2個(gè)枯草芽孢桿菌源纖維素酶基因的克隆、融合表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)分析

丁 軻 邱靜靜 羅偉光 李 旺 李元曉, 曹平華 何萬(wàn)領(lǐng) 趙龍妹 王玉琴 張春杰

(1.河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng)471023；2.河南省動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng)471023；3.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng)471023)

2個(gè)枯草芽孢桿菌源纖維素酶基因的克隆、融合表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)分析

丁 軻1,2邱靜靜1羅偉光1李 旺1李元曉1,3曹平華1何萬(wàn)領(lǐng)1趙龍妹1王玉琴3張春杰2

(1.河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng)471023；2.河南省動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽(yáng)471023；3.河南省肉羊繁育工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng)471023)

本試驗(yàn)旨在構(gòu)建不同纖維素酶的融合表達(dá)系統(tǒng)及探討融合纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)。利用PCR技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室前期分離的枯草芽孢桿菌中分別擴(kuò)增2個(gè)纖維素酶基因Cel42和Cel22，設(shè)計(jì)一段柔性接頭(GSGGGS)，通過(guò)酶切連接將2個(gè)纖維素酶基因構(gòu)建在一個(gè)開放閱讀框(ORF)內(nèi)，插入到pET32a(+)中構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a(+)-Cel42-Cel22，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明：本試驗(yàn)成功克隆了2個(gè)纖維素酶基因Cel42和Cel22，并構(gòu)建了重組表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)估計(jì)其分子質(zhì)量約為101 ku，粗酶液中葡聚糖內(nèi)切酶活性為57.62 U/mL，葡聚糖外切酶活性為32.57 U/mL。試驗(yàn)所得融合纖維素酶Cel42-Cel22的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH為6.0，溫度在30～70 ℃范圍內(nèi)時(shí)可維持70%以上的纖維素酶活性，pH在4.0～9.0范圍內(nèi)時(shí)可保持75%以上的纖維素酶活性,除Mn2+外的其他金屬離子對(duì)纖維素酶的活性均具有一定的抑制作用，其中Hg2+和Cu2+對(duì)的抑制作用較明顯。由此可見，本試驗(yàn)在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)出了融合纖維素酶Cel42-Cel22，且該酶具有一定的活性，可適應(yīng)較寬廣的溫度和pH范圍，對(duì)金屬離子敏感。

纖維素酶；枯草芽孢桿菌；克?。蝗诤媳磉_(dá)；酶學(xué)性質(zhì)

纖維素是一種由800～1 200個(gè)葡萄糖分子聚合而成的高分子化合物，是世界上最豐富的可再生有機(jī)資源。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量約占世界的20%[1-2]，由于秸稈以多聚糖形式存在，目前僅有10%的秸稈用于反芻動(dòng)物飼料[3]。秸稈一般需要在體外先采用物理或化學(xué)方法進(jìn)行處理后再進(jìn)行利用，但這些方法不僅效率低，而且容易造成環(huán)境二次污染，很難推廣應(yīng)用[4-5]。因此，目前研究主要集中在秸稈的生物降解方面，即利用微生物產(chǎn)生的纖維素酶降解纖維素。纖維素酶主要分為三大類，即葡聚糖內(nèi)切酶(endo-glucanases)、葡聚糖外切酶(exo-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)[6-7]，目前纖維素酶已應(yīng)用于酒精、造紙、畜牧、食品和紡織等行業(yè)[8-10]，所以對(duì)纖維素酶的研究具有廣闊的應(yīng)用前景和社會(huì)意義。

由于天然微生物產(chǎn)酶量低、產(chǎn)酶單一，且產(chǎn)不同纖維素酶的微生物之間很難達(dá)到最佳配合，所以纖維素的自然生物降解是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，根本無(wú)法適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)的需求。因此，借助分子生物學(xué)方法將不同纖維素酶基因整合到微生物高效表達(dá)系統(tǒng)中是最理想最有效的措施。已有報(bào)道通過(guò)基因工程技術(shù)將不同來(lái)源的纖維素酶基因克隆到細(xì)菌、真菌、酵母等微生物中，但這些研究主要是對(duì)單一纖維素酶的克隆與表達(dá)[10-14]。纖維素酶單獨(dú)應(yīng)用效果不佳，需按照一定比例配合后才可應(yīng)用。目前，蛋白質(zhì)的融合表達(dá)技術(shù)已臻于成熟，可形成一種具有多功能的復(fù)合蛋白質(zhì)，大大簡(jiǎn)化了后期蛋白質(zhì)的純化和工藝流程等[15]。目前已有利用大腸桿菌pET載體系列表達(dá)纖維素酶基因的報(bào)道[12,16-17]。但迄今為止，關(guān)于不同纖維素酶在大腸桿菌中的融合表達(dá)還鮮有報(bào)道。

