脂肪源，玉米淀粉作為糖源，配制基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加相應(yīng)含量維生素E乙酯(Sigma，美國(guó))到基礎(chǔ)飼料中，配制6組維生素E水平分別為0、25、50、100、200和400 mg/kg的試驗(yàn)飼料(分別記為VE1、VE2、VE3、VE4、VE5和VE6組)。試驗(yàn)飼料按以下方法進(jìn)行制備：首先用粉碎機(jī)將原料粉碎并過(guò)80目篩，然后按需要準(zhǔn)確稱取各種原料，逐級(jí)均勻混合，加入魚(yú)油和豆油再次混勻，同時(shí)添加一定的水?dāng)嚢杌靹?，最后用小型飼料造粒機(jī)制成粒徑為1.5 mm的顆粒飼料，置于40 ℃烘箱烘干至水分含量為10%左右，用自封袋封裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17812—2008的高效液相色譜法測(cè)得各組試驗(yàn)飼料中維生素E實(shí)際含量分別為18.31、37.94、66.07、120.25、212.68和388.96 mg/kg。按照AOAC(1995)[25]標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定飼料常規(guī)成分，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定；粗灰分含量測(cè)定是先于200 ℃碳化樣品至不冒煙，再于550 ℃馬弗爐中灼燒至恒重；水分含量是采用在105 ℃烘干到恒重的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于2015年7—9月于浙江湖州壯大水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)期間連續(xù)充氧保持溶氧濃度>6.5 mg/L。養(yǎng)殖的水質(zhì)條件為：水溫25～30 ℃，總氨氮濃度<0.1 mg/L。養(yǎng)殖期間，每天投喂飼料2次，分別在08:00和16:00投喂。光照為自然光照，養(yǎng)殖水為自然河水。為了保持養(yǎng)殖水質(zhì)，每天吸出日本沼蝦排泄物并換1/3的養(yǎng)殖水量。每只水槽內(nèi)放置一定量的網(wǎng)片作為日本沼蝦的躲避物，以減少沼蝦為爭(zhēng)搶飼料而進(jìn)行互相殘殺。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)無(wú)維生素E的維生素混合物為每千克飼料提供 Vitamin E-free vitamin mix provided the following per kg of the diet：VA 1.0 g，VD30.63 g，VC 14 g，VK31.8 g，VB10.75 g，VB61 g，VB120.15 g，煙酸 nicotinic acid 5 g，核黃素 riboflavin 2.63 g，對(duì)氨基苯甲酸 aminobenzoic acid 5 g，泛酸鈣 calcium pantothenate 5 g，生物素 biotin 0.75 g，葉酸 folic acid 0.19 g，肌醇 inositol 60 g，α-纖維素 α-cellulose 902.1 g。

2)礦物質(zhì)混合物為每千克飼料提供 The mineral mix provided the following per kg of the diet：KCl 0.84 g，MgSO4·7H2O 3 g，NaH2PO46.45 g，KH2PO43 g，Ca(H2PO4)2·H2O 7.95 g，CaCO33.15 g，C6H10CaO6·5H2O 4.95 g，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 0.36 g，ZnSO4·7H2O 0.142 8 g，MnSO4·H2O 0.032 1 g，CuCl2·2H2O 0.070 4 g，Na2SeO30.001 3 g，AlCl3·6H2O 0.004 5 g，CoCl2·6H2O 0.042 g，KI 0.006 9 g。

3)誘食劑組成 Attractant composition：丙氨酸 alanine 0.6%，甘氨酸 glycine 0.6%，谷氨酸 glutamic acid 0.6%，甜菜堿 betaine 1.2%。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，養(yǎng)殖蝦饑餓24 h，計(jì)數(shù)、稱重用于生長(zhǎng)指標(biāo)的分析。采集各組日本沼蝦肝胰腺，-80 ℃保存，用于后續(xù)抗氧化相關(guān)酶指標(biāo)測(cè)定及基因表達(dá)分析。

