濕疹1號(hào)對(duì)脾虛型豚鼠急性濕疹模型免疫功能的影響

王奐云，李忻紅，田靜，馬賢德（．遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽(yáng)003；．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng)003）

濕疹1號(hào)對(duì)脾虛型豚鼠急性濕疹模型免疫功能的影響

王奐云1，李忻紅2，田靜1，馬賢德1
（1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué),沈陽(yáng)110032；2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng)110032）

目的 觀察濕疹1號(hào)對(duì)血清噬酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）的作用并分析其對(duì)T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及其比值的影響，探討該藥治療急性脾虛濕疹的作用機(jī)制。方法 將50只豚鼠隨機(jī)分成5組，即空白對(duì)照組、脾虛急性濕疹空白對(duì)照組、脾虛急性濕疹中藥治療低、高劑量組，中藥（黃柏膠囊）陽(yáng)性對(duì)照組。采用DNCB涂抹及飲食不節(jié)、疲勞過(guò)度致脾虛證法建立豚鼠急性脾虛濕疹模型，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法與流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行血ECP及CD4+T、CD8+T的檢測(cè)。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組血清中ECP過(guò)度表達(dá)，與模型組比較，各給藥組ECP表達(dá)均明顯下降（P＜0．05或P＜0．01），且中藥高劑量組療效要優(yōu)于低劑量和黃柏膠囊組，而低劑量組與黃柏膠囊組的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與模型組比較，各給藥組CD4+T及CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞水平有所升高，而CD8+T水平則有所降低，但僅中藥高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論 濕疹1號(hào)能有效抑制皮損中ECP水平的表達(dá)，并調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞之間的平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)人體的免疫功能。

濕疹1號(hào)；急性濕疹；噬酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白；T淋巴細(xì)胞

濕疹是一種過(guò)敏性炎癥性皮膚病，其皮損對(duì)稱分布，劇烈瘙癢，臨床分為急性、亞急性和慢性3類。中醫(yī)屬“濕瘡”、“浸淫瘡”范疇。中醫(yī)認(rèn)為急性濕瘡患者多為機(jī)體稟賦不足，復(fù)感風(fēng)濕熱邪浸淫肌膚所致，臨床常見，易診而難治，近年來(lái)發(fā)病率有升高趨勢(shì)[1]。中藥濕疹1號(hào)具有清熱健脾除濕，祛風(fēng)止癢之功，臨床治療急性濕疹療效滿意。本實(shí)驗(yàn)以血清中嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）和T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+作為研究指標(biāo)，旨在探討濕疹1號(hào)對(duì)脾虛型豚鼠急性濕疹模型的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 健康豚鼠50只，體質(zhì)量250 g左右，雌雄各半，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2010-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)入后，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物室內(nèi)，許可證號(hào)：SYX K（遼）2013-0009。

1.1.2 藥物 濕疹1號(hào)（蒼術(shù)15 g，苦參10 g，荊芥15 g，防風(fēng)20 g，生地15 g，當(dāng)歸20 g，蟬蛻15 g，澤瀉20 g，生石膏25 g，知母15 g，白花蛇舌草20 g，陳皮20 g，車前15 g，赤芍20 g，牡丹皮15 g，白鮮皮20 g，茯苓20 g，甘草10 g）（購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）傳統(tǒng)方法煎煮濃縮，制成煎劑。黃柏膠囊（九惠制藥股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：151001，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44020428）。

1.1.3 試劑與儀器 DNCB（二硝基氯苯），解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站；ECPELISA試劑盒,上海百蕊生物科技有限公司，批號(hào)：201409。不同熒光素標(biāo)記的抗CD4、CD8單克隆抗體（BD,Biosciences公司）；anthos2010型酶標(biāo)儀（奧地利安圖公司）；流式細(xì)胞儀（型號(hào)FACSCalibur，美國(guó)BD公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模 建立急性濕疹模型[2]，除空白對(duì)照組外，其余組豚鼠在實(shí)驗(yàn)前1 d頸部去毛，面積約3 cm× 3 cm，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用5%二硝基氯苯（DN CB）丙酮溶液25μL外涂于去毛處致敏，1周后在豚鼠右耳內(nèi)側(cè)涂1%DNCB丙酮溶液100μL作為激發(fā)，之后每隔3 d激發(fā)1次，連續(xù)5次，觀察豚鼠右耳較左耳明顯紅腫，并出現(xiàn)滲出、結(jié)痂，即表明造模成功。