在前期工作中，我們已經(jīng)從土壤中篩選獲得2株具有纖維素降解能力的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)N42和BacillussubtilisN22，并通過(guò)體外試驗(yàn)初步確定了分別含有2種纖維素酶。為進(jìn)一步探討這2種纖維素酶的協(xié)同作用，本研究首先克隆2個(gè)纖維素酶基因，根據(jù)2個(gè)纖維素酶基因兩端的堿基特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一段柔性連接肽將2個(gè)纖維素酶基因融合后重組入大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)中，評(píng)估其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的效果，并對(duì)表達(dá)的融合纖維素酶的性質(zhì)進(jìn)行分析，以期獲得1株能夠高效表達(dá)不同纖維素酶融合蛋白的重組大腸桿菌，并為進(jìn)一步研究融合纖維素酶高效降解纖維素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

BacillussubtilisN42、BacillussubtilisN22為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和pMD18-T、pET32a(+)均購(gòu)自TaKaRa公司；BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42、BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel22為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2 酶和主要試劑

PyrobestTMDNA Polymerase，T4 DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、NcoⅠ、XhoⅠ，DNA marker，蛋白質(zhì)marker均購(gòu)于TaKaRa公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal、Goldview核酸染色劑、Ni-NTA SefinoseTMResin Kit均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)粒純化試劑盒和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆

根據(jù)GenBank上公布的Bacillussubtilis的內(nèi)切葡聚糖酶基因序列(KF240848.1)和β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列(KM 009051.1)，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，F(xiàn)1:5′-CATGCCATGGGAGTGCAGATGAAAC-3′，R1:5′-GGATCCACCGCCAGATCATTTG-3′；F2:5′-CGGGATCCATGCCTTATCTGAAACG-3′，R2:5′-CCGCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGC-3′。下劃線部分為酶切位點(diǎn)堿基，引物R1和F2中方框內(nèi)為連接肽堿基，用于2個(gè)基因的連接。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

以BacillussubtilisN42和BacillussubtilisN22全基因組為模板，分別用引物F1/R1和F2/R2進(jìn)行擴(kuò)增，獲取的基因分別命名為Cel42和Cel22，然后分別克隆至pMD18-T中，得到pMD18-T-Cel42和pMD18-T-Cel22，并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述質(zhì)粒pMD18-T-Cel42和pMD18-T-Cel22同時(shí)用BamHⅠ/XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段后用T4 DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，PCR和雙酶切鑒定，得到質(zhì)粒pMD18-T-Cel42-Cel22。將該質(zhì)粒與表達(dá)載體pET32a(+)分別經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ酶切回收后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，命名為pET32a(+)-Cel42-Cel22。

1.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cel42-Cel22轉(zhuǎn)化到宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取陽(yáng)性菌株接入含氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL的LB培養(yǎng)液中。37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，以1∶50轉(zhuǎn)接入200 mL含同樣抗性濃度的LB培養(yǎng)液，培養(yǎng)至600 nm處光密度(OD)值=0.6時(shí)，加入0.5～2.0 mmol/L濃度的IPTG，37 ℃、180 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。4 ℃、3 500 r /min離心30 min，用1∶20體積的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)洗滌細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入6 mL的PBS，放到-80 ℃冰箱中，反復(fù)凍融3～5次，在冰上用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，取上清液用于SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.4 融合纖維素酶Cel42-Cel22的酶活性測(cè)定

分別制備濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其OD540 nm值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將重組菌培養(yǎng)液4 ℃、12 000 r/min離心30 min，超聲破碎后離心所得上清液即為粗酶液。

1.2.4.1 葡聚糖內(nèi)切酶活性測(cè)定

葡聚糖內(nèi)切酶活性測(cè)定采用二硝基水楊酸(DNS)法[18]。取1 mL粗酶液與2 mL 1.0%羧甲基纖維素鈉溶液(pH 4.8)混勻，50 ℃恒溫水浴30 min，加入2 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻后定容到5 mL，混勻。采用分光光度計(jì)測(cè)定OD540 nm值，計(jì)算溶液中的葡萄糖濃度。根據(jù)在pH 4.8、50 ℃保溫30 min條件下，1 min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉生成1 μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)，計(jì)算葡聚糖內(nèi)切酶的活性。