1.5 氨氮脅迫試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，每組留取60只日本沼蝦(每個(gè)水槽留20只)用于氨氮脅迫試驗(yàn)，脅迫試驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行20只蝦。根據(jù)Wang等[26]試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定氨氮脅迫試驗(yàn)的總氨氮濃度為37 mg/L。脅迫用試劑為氯化銨，先配制10 g/L的氯化銨母液，而后根據(jù)水槽體積將適量母液加入，以調(diào)成所設(shè)定的脅迫濃度(37 mg/L)。水體中氨氮濃度采用納氏試劑法[27]測(cè)定，每隔6 h測(cè)定養(yǎng)殖水體氨氮濃度并用氯化銨母液進(jìn)行調(diào)節(jié)。脅迫24 h后，采集日本沼蝦肝胰腺并于-80 ℃用于后續(xù)的抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定和基因表達(dá)分析。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定

生長(zhǎng)性能相關(guān)指標(biāo)按照以下公式進(jìn)行計(jì)算:

成活率(survival rate，SR，%)=100×試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活的蝦個(gè)數(shù)/試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)放入的蝦個(gè)數(shù)；
增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦均重-試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蝦均重)/試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蝦均重；
飼料系數(shù)(feed conversion rate，F(xiàn)CR)=飼料攝入量/(試驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦均重-試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蝦均重)；
攝食率(feeding rate，F(xiàn)R，%)=100×攝入飼料總量/[試驗(yàn)天數(shù)×(末總重+初總重)/2]。

1.6.2 肝胰腺抗氧化酶活力及MDA含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取肝胰腺0.50～0.70 g于2 mL無(wú)菌離心管中，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，電動(dòng)勻漿10～20 s，制成10%勻漿液。4 ℃、4000 r/min離心10 min，收集上清液(即為待測(cè)液)用于后續(xù)的抗氧化酶活力和MDA含量測(cè)定。測(cè)定時(shí)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。待測(cè)液中蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定?？寡趸富盍蚆DA含量測(cè)定采用相應(yīng)的各商用試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

SOD活力測(cè)定：采用Elstner等[28]的黃嘌呤氧化酶法。通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)生成超氧根離子(O2-·)，而后O2-·會(huì)氧化羥胺生成在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色的亞硝酸鹽。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，SOD會(huì)專一性的抑制O2-的生成，從而減少亞硝酸鹽的產(chǎn)生量。1 mg組織蛋白質(zhì)在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制效率達(dá)到1/2時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量定義為1個(gè)SOD活力單位(U)。

CAT活力測(cè)定：采用Aebi[29]的方法,以過(guò)氧化氫(H2O2)含量的減少來(lái)進(jìn)行測(cè)定。每分鐘還原1 μmol H2O2所需CAT的量定義為1個(gè)CAT活力單位。

GSH-Px活力測(cè)定：通過(guò)分析GSH-Px催化的谷胱甘肽(GSH)與H2O2的反應(yīng)中GSH的減少量來(lái)測(cè)定酶活力[30]。1 mg組織蛋白質(zhì)，去除非酶反應(yīng)的作用，每分鐘使反應(yīng)體系中GSH濃度下降1 μmol/L時(shí)定義為1個(gè)GSH-Px活力單位。

T-AOC測(cè)定：機(jī)體內(nèi)鐵離子在抗氧化物質(zhì)催化下還原生成的亞鐵離子與啡啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定絡(luò)合物，通過(guò)520 nm光吸收值變化測(cè)定抗氧化能力的高低[31]。37 ℃下，每分鐘時(shí)間內(nèi)，1 mg組織蛋白質(zhì)使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)定義為1個(gè)T-AOC單位。

采用硫代巴比妥酸(TBA)法[32]測(cè)定日本沼蝦肝胰腺組織中MDA含量變化，以此來(lái)評(píng)估機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。硫代巴比妥酸與脂質(zhì)過(guò)氧化中的產(chǎn)物MDA縮合形成紅色產(chǎn)物，根據(jù)顏色變化于532 nm進(jìn)行比色。