建立豚鼠脾虛模型,每只豚鼠單日喂甘藍(lán)10～15 g，自由飲水，每2 d以豬油3mL/只灌胃，在上述處理后當(dāng)日放入27℃水池中，游泳至耐力極限，即豚鼠無(wú)力游動(dòng)，經(jīng)驅(qū)趕仍不能繼續(xù)，且身體向腹側(cè)蜷曲、發(fā)抖甚至下沉等征象，1次/d，連續(xù)8 d。觀察造模組豚鼠，若出現(xiàn)倦怠、嗜臥、懶動(dòng)、瞇眼、扎堆、便條狀稀便、毛發(fā)散亂無(wú)光澤、體溫略有降低、體質(zhì)量下降及食量減少等癥狀，5個(gè)以上即可認(rèn)為脾虛模型復(fù)制成功[3]。

1.2.2 分組及給藥 將50只豚鼠隨機(jī)分成5組，即空白對(duì)照組、脾虛急性濕疹空白對(duì)照組、脾虛急性濕疹1號(hào)低劑量組、脾虛急性濕疹1號(hào)高劑量

組，脾虛急性濕疹中藥（黃柏膠囊）陽(yáng)性對(duì)照組，10 只/組。末次激發(fā)1 d后給藥，根據(jù)人與豚鼠體表面積比例進(jìn)行換算，黃柏膠囊組用量232．5mg；中藥高低劑量組：3．875mL/只灌胃，（分別含原藥材15．5 g，3．875 g）其余組予等量生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)用藥14 d。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及檢測(cè)技術(shù)

1.2.3.1 血清中ECP含量檢測(cè) 2周后，豚鼠模型未處死前，腹主動(dòng)脈采血，離心后取血清。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)各組豚鼠血清中ECP含量進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3.2 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T、CD8+T 末次給藥后2 h，經(jīng)心臟穿刺采集豚鼠全血2mL，并抗凝。另取1支試管，其中加入2mL淋巴細(xì)胞分離液，并將試管傾斜30°～45°，然后用玻璃吸管吸取抗凝血，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液之上，切勿令淋巴細(xì)胞分離液與抗凝血混合。將試管置于離心機(jī)中，1 200轉(zhuǎn)/min，離心10min。取出試管，觀察血細(xì)胞分離情況，在淋巴細(xì)胞分離液與血漿層之間的毛玻璃狀細(xì)胞層即為淋巴細(xì)胞層，吸取淋巴細(xì)胞層至另一離心管中，以PBS緩沖液洗滌3次，末次洗滌調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，并吸取0．5mL細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群。于細(xì)胞懸液中加入CD4/CD8雙標(biāo)流式抗體5μL，混勻后，避光，37℃孵育30min，以PBS洗滌細(xì)胞2次，上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀操作過(guò)程由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科代為完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以±s表示計(jì)量資料,組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析法進(jìn)行比較,兩兩比較采用LSD法，P＜0．05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濕疹1號(hào)對(duì)豚鼠血清中噬酸細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）的影響 與空白對(duì)照組比較，脾虛急性空白對(duì)照組血清中ECP均有升高（均P＜0．01），表明造模成功。與模型組比較，中藥高、低劑量組與黃柏膠囊組外周血清中ECP均明顯降低（P＜0．05或P＜0．01）且中藥高劑量組療效要優(yōu)于低劑量和黃柏膠囊組，而低劑量組與黃柏膠囊組的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1。