1.2.4.2 葡聚糖外切酶活性測(cè)定

取1 mL粗酶液與2 mL 1.0%的微晶纖維素鈉溶液(pH 4.8)混勻，50 ℃水浴反應(yīng)30 min，離心，取上清，同上步驟采用DNS法測(cè)定上清液中的還原糖含量。根據(jù)1 min內(nèi)由底物產(chǎn)生1.0 μg還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U)，計(jì)算葡聚糖外切酶的活性。

1.2.5 融合纖維素酶Cel42-Cel22的最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

取25 μL經(jīng)Ni-NTA SefinoseTMResin Kit純化的融合纖維素酶Cel42-Cel22(pH 4.0～5.0)，添加25 μL 1%羧甲基纖維素鈉溶液(pH 4.8)，分別在30、35、40、45、50、55、60、65 ℃靜置60 min，測(cè)定纖維素酶活性，以確定最適反應(yīng)溫度。為了確定融合纖維素酶Cel42-Cel22的熱穩(wěn)定性，將25 μL純化的融合纖維素酶Cel42-Cel22(pH 4.0～5.0)分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃保溫60 min，取出后立即放入冰水浴中，再添加25 μL 1%羧甲基纖維素鈉溶液(pH 4.8)，靜置作用60 min，測(cè)定纖維素酶活性。

1.2.6 融合纖維素酶Cel42-Cel22的最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性

用100 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0)、100 mmol/L醋酸鹽緩沖液(pH 4.0～5.0)、100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0～7.0)、100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0～9.0)、100 mmol/L碳酸氫鈉/氫氧化鈉緩沖液(pH 10.0～11.0)和100 mmol/L氯化鉀/氫氧化鈉緩沖液(pH 12.0)將25 μL純化的融合纖維素酶Cel42-Cel22分別調(diào)至pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，然后加入25 μL相應(yīng)pH的1%羧甲基纖維素鈉，于最適溫度下反應(yīng)60 min，測(cè)定纖維素酶活性。為了確定融合纖維素酶Cel42-Cel22的酸堿穩(wěn)定性，將純化的融合纖維素酶Cel42-Cel22分別調(diào)至pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，于室溫靜置2 h后，再添加25 μL相應(yīng)pH的1%羧甲基纖維素鈉，于最適溫度下反應(yīng)60 min，測(cè)定纖維素酶活性。

1.2.7 金屬離子對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性的影響

為確定金屬離子對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性的影響，向融合纖維素酶Cel42-Cel22反應(yīng)體系中分別加入不同的金屬離子——Na+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Hg2+、Co2+、Al3+、Fe3+，使金屬離子終濃度為1 mmol/L，室溫靜置60 min后，測(cè)定纖維素酶活性。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用繪圖軟件Graphpad Prism 5繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 纖維素酶基因Cel42和Cel22的克隆結(jié)果

以特異性引物擴(kuò)增后得到2個(gè)基因片段(圖1)，與預(yù)期目的片段大小相符，經(jīng)測(cè)序大小分別為1 515和729 bp，并提交到GenBank(登錄號(hào)分別為KJ130416和KJ130415)，將這2個(gè)基因通過(guò)NCBI進(jìn)行Blast，結(jié)果顯示Cel42基因與Bacillussubtilis的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶具有高度的同源性，Cel22基因與Bacillussubtilis的β-1,4-葡聚糖外切酶具有高度的同源性，說(shuō)明已成功擴(kuò)增出目的基因。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-Cel42-Cel22的PCR擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果

以構(gòu)建的pMD18-Cel42-Cel22質(zhì)粒為模板，分別用引物F1/R1和F2/R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到2條大小分別約為1.50和0.75 kb的DNA片段，分別與Cel42和Cel22基因片段大小相符。pMD18-Cel42-Cel22質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切后可得到1條大小約為4.95 kb的條帶，經(jīng)NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切后得到2條大小分別約為3.45和1.50 kb的條帶，經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切后得到2條大小分別約為2.70和2.25 kb的條帶，經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后得到2條大小分別約為4.20和0.75 kb的條帶，結(jié)果均與預(yù)期相符(圖2)。

圖A中，M代表DNA marker，1代表Cel42基因，2代表陰性對(duì)照；圖B中，M代表DNA marker，1代表Cel22基因，2代表陰性對(duì)照。

In figure A, M represented DNA marker, 1 representedCel42 gene and 2 represented negative control; in figure B, M represented DNA marker, 1 representedCel22 gene and 2 represented negative control.