1.6.3 抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量分析

采用組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(Aidlab，北京)提取各組總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的完整性，與此同時(shí)，RNA純度和濃度用Thermo NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)。用TaKaRa(大連)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)對(duì)脅迫前后各組日本沼蝦肝胰腺中熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)60和90、熱休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70，HSC70)、硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)和硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)的mRNA表達(dá)量進(jìn)行定量分析，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為qRT-PCR反應(yīng)中的內(nèi)參基因。測(cè)定時(shí)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。qRT-PCR所用引物見(jiàn)表2。采用康為CWBIO(北京)的實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒UltraSYBR Mixture進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體積為20 μL，包括10 μL 2 × UltraSYBRMixture、正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL、1 μL cDNA、8 μL ddH2O。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)后繪制熔解曲線以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性，溫度以0.5 ℃/5 s的速度從60 ℃上升到95 ℃。使用2-ΔΔCt方法對(duì)目的基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析[33]。

表2 qRT-PCR引物序列

S:正向引物 sense primer；A:反向引物 anti-sense primer。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。對(duì)脅迫前或脅迫后，不同維生素E水平組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)不同組間有顯著差異時(shí)，用Turkey法檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較；同一組脅迫前后采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析，顯著水平為0.05，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理分析。成活率數(shù)據(jù)在分析前先進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換。

2 結(jié) 果

2.1 維生素E對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表3可見(jiàn)，日本沼蝦的成活率不受飼料中維生素E水平的影響，雖然VE4組的成活率達(dá)到最高(86%)，但各組間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。隨著飼料中維生素E水平的增加，日本沼蝦的增重率呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，VE4組達(dá)到最高，且顯著高于VE1組(P<0.05)，但與其余4組的差異不顯著(P>0.05)。各組日本沼蝦的飼料系數(shù)呈與增重率相反的變化趨勢(shì)，VE4組最低，且顯著低于VE1組(P<0.05)。飼料維生素E水平對(duì)日本沼蝦攝食率的影響不顯著(P>0.05)。

2.2 維生素E對(duì)日本沼蝦肝胰腺抗氧化酶活力及MDA含量的影響

如圖1所示，飼料維生素E水平對(duì)日本沼蝦肝胰腺的抗氧化酶活力和MDA含量均產(chǎn)生影響。脅迫前，隨著飼料維生素E水平的增加，日本沼蝦肝胰腺的SOD活力也隨之增加，并于VE4組(120.25 mg/kg)達(dá)到最高，而后呈下降趨勢(shì)，且VE4組肝胰腺的SOD活力顯著高于VE1和VE2組(P<0.05)，但與VE3、VE5和VE6組相比差異不顯著(P>0.05)。脅迫后，肝胰腺的SOD活力變化趨勢(shì)與脅迫前類似，在VE5組(212.68 mg/kg)達(dá)到最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，VE1和VE2組肝胰腺的SOD活力顯著低于其他各組(P<0.05)。VE3、VE4、VE5和VE6組脅迫后日本沼蝦肝胰腺的SOD活力均顯著高于脅迫前(P<0.05)，VE1和VE2組脅迫前后日本沼蝦肝胰腺的SOD活力差異不顯著(P>0.05)。

表3 維生素E對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

隨飼料維生素E水平的變化，脅迫前后日本沼蝦肝胰腺的GSH-Px、CAT活力和T-AOC均呈與脅迫前肝胰腺的SOD活力類似的變化趨勢(shì)。脅迫前后，VE4和VE5組日本沼蝦肝胰腺的GSH-Px活力均較高，且顯著高于VE1、VE2和VE6組(P<0.05)。除VE2組脅迫前后日本沼蝦肝胰腺的GSH-Px活力無(wú)顯著差異(P>0.05)外，其余組脅迫后肝胰腺的GSH-Px活力均顯著低于脅迫前(P<0.05)。

無(wú)論脅迫前還是脅迫后，VE3、VE4和VE5組日本沼蝦肝胰腺的CAT活力均較高，VE1組則最低；與脅迫前相比，VE3組脅迫后日本沼蝦肝胰腺的CAT活力顯著降低(P<0.05)，其余各組脅迫前后肝胰腺的CAT活力差異不顯著(P>0.05)。無(wú)論脅迫前后，VE5組肝胰腺的T-AOC均為最高，其次是VE3和VE4組；VE1、VE2和VE6組肝胰腺的T-AOC較低，顯著低于VE5組(P<0.05)。與脅迫前相比，脅迫后各組肝胰腺的T-AOC均顯著下降(P<0.05)。

隨著飼料維生素E水平的升高，脅迫前或脅迫后日本沼蝦肝胰腺的MDA含量均呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，在VE2、VE3和VE4組(37.94～120.25 mg/kg)含量較低，且顯著低于VE6組(P<0.05)。與脅迫前相比，脅迫后各組肝胰腺的MDA含量均升高，且VE1、VE3、VE4和VE6組脅迫后的肝胰腺的MDA含量顯著高于脅迫前(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱上標(biāo)不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，*表示脅迫前后差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with different letters mean significant difference among different groups (P<0.05), and * mean significant difference between before and after stress (P<0.05). The same as below.