2.2 濕疹1號(hào)對(duì)T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+及其比值的影響 CD4+T淋巴細(xì)胞水平可見模型組較空白對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），治療各組與模型組之間比較有升高趨勢(shì)，但僅高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；CD8+T淋巴細(xì)胞水平則模型組較空白對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），而治療各組相對(duì)模型組均有降低趨勢(shì),但僅高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；CD4/CD8可見模型組較正常組顯著降低（P＜0．01），其他各組較模型組有升高趨勢(shì)，但僅高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表2。

表1 濕疹1號(hào)對(duì)豚鼠血清中ECP的影響 （±s）

表1 濕疹1號(hào)對(duì)豚鼠血清中ECP的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0．01；與脾虛急性空白對(duì)照組比較△P＜0．05，△△P＜0．01；與濕疹1號(hào)低劑量組比較▲P＜0．05。

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表2 濕疹1號(hào)對(duì)T細(xì)胞亞群、及其比值的影響 （±s）

表2 濕疹1號(hào)對(duì)T細(xì)胞亞群、及其比值的影響 （±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0．01；與脾虛急性空白對(duì)照組比較△P＜0．05。

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3 討論

濕疹是由內(nèi)外因素共同引起的一種滲出傾向的炎癥性皮膚病，內(nèi)因包括慢性感染病灶、血液循環(huán)障礙、神經(jīng)精神因素等，外因包括食物、生活環(huán)境以及各種化妝品等。其發(fā)病機(jī)制與免疫功能密切相關(guān)，可伴有肥大細(xì)胞，細(xì)胞因子（CK），嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的參與，眾所周知，E OS可分泌大量神經(jīng)毒素成分,主要包括堿性蛋白（MBP）、嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶素（EPO）、ECP等，其中ECP是細(xì)胞毒性最強(qiáng)的強(qiáng)堿性顆粒蛋白，可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺，而皮膚血管內(nèi)有H1、H2兩種受體,組胺通過(guò)兩種受體共同作用可引起毛細(xì)血管擴(kuò)張和血管壁通透性增強(qiáng)從而增加炎癥滲出，進(jìn)而導(dǎo)致皮膚濕疹樣變。組胺在基膜或表皮中會(huì)引發(fā)癢感,而被釋放到真皮后則引起疼痛和血管性水腫,其癢感通常伴有潮紅和風(fēng)團(tuán)。本實(shí)驗(yàn)濕疹模型中ECP水平含量較高與趙俊芳等[4]的研究一致。故ECP可作為EOS的活化標(biāo)志，可作為檢測(cè)變態(tài)反應(yīng)炎癥程度的標(biāo)準(zhǔn)[5]。目前濕疹治療方法多樣化，常采用口服抗組胺藥和外用激素軟膏等方法，但緩解期短且易復(fù)發(fā)，而中醫(yī)通過(guò)辨證論治，自擬濕疹1號(hào)方取得了良好療效，不良反應(yīng)較少，提高了患者的生活質(zhì)量。由表1可知，豚鼠濕疹模型組中血清ECP表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，各治療組ECP水平明顯降低，且濕疹1號(hào)高劑量組療效最佳，說(shuō)明濕疹1號(hào)可能是通過(guò)抑制血清中ECP的表達(dá)從而達(dá)到治療目的。

濕疹的發(fā)病可能與Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)[2]，在Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)中T淋巴細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。本組資料顯示，用藥后CD4+及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞水平升高，同時(shí)CD8+T淋巴細(xì)胞水平降低，由此濕疹1號(hào)的作用機(jī)制可能是對(duì)豚鼠T淋巴細(xì)胞亞群水平有良好的雙向調(diào)節(jié)作用，使低者升高，高者降低，糾正豚鼠機(jī)體免疫功能失衡狀態(tài)，從而減少炎癥滲出。CD4+T淋巴細(xì)胞是輔助性淋巴細(xì)胞(Th)，主要功能是協(xié)助單核-巨嗜細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫功能，CD8+T淋巴細(xì)胞為抑制性淋巴細(xì)胞(Ts)，可特異性殺傷靶細(xì)胞，因而機(jī)體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞及其比值的大小可作為衡量細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)，其比值上升，提示免疫應(yīng)答的正向調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)，反之提示免疫功能低下[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濕疹1號(hào)有調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的作用，盡管濕疹1號(hào)低劑量組、黃柏膠囊組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但高劑量組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），說(shuō)明濕疹1號(hào)在一定劑量或療程下可能降低CD8+T淋巴細(xì)胞及升高CD4+/ CD8+來(lái)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能紊亂,減輕炎癥損傷。