圖1Cel42和Cel22基因PCR擴(kuò)增圖

Fig.1 PCR amplification map ofCel42 andCel22 genes

M： DNA marker；1：F1/R1引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：NcoⅠ/BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物；3：NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；4：BamHⅠ單酶切產(chǎn)物；5：BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；6：F2/R2引物的PCR產(chǎn)物。

M: DNA marker; 1: PCR amplification product based on primers F1/R1; 2:NcoⅠ/BamHⅠ digested product; 3:NcoⅠ/XhoⅠdigested product; 4:BamHⅠ digested product; 5:BamHⅠ/XhoⅠdigested product; 6: PCR amplification product based on primers F2/R2.

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-Cel42-Cel22 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物

Fig.2 PCR amplification and enzyme digested products of recombinant plasmid pMD18-Cel42-Cel22

2.3 重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cel42-Cel22的PCR擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cel42-Cel22經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切得到2條大小分別約為5.90和2.24 kb的條帶，經(jīng)XhoⅠ單酶切得到1條大小約為8.10 kb的條帶，用引物對(duì)F1/R1擴(kuò)增出1條大小約為1.50 kb的條帶，均與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。

2.4 融合蛋白的表達(dá)

重組菌株BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22在25 ℃、1 mmol/L IPTG的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示，與對(duì)照菌株BL21(DE3)/pET32a(+)相比，誘導(dǎo)的陽(yáng)性重組菌株BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22在101 ku附近出現(xiàn)1條明顯條帶，與預(yù)期估測(cè)的融合蛋白分子質(zhì)量大小相似(圖4)，表明Cel42-Cel22纖維素酶融合基因通過(guò)大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)得到了有效表達(dá)。

2.5 融合纖維素酶Cel42-Cel22酶活性的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液中不同濃度葡萄糖的OD540 nm值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)和酶活性計(jì)算方法，計(jì)算出粗酶液中葡聚糖內(nèi)切酶的活性為57.62 U/mL，葡聚糖外切酶的活性為32.57 U/mL。

M：DNA marker；1：F1/R1引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2：NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；3：XhoⅠ單酶切產(chǎn)物。

M: DNA marker; 1: PCR amplification product based on primers F1/R1; 2:NcoⅠ/XhoⅠ digested product; 3:XhoⅠdigested product.

圖3 重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cel42-Cel22 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物

Fig.3 PCR amplification and enzyme digested products of recombinant plasmid pET32a(+)-Cel42-Cel22

1:BL21(DE3)/pET32a(+)；2和3： BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22；4：蛋白質(zhì) marker；5：純化的融合蛋白。

1: BL21(DE3)/pET32a(+);2 and 3: BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22; 4: protein marker; 5: purified fusion protein.

圖4 融合蛋白的SDS-PAGE圖

Fig.4 SDS-PAGE map of fusion protein

2.6 溫度對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性及穩(wěn)定性的影響

純化的融合纖維素酶Cel42-Cel22在30～65 ℃溫度下測(cè)得的纖維素酶活性結(jié)果如圖6-A所示。由圖6-A可以看出融合纖維素酶Cel42-Cel22最適反應(yīng)溫度為50 ℃。將純化的融合纖維素酶Cel42-Cel22經(jīng)30～90 ℃保溫處理60 min后，再以羧甲基纖維素鈉為底物，測(cè)定其殘余纖維素酶活性，檢測(cè)其對(duì)熱的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果如圖6-B所示。由圖6-B可以看出，在30～70 ℃時(shí)，70%以上的纖維素酶能夠保持活性，而溫度高于70 ℃后則纖維素酶活性急劇下降。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 pH對(duì)融合纖維素酶Cel042-Cel22活性及穩(wěn)定性的影響

將純化的融合纖維素酶Cel042-Cel22在不同pH條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，檢測(cè)其纖維素酶活性，結(jié)果如圖6-C所示。由圖6-C可以看出，該融合纖維素酶Cel042-Cel22酶促反應(yīng)的最適pH為6.0。將純化的融合纖維素酶Cel042-Cel22在pH 3.0～12.0范圍內(nèi)處理后，再檢測(cè)其纖維素酶活性，測(cè)定其對(duì)pH的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6-D所示。由圖6-D可以看出，在pH 4.0～9.0之間75%以上的纖維素酶保持活性。