圖1 維生素E對(duì)脅迫前后日本沼蝦肝胰腺SOD(A)、CAT(B)、GSH-Px活力(C)和T-AOC(D)及MDA含量(E)的影響

Fig.1 Effects of vitamin E on SOD (A),CAT (B), GSH-Px activities (C) and T-AOC (D) and MDA content (E) in hepatopancreas ofMacrobrachiumnipponensebefore and after stress

2.3 維生素E對(duì)日本沼蝦肝胰腺抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量表達(dá)的影響

如圖2所示，脅迫前，隨飼料維生素E水平的增加，日本沼蝦肝胰腺HSP60 mRNA表達(dá)量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，VE3組肝胰腺HSP60 mRNA表達(dá)量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)；VE6組肝胰腺HSP60 mRNA表達(dá)量最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。脅迫后，各組肝胰腺HSP60 mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)與脅迫前相反，VE3組最高，且顯著高于VE1和VE2組(P<0.05)。脅迫后VE3組肝胰腺HSP60 mRNA表達(dá)量顯著高于脅迫前(P<0.05)；其余各組肝胰腺HSP60 mRNA表達(dá)量均低于脅迫前，且VE1、VE4和VE6組顯著低于脅迫前(P<0.05)。

無(wú)論脅迫前后，VE3、VE4、VE5和VE6組日本沼蝦肝胰腺HSC70 mRNA表達(dá)量均較高，顯著高于VE1組(P<0.05)。脅迫后各組肝胰腺HSC70 mRNA表達(dá)量均低于脅迫前，且在VE1組差異顯著(P<0.05)。

脅迫前，日本沼蝦肝胰腺HSP90 mRNA表達(dá)量隨飼料維生素E水平增加呈下降趨勢(shì)，VE1和VE2組的肝胰腺HSP90 mRNA表達(dá)量顯著高于其他各組(P<0.05)；脅迫后，隨飼料維生素E水平增加，肝胰腺HSP90 mRNA表達(dá)量呈先升高后下降變化趨勢(shì)，且VE3組顯著高于其他各組(P<0.05)，VE1組顯著低于其他各組(P<0.05)。氨氮脅迫顯著降低各組肝胰腺HSP90 mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

圖2 維生素E對(duì)脅迫前后日本沼蝦肝胰腺HSP60(A)、HSC70(B)和HSP90 mRNA(C)表達(dá)量的影響

如圖3所示，隨飼料維生素E水平的增加，脅迫前后各組日本沼蝦肝胰腺TrxmRNA表達(dá)量呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，VE2、VE3、VE4和VE5組肝胰腺TrxmRNA表達(dá)量較低，且脅迫前顯著低于VE6組(P<0.05)。脅迫后肝胰腺TrxmRNA表達(dá)量低于脅迫前，除VE3、VE4和VE5組脅迫前后差異不顯著(P>0.05)外，其余3組脅迫后顯著低于脅迫前(P<0.05)。

脅迫前后日本沼蝦肝胰腺TrxRmRNA表達(dá)量先是隨著飼料維生素E水平的增加而增加，VE2和VE3組顯著高于其余各組(P<0.05)，而后呈下降趨勢(shì)。脅迫后VE2、VE3、VE4、VE5和VE6組肝胰腺TrxRmRNA表達(dá)量顯著低于脅迫前(P<0.05)。