[1]崔文強(qiáng),徐飛,王明燕,等．急性濕疹血漿CGRP的改變及皮炎平干預(yù)作用的研究[J]．光明中醫(yī),2014,29（6）:1170-1173．

[2] 李麗,甄莉．黃芪對(duì)濕疹大鼠皮損中白細(xì)胞介素-4和干擾素-γ影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)藥物與臨床,2010,10（1）:53-54．

[3] 田靜,李忻紅,朱卉雯,等．健脾養(yǎng)血祛風(fēng)方對(duì)脾虛慢性濕疹模型小鼠皮膚組織水通道蛋白3的影響[J]．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2015,22（7）:47-50．

[4] 趙俊芳,王學(xué)謙,李桂珍,等．雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白[J]．臨床檢驗(yàn)雜志,2011,29（5）:336-338．

[5] 雍磊,程相鐸,李波,等．變應(yīng)性皮膚病患者血清IgE和ECP分析[J]．中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志,2005,21（11）:881-882．

[6] 李春光,王月飛,趙紅曄,等．化濕湯結(jié)合潤(rùn)膚止癢膏對(duì)濕疹小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J]．中國(guó)藥物警戒2015,12（3）:137-139,143．

Effectsof Shizhen Yihao on Immune Function of Spleen-deficiency Type ofGuinea Pig M odelsw ith Acute Eczema

Wang Huanyun1，LiXinhong2，Tian Jing1，Ma Xiande1
1.Liaoning University of TraditionalChinese Medicine,Shenyang 110032,China；2.Affiliated Hospitalof Liaoning University of TraditionalChineseMedicine,Shenyang 110032,China

Objective In order toobserve theeffectsofShizhen Yihaoon serummacrophage cationic protein（ECP）and than analyze its influence on the CD4+,CD8+and the ratio of T cells,and to explore themechanism of the drug in the treatmentof acute eczema of spleen-deficiency．Methods Fifty guinea pigswere randomly divided into 5 groups,namely blank control group,acute eczemaofspleen deficiency in the blank controlgroup,acute eczema ofspleen-deficiency of traditionalChinese medicine in the treatmentof low and high-dosegroup,traditionalChinesemedicine（Huangbaicapsu le）positive controlgroup．Using DNCB smear and diet,fatigue excessive spleen deficiencymethod to establish the guinea pigmodelsofacute spleendeficiency,enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）and flow cytometry for blood ECPand TCD4+,TCD8+detection．Results Compared with the blank control group,the serum ECP in model group was over expressed．Compared with the model group,the expression of ECP in each group was significantly decreased（P＜0．05 or P＜0．01）．Effectof the high dose Chinese traditionalmedicine group was better than that of low dose and Huangbai capsule group,and low dose group and Huangbaicapsule group showed no significantdifference（P＞0．05）．Compared with themodelgroup,the drug group,CD4+T and CD4+/CD8+T lymphocytes increased,and the level of CD8+T decreased,butonly high dose of Chinesemedicine group had significant differenc e （P＜0．05）．Conclusion Shizhen Yihao can effectively inhibit the expression of ECP in skin lesions,and regulate the balance between TCD4+lymphocytesand TCD8+lymphocytes,and regulate the immune function of the body．

Shizhen Yihao；Acute eczema；Eosinophil cationic protein；T lymphocytes

R758．23

：A

：1672-0709（2017）03-0224-03

2016-05-22）

遼寧省教育廳高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：L2012342）；遼寧省中醫(yī)藥學(xué)（專）科能力建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：2011-lnzyxzk-03）

李忻紅，E-mail：13644067465@163．com