2.8 金屬離子對(duì)融合纖維素酶Cel042-Cel22活性的影響

金屬離子對(duì)融合纖維素酶Cel042-Cel22活性的影響如圖7所示。由圖7可以看出，在檢測(cè)的離子范圍內(nèi)，除Mn2+對(duì)纖維素酶活性沒有明顯的影響外，其余金屬離子均有不同程度的抑制作用，其中Hg2+對(duì)纖維素酶活性的抑制作用最大，相對(duì)活性只有28.94%，Cu2+次之，相對(duì)活性為41.53%。2種鐵離子(Fe2+、Fe3+)對(duì)纖維素酶活性的影響中，F(xiàn)e2+的生物學(xué)效價(jià)高于Fe3+。

A:溫度對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性的影響；B：溫度對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22穩(wěn)定性的影響；C：pH對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性的影響；D：pH對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22穩(wěn)定性的影響。

A: effect of temperature on fusion cellulose Cel42-Cel22 activity; B: effect of temperature on stability of fusion cellulose Cel42-Cel22; C: effect of pH on fusion cellulase Cel42-Cel22 activity; D: effect of pH on stability of fusion cellulase Cel42-Cel22.

圖5 溫度和pH對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性及穩(wěn)定性的影響

Fig.5 Effects of temperature and pH on fusion cellulase Cel42-Cel22 activity and stability

圖6 金屬離子對(duì)融合纖維素酶Cel42-Cel22活性的影響

3 討 論

纖維素的降解是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要多種不同種類的纖維素酶共同完成[18]。雖然利用混合菌種的復(fù)合菌系協(xié)同發(fā)酵能提高纖維素的降解率，但由于菌株選育、優(yōu)化等過(guò)程較為復(fù)雜，從而限制了纖維素大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用[19]。利用基因工程方法將不同的纖維素酶基因整合到單一菌株內(nèi)，可使工業(yè)生產(chǎn)條件更易調(diào)控、生產(chǎn)過(guò)程更簡(jiǎn)化。而不同纖維素酶基因的融合是該方法的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，且基因之間合適的連接接頭是保持融合蛋白空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、發(fā)揮良好生物學(xué)活性的前提。一般用于接頭的氨基酸主要包括脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)等[20]。本研究為了將2種纖維素酶基因融合表達(dá)，在Cel42基因3＇端中添加了一段核苷酸序列GGATCTGGCGGT，翻譯成的氨基酸為Gly-Ser-Gly-Gly，同時(shí)借助BamHⅠ酶切位點(diǎn)的堿基序列GGATCC的優(yōu)勢(shì)，其翻譯的氨基酸為Gly-Ser，從而構(gòu)成了一個(gè)由6個(gè)氨基酸組成的柔性接頭(GSGGGS)，利用這樣一段連接肽進(jìn)行雙纖維素酶基因之間的連接，使得2個(gè)纖維素酶基因位于同一個(gè)開放閱讀框(ORF)內(nèi)，獲得了融合基因Cel42-Cel22，并將其插入大腸桿菌表達(dá)載體pET32a(+)中。通過(guò)PCR和酶切鑒定結(jié)果可以看出，本研究成功構(gòu)建了融合表達(dá)載體pET32a(+)-Cel42-Cel22。該重組載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)后，通過(guò)誘導(dǎo)可成功表達(dá)融合纖維素酶Cel42-Cel22，表達(dá)的粗酶液中葡聚糖內(nèi)切酶活性為57.62 U/mL，葡聚糖外切酶活性為32.57 U/mL，相對(duì)于已報(bào)道的在大腸桿菌表達(dá)葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶活性[16]具有一定的優(yōu)勢(shì)，但與其他表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的纖維素酶活性[21]相比還有些欠缺。由于pET系列載體表達(dá)的蛋白質(zhì)容易形成包涵體，可導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)生物學(xué)活性喪失[22]，這可能是導(dǎo)致融合纖維素酶活性不是很理想的原因之一。

酶學(xué)性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)融合表達(dá)的融合纖維素酶Cel42-Cel22的最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為50 ℃，這與短小芽孢桿菌S124A所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度[23]一致。本試驗(yàn)表達(dá)的融合纖維素酶Cel42-Cel22在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)時(shí)75%以上的纖維素酶可以保持活性，溫度在30～70 ℃范圍內(nèi)時(shí)70%以上的纖維素酶能夠保持活性，而溫度高于70 ℃則其活性急劇下降，表明該融合纖維素酶Cel42-Cel22可適應(yīng)較寬廣的溫度和pH范圍，所以較適合于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