3 討 論

3.1 維生素E對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)性能的影響

已有研究顯示：飼料中添加維生素E可顯著提高斑節(jié)對(duì)蝦[4]、南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)[34]和大比目魚(yú)(Scophthalmusmaximus)[35]等的增重率或特定生長(zhǎng)率，降低飼料系數(shù)[35]。本研究也發(fā)現(xiàn)飼料中添加維生素E可提高日本沼蝦幼蝦的生長(zhǎng)性能，且維生素E含量為120.25 mg/kg(VE4組)時(shí)日本沼蝦的生長(zhǎng)性能達(dá)到最佳，飼料系數(shù)最低；低水平維生素E(18.31 mg/kg)對(duì)日本沼蝦的生長(zhǎng)性能產(chǎn)生抑制效應(yīng)；高水平維生素E(388.87 mg/kg)雖與VE4組差異不顯著，但呈下降的變化趨勢(shì)，我們推測(cè)更高的飼料維生素E水平可能會(huì)對(duì)日本沼蝦生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制效應(yīng)。據(jù)報(bào)道，高水平的維生素E具有降低大比目魚(yú)[35]、斑節(jié)對(duì)蝦[4]生長(zhǎng)性能的趨勢(shì)，但對(duì)南美白對(duì)蝦[34]、青魚(yú)[16]的增重率或特定生長(zhǎng)率無(wú)影響。可見(jiàn)，過(guò)量維生素E對(duì)不同物種的影響存在差異性，這可能是因?yàn)槲锓N特異性、動(dòng)物發(fā)育不同階段和維生素E的不同添加形式等因素造成的。本研究中日本沼蝦的增重率(278%～426%)低于商用飼料的試驗(yàn)結(jié)果[36]，飼料系數(shù)偏高。這可能是因?yàn)槿毡菊游r屬于雜食性偏食動(dòng)物性餌料[37]，對(duì)飼料中魚(yú)粉含量變化比較敏感，半純化飼料中魚(yú)粉含量較低，降低飼料適口性，導(dǎo)致生長(zhǎng)性能不佳[38-39]。

圖3 維生素E對(duì)脅迫前后日本沼蝦肝胰腺Trx(A)和TrxR mRNA(B)表達(dá)量的影響

3.2 維生素E對(duì)日本沼蝦肝胰腺抗氧化性能的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，常被用來(lái)衡量機(jī)體內(nèi)源性氧化損傷的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)維生素E缺乏和過(guò)量可提高日本沼蝦肝胰腺M(fèi)DA含量，添加適量維生素E(66.07～120.25 mg/kg)顯著降低日本沼蝦肝胰腺M(fèi)DA含量。類似地，飼料中添加適量維生素E可顯著降低草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[40]和軍曹魚(yú)(Rachycentroncanadum)[41]組織中MDA的積累?？梢?jiàn)飼料維生素E缺乏或過(guò)量可在日本沼蝦體內(nèi)誘導(dǎo)氧化脅迫。為了減少氧化脅迫，維持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡，生物體進(jìn)化出了多種抗氧化防御反應(yīng)，比如?；目寡趸溉鏢OD、CAT和GSH-Px等[42]。本研究中，飼料維生素E水平對(duì)日本沼蝦幼蝦肝胰腺的抗氧化酶活力產(chǎn)生顯著影響，維生素E含量為66.07～212.68 mg/kg(VE3、VE4和VE5組)時(shí)可顯著提高日本沼蝦肝胰腺SOD、CAT和GSH-Px活力。此外，隨著飼料維生素E水平的變化，T-AOC變化趨勢(shì)與抗氧化酶活力類似。已有研究者在南美白對(duì)蝦[5]、草魚(yú)[40]、大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)[43]和羅非魚(yú)[44]等物種中發(fā)現(xiàn)了相似的研究結(jié)果。

與此同時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的一些氧化還原系統(tǒng)如Trx系統(tǒng)在抗氧化方面也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Trx系統(tǒng)由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、TrxR和Trx組成，可為體內(nèi)多種酶提供電子，從而參與體內(nèi)自由基清除、氧化還原狀態(tài)的維持、細(xì)胞凋亡、DNA和蛋白質(zhì)修復(fù)等生理過(guò)程[45]。目前研究多集中于各種脅迫下Trx和TrxRmRNA表達(dá)量變化[46-47]。此外，機(jī)體營(yíng)養(yǎng)水平與Trx和TrxRmRNA表達(dá)量間的關(guān)系也有零星報(bào)道[48-50]，這為通過(guò)營(yíng)養(yǎng)學(xué)方法緩解脅迫提供依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，飼料維生素E水平顯著影響日本沼蝦肝胰腺Trx和TrxRmRNA表達(dá)量。過(guò)低或過(guò)高維生素E水平可誘導(dǎo)日本沼蝦TrxmRNA的表達(dá)，但安清聰?shù)萚50]發(fā)現(xiàn)維生素E缺乏抑制豬胎兒皮膚成纖維細(xì)胞中Trx的表達(dá)。這可能是因?yàn)榫S生素E對(duì)Trx基因表達(dá)的影響具有物種特異性，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。外界因素如高溫、感染、H2O2等易誘導(dǎo)Trx的表達(dá)[51]。維生素E作為一種抗氧化劑，其缺乏可在體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，添加過(guò)量可能在體內(nèi)產(chǎn)生促氧化作用[52]。本研究結(jié)果表明，維生素E缺乏或過(guò)量可使日本沼蝦體內(nèi)氧自由基增多，引起氧化脅迫，誘導(dǎo)了Trx的表達(dá)。然而，隨著飼料中維生素E水平的變化，日本沼蝦肝胰腺TrxRmRNA表達(dá)量變化與TrxmRNA表達(dá)量的變化趨勢(shì)相反，添加適量的維生素E對(duì)TrxRmRNA表達(dá)量具有積極的促進(jìn)作用。據(jù)報(bào)道，適量的硒可誘導(dǎo)機(jī)體TrxR的表達(dá)[49,53]?？梢?jiàn)，維生素E水平影響日本沼蝦TrxR表達(dá)，過(guò)低或過(guò)高維生素E引起氧化脅迫，抑制基因的表達(dá)。

鑒于以上結(jié)果，我們可知維生素E缺乏，日本沼蝦肝胰腺抗氧化能力降低，肝胰腺M(fèi)DA含量升高，脂質(zhì)過(guò)氧化，降低抗氧化相關(guān)酶活性或基因的表達(dá)；維生素E過(guò)高則帶來(lái)促氧化作用，破壞日本沼蝦體內(nèi)的氧化-抗氧化動(dòng)態(tài)平衡，自由基增多，產(chǎn)生氧化損傷，抑制了抗氧化酶的表達(dá)；但氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了Trx的表達(dá)以應(yīng)對(duì)脅迫。

3.3 維生素E對(duì)日本沼蝦肝胰腺HSP60、HSC70和HSP90 mRNA表達(dá)量的影響

HSP是生物細(xì)胞在受到應(yīng)激原(生物應(yīng)激、理化因素等)刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì)，在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象、抗凋亡、細(xì)胞保護(hù)等方面具有積極作用[54]。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中維生素E的缺乏或過(guò)量可顯著誘導(dǎo)HSP60轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。同時(shí)，維生素E缺乏組的HSP90 mRNA表達(dá)量也顯著高于維生素E添加組，以上結(jié)果與適量維生素E可降低山羊HSP表達(dá)的規(guī)律相似[55]。這進(jìn)一步說(shuō)明維生素E不足或過(guò)量引起氧化脅迫，誘導(dǎo)日本沼蝦高表達(dá)HSP60和HSP90以提供保護(hù)作用。HSC70為HSP70中的一種，屬于熱休克同源蛋白，在正常細(xì)胞中有較高的表達(dá)量，參與機(jī)體細(xì)胞的分裂、增殖及免疫等生理過(guò)程[56]。據(jù)報(bào)道，HSC70表達(dá)可受機(jī)體營(yíng)養(yǎng)水平的影響，如團(tuán)頭魴(MegalobramaamblycephalaYih)HSC70 mRNA表達(dá)可受飼料維生素C的誘導(dǎo)[57]。在本研究中，維生素E缺乏顯著降低了日本沼蝦肝胰腺蝦HSC70 mRNA表達(dá)量，表明補(bǔ)充維生素E能提高HSC70表達(dá)mRNA表達(dá)量，增強(qiáng)對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用。