由于纖維素的降解是內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶協(xié)同作用的結(jié)果，而本研究中僅將來(lái)源于2株不同菌株的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的基因進(jìn)行了融合表達(dá)，如想進(jìn)一步提高融合纖維素酶的產(chǎn)量和活性，在后續(xù)研究中可根據(jù)生長(zhǎng)的需要將更多的纖維素酶基因整合到該載體中。此外，如果將宿主菌改為乳酸菌之類的益生菌，并進(jìn)一步將攜帶多種纖維素酶基因的乳酸桿菌開發(fā)成生物制劑，勢(shì)必會(huì)提升其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)成功克隆了Bacillussubtilis的β-1,4-葡聚糖內(nèi)切酶基因Cel42和β-1,4-葡聚糖外切酶基因Cel22，通過(guò)設(shè)計(jì)一段連接肽將2個(gè)基因融合在一個(gè)ORF內(nèi)，并成功實(shí)現(xiàn)了融合纖維素酶Cel42-Cel22在大腸桿菌中的表達(dá)，粗酶液中葡聚糖內(nèi)切酶活性為57.62 U/mL，葡聚糖外切酶活性為32.57 U/mL。

② 本試驗(yàn)所得融合纖維素酶Cel42-Cel22的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH為6.0，溫度在30～70 ℃范圍內(nèi)時(shí)可維持70%以上的纖維素酶活性，pH在4.0～9.0范圍內(nèi)時(shí)可保持75%以上的纖維素酶活性，金屬離子Hg2+和Cu2+則對(duì)其具有明顯的抑制作用。

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Author, DING Ke, associate professor, E-mail： keding19@163.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Cloning, Fusion Expression of Two Cellulase Genes fromBacillussubtilisand Its Enzymatic Properties

DING Ke1,2QIU Jingjing1LUO Weiguang1LI Wang1LI Yuanxiao1,3CAO Pinghua1HE Wangling1ZHAO Longmei1WANG Yuqin3ZHANG Chunjie2

(1.HongxiangBiologicalFeedLaboratory,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471023,China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicHealthofHenanProvince,Luoyang471023,China; 3.ResearchCenterofBreedingEngineeringTechnologyforMeatSheepofHenanProvince,Luoyang471023,China)

The aim of this experiment was to construct fusion expression system based on different cellulases and studied the enzymatic properties of fusion cellulase. The two different cellulase genesCel42 andCel22 were amplified fromBacillussubtilisisolated in previous researches in our laboratory using PCR method, respectively. The two genes were linked with a flexible polypeptide (GSGGGS), which could form a complete ORF, and the fusion gene was inserted into vector pET32a(+) to construct the recombinant expression vector pET32a(+)-Cel42-Cel22, which was transformed intoEscherichiacoliBL21(DE3). The recombinant strain was induced to express the fusion cellulose, and the the enzymatic properties of fusion cellulose were studied. The results showed that the two cellulase genesCel42 andCel22 were cloned successfully in this experiment, and obtained the recombinant expression system BL21/pET32a(+)-Cel42-Cel22. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) indicated that the molecular weight of the fusion protein was about 101 ku. Enzymatic activity of the crude enzyme liquid indicated that the endo-1,4-β-D-glucanases activity was 57.62 U/mL, and the exo-1,4-β-D-glucanase activity was 32.57 U/mL. The reaction optimal temperature of the fusion cellulase Cel42-Cel22 was 50 ℃, and could still maintain above 70% cellulase activity when temperature was from 30 to 70 ℃. The optimal pH of the fusion cellulase Cel42-Cel22 was 6.0, and could still maintain over 75% cellulase activity in a pH range of 4.0 to 9.0. In addition to Mn2+, other metal ions had inhibitory effects on the activity of fusion cellulase Cel42-Cel22, especially Hg2+and Cu2+. In conclusion, the fusion fusion cellulase Cel42-Cel22 is realized to efficiently express inEscherichiacoliBL21(DE3), has a higher activity within a wide range of temperature and pH, and is sensitive to metal ions.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2725-2733]

cellulase;Bacillussubtilis; clone; fusion expression; enzymatic properties

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.015

2017-02-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101744)；河南省科技廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(131100110300)

丁 軻(1977—)，男，河南永城人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物微生態(tài)學(xué)研究。E-mail： keding19@163.com

S852.2

A

1006-267X(2017)08-2725-09