3.4 維生素E對(duì)氨氮脅迫日本沼蝦的緩釋作用

本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫后，飼料的維生素E水平≥66.07 mg/kg組(VE3、VE4、VE5和VE6組)日本沼蝦肝胰腺的SOD活力顯著高于脅迫前，說(shuō)明對(duì)于維生素E補(bǔ)充組，短期氨氮脅迫誘導(dǎo)了SOD的表達(dá)。類似地，有研究者發(fā)現(xiàn)短期氨氮脅迫也可顯著提高克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[58]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[59]的SOD活力。這可能因?yàn)槭嵌唐诘拿{迫會(huì)對(duì)SOD表達(dá)具有一種暫時(shí)的刺激興奮效應(yīng)[60]，提高SOD表達(dá)，以提高機(jī)體應(yīng)對(duì)脅迫的能力，但維生素E缺乏，則不能產(chǎn)生這種刺激效應(yīng)。同時(shí)，氨氮脅迫顯著降低了日本沼蝦肝胰腺的T-AOC和GSH-Px活力，提高M(jìn)DA含量，相似的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)于中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[61]。

據(jù)報(bào)道，脅迫可影響機(jī)體TrxR和Trx的表達(dá)，如甲基汞暴露可降低魚(yú)肝臟中Trx和TrxR活性[47]；高濃度石英粉塵使人胚肺成纖維細(xì)胞的Trx和TrxR基因和蛋白質(zhì)水平表達(dá)顯著下調(diào)[46]。與此類似，我們發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫可降低日本沼蝦肝胰腺TrxR和TrxmRNA表達(dá)量，但VE3、VE4和VE5組TrxmRNA表達(dá)量在脅迫前后差異不顯著。以上結(jié)果表明：氨氮脅迫可通過(guò)下調(diào)抗氧化酶活性和Trx系統(tǒng)中Trx和TrxRmRNA表達(dá)量，導(dǎo)致體內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA積累，從而加重日本沼蝦體內(nèi)的氧化損傷。但脅迫后，適量維生素E組的T-AOC和GSH-Px、CAT活力及Trx、TrxRmRNA表達(dá)量高于維生素E缺乏或過(guò)量組，說(shuō)明添加適量水平的維生素E對(duì)氨氮脅迫具有一定的保護(hù)作用。

氨氮脅迫對(duì)日本沼蝦肝胰腺HSP60、HSC70和HSP90 mRNA表達(dá)量產(chǎn)生不同影響。HSP90在正常細(xì)胞中具有較高表達(dá)量，參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞降解、免疫等多個(gè)生理過(guò)程[62]。本研究發(fā)現(xiàn)氨氮脅迫顯著抑制HSP90的表達(dá)，但脅迫后，添加適量維生素E組的HSP90 mRNA表達(dá)量顯著高于維生素E缺乏和過(guò)量組。與此類似，氨氮脅迫48 h后可降低中國(guó)對(duì)蝦HSP90的表達(dá)[61]。脅迫后VE1組HSC70 mRNA表達(dá)量顯著低于脅迫前；脅迫后維生素E缺乏和過(guò)量組HSP60 mRNA表達(dá)量顯著低于脅迫前，但VE3組HSP60 mRNA表達(dá)量顯著高于脅迫前?？梢?jiàn)，氨氮脅迫后HSP表達(dá)水平下降可能是氨氮脅迫誘導(dǎo)組織損傷有關(guān)，但添加適量的維生素E可以提高HSP表達(dá)，提高日本沼蝦應(yīng)對(duì)脅迫的能力。

4 結(jié) 論

① 飼料維生素E水平對(duì)日本沼蝦幼蝦生長(zhǎng)性能和抗氧化性能產(chǎn)生顯著影響，適宜水平的維生素E(66.07～212.68 mg/kg)對(duì)其生長(zhǎng)性能和抗氧化性能具有積極的促進(jìn)作用。

② 維生素E缺乏或過(guò)量可誘導(dǎo)日本沼蝦HSP60和HSP90 mRNA的表達(dá)，但對(duì)HSC70 mRNA表達(dá)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。

③ 氨氮脅迫降低了日本沼蝦抗氧化性能，但添加適量的維生素E(66.07～212.68 mg/kg)可提高日本沼蝦應(yīng)對(duì)脅迫的能力。

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*Corresponding author, professor, E-mail: yjy@zjhu.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Dietary Vitamin E on Growth Performance, Antioxidant Ability and Resistance to Ammonia Nitrogen Stress ofMacrobrachiumnipponense

KONG Youqin1DING Zhili1ZHANG Yixiang1LUO Na1,2YE Jinyun1*

(1.ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofAquaticResourcesConservationandDevelopment,KeyLaboratoryofAquaticAnimalGeneticBreedingandNutrition,ChineseAcademyofFisherySciences,CollegeofLifeSciences,HuzhouUniversity,Huzhou313000,China; 2.CollegeofFisheriesandLifeScience,DalianOceanUniversity,Dalian116000,China)

The present experiment was conducted to evaluate the effects of dietary vitamin E level on growth performance, antioxidant ability and resistance to ammonia nitrogen stress of juvenileMacrobrachiumnipponense. A total of 900 healthy juvenileMacrobrachiumnipponensewith the body weight of (0.119±0.004) g were selected and randomly divided into 6 groups with 3 replicates per group and 50 shrimps per replicate. Vitamin E acetate was added to basal semi-purified diet at six levels to make diets with the actual content of 18.31, 37.94, 66.07, 120.25, 212.68 and 388.96 mg /kg vitamin E (denoted by VE1, VE2, VE3, VE4, VE5 and VE6 groups, respectively), and feeding for 8 weeks. After the feeding experiment, the prawns were subjected to ammonia nitrogen stress for 24 h. The results showed as follows: 1) the survival rate ofMacrobrachiumnipponensein each group had no significant difference (P>0.05). The weight gain rate showed a trend of firstly increased and then decreased with the dietary vitamin E increasing, and prawns in VE4 group gained the highest value and significantly higher than that in VE1 group (P<0.05). The feed conversion rate had the opposite pattern from the weight gain rate, the lowest value were found in VE4 group and significantly lower than that in VE1 group (P<0.05). 2) Before ammonia nitrogen stress, the maleic dialdehyde (MDA) content in hepatopancreas exhibited a trend of firstly decreased and then increased with dietary vitamin E increasing, the lowest value was found in VE3 group and significantly lower than that in VE1, VE5 and VE6 groups (P<0.05), whereas the activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and total antioxidant competence (T-AOC) in hepatopancreas exhibited a trend of firstly increased and then decreased with dietary vitamin E increasing. VE1 and VE6 groups gained the higher thioredoxin (Trx) mRNA expression and the lower thioredoxin reductase (TrxR) mRNA expression. The heat shock protein 60 (HSP60) mRNA expression in VE3 group was significantly lower than that in other groups (P<0.05), the heat shock cognate 70 (HSC70) mRNA expression in VE1 group was significantly lower than that in other groups (P<0.05), the heat shock protein 90 (HSP90) mRNA expression in VE1 and VE2 group was significantly higher than that in other groups (P<0.05). 3) After ammonia nitrogen stress, the SOD, CAT and GSH-Px activities, MDA content and the mRNA expressions ofTrx,TrxRandHSC70 ofMacrobrachiumnipponensein each group had the similar pattern with the before stress, but the mRNA expressions ofHSP90 andHSP60 exhibited an opposite trend with the before stress. Ammonia nitrogen stress decreased the GSH-Px activities and T-AOC and the mRNA expressions ofTrxandTrxR, increased MDA content and SOD activity of VE4, VE5 and VE6 groups. In conclusion, the results demonstrate that 120.25 mg/kg of dietary vitamin E increase the growth ofMacrobrachiumnipponense, 66.06, 120.25 and 212.68 mg/kg of dietary vitamin E enhance antioxidant activity and alleviated the toxicity of ammonia nitrogen stress ofMacrobrachiumnipponense.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2893-2905]

Macrobrachiumnipponense; vitamin E; growth; antioxidant ability; ammonia nitrogen

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.034

2017-02-07

浙江省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014C02011)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY16C190006)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402308)；湖州市自然科學(xué)資金項(xiàng)目(2015YZ06)；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015C03018)

孔有琴(1977—)，女，浙江長(zhǎng)興人，講師，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究。E-mail： susankuq@zjhu.edu.cn

*通信作者:葉金云，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail: yjy@zjhu.edu.cn

S966.12

A

1006-267X(2017)08-2893-13