清熱利濕飲對(duì)HaCaT細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制分析

孫淑娜，李翔宇，魏海峰，李廣遠(yuǎn)，辛靜昕，紀(jì)云，張曉杰（.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南50000；.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南5055；.中國(guó)農(nóng)業(yè)銀行山東省分行，濟(jì)南5000；.泰山醫(yī)學(xué)院，泰安706）

清熱利濕飲對(duì)HaCaT細(xì)胞衰老的影響及其機(jī)制分析

孫淑娜1，李翔宇1，魏海峰2，李廣遠(yuǎn)3，辛靜昕4，紀(jì)云1，張曉杰1
（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)銀行山東省分行，濟(jì)南250001；4.泰山醫(yī)學(xué)院，泰安271016）

目的 觀察清熱利濕飲對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞衰老的影響，探討其分子作用機(jī)制。方法 使用SA-β-Gal（β-半乳糖苷酶）染色法檢測(cè)清熱利濕飲對(duì)細(xì)胞衰老的影響；BrdU檢測(cè)細(xì)胞DNA合成，Western blot和realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞衰老基因的表達(dá)情況。結(jié)果 與對(duì)照組相比，清熱利濕飲藥物處理可明顯促進(jìn)HaCat細(xì)胞衰老；Western blot結(jié)果示清熱利濕可促進(jìn)p21蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制p21蛋白表達(dá)可緩解清熱利濕飲導(dǎo)致的細(xì)胞衰老。結(jié)論 清熱利濕飲能通過(guò)上調(diào)p21蛋白表達(dá)促進(jìn)HaCaT細(xì)胞衰老。

清熱利濕飲；細(xì)胞衰老；p21

銀屑?。≒soriasis），中醫(yī)稱(chēng)為“白疕”。由于病程長(zhǎng)，纏綿難愈，容易復(fù)發(fā)，大多伴隨終生，對(duì)患者的身心健康及日常生活都帶來(lái)極大傷害。清熱利濕飲是我院皮膚科治療銀屑病的有效中藥方劑。但對(duì)其分子機(jī)制知之甚少。筆者前期發(fā)現(xiàn)清熱利濕飲可抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞增殖[1]。本研究將探討清熱利濕對(duì)HaCaT細(xì)胞衰老的影響，為進(jìn)一步揭

示清熱利濕飲的作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)治療銀屑病的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人永生化表皮細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞株購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶與胎牛血清：Gibco公司。BrdU：Sigma公司。抗BrdU抗體：Sigma公司。Western blot用一抗，siRNA：Santa cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）與TRITC（羅丹明）標(biāo)記的二抗：中衫金橋公司。DAPI，RIPA裂解液，β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司。Trizol，Lipofectamine2000：Invitrogen公司。cNDA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：天根生化科技有限公司。Light Cycler 480 SYBRGreen IMaster：ROCHE公司。

1.2 方法

1.2.1 清熱利濕飲藥液制備 龍膽草6 g，黃芩9 g，柴胡9 g，山梔9 g，生地黃15 g，牡丹皮9 g，當(dāng)歸9 g，金銀花30 g，土茯苓30 g，澤瀉9 g，車(chē)前子15 g，甘草6 g。將上述中藥濃縮成1mL相當(dāng)于1．5 g原中藥材的藥液，過(guò)濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＜?xì)胞培養(yǎng)時(shí)稀釋到相應(yīng)終濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HaCaT細(xì)胞株接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。隔天換液。清熱利濕飲藥物處理組使用終濃度40μg/mL藥液的DMEM培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.3 BrdU摻入實(shí)驗(yàn) 使用含50μmol/LBrdU的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞20min，移除培養(yǎng)基，PBS洗滌后，免疫染色固定液固定，加入2N鹽酸37℃變性30 min，0．1M硼酸鈉中和2次，0．5%Triton-X 100的PBS處理15min，5%BSA室溫封閉1 h，BrdU一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌后加入TRITC二抗37℃1 h，DPAI染細(xì)胞核5min，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot 將藥物處理的HaCaT細(xì)胞使用RIPA裂解液冰上裂解提取蛋白，BCA蛋白定量，取40μg樣品變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉TBS封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光，顯影定影。膠片曝光。

1.2.5 SA-β-Gal染色 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌，免疫染色固定液室溫固定15min，加入SA-β-Gal染色液37℃孵育過(guò)夜，顯微鏡觀察。

1.2.6 Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染siRNA 將細(xì)胞鋪到6孔板中，24 h后細(xì)胞密度達(dá)到約30%。參照說(shuō)明，分別加入適量無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，lipofectamin 2 000轉(zhuǎn)染試劑和siRNA（購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），混勻，室溫放置20min。將配制好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中siRNA終濃度為50 nmol/L。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR 將藥物處理的HaCaT細(xì)胞使用Trizol法裂解提取RNA并參照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系：每10μL反應(yīng)體系包括去離子水4．2μL、Light Cycler 480 SYBR Green ⅠMaster 5μL、cDNA 0．5μL、逆轉(zhuǎn)錄引物0．3μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72度延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Roche LightCycler480自帶分析程序比較不同樣本同一目的基因的表達(dá)變化情況，并進(jìn)行分析。引物序列qGAPDH-F：5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3’，qGAPDH-R：5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’；qCDKN1A（p21）-F：5’-ACATCGCCAAGGAAAAACGC-3’，q CDKN1A（p21）-R：5’-GTCTGTTTCGGTACTGTCATCC-3’。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12．0軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)應(yīng)用t檢驗(yàn)分析評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 清熱利濕飲促進(jìn)HaCaT細(xì)胞衰老 在清熱利濕飲處理細(xì)胞72 h后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，包括細(xì)胞扁平、伸展，體積增大，排列不規(guī)則。SA-β-Gal染色結(jié)果顯示，藥物處理細(xì)胞后，SA-β-Gal染色陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯上調(diào)，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。BrdU摻入結(jié)果則顯示，藥物處理細(xì)胞48 h后，BrdU摻入的陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。這些結(jié)果提示，清熱利濕飲能夠有效抑制HaCaT細(xì)胞DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞衰老。

圖1 清熱利濕飲處理導(dǎo)致HaCat細(xì)胞衰老 使用含40 μg/m L清熱利濕藥液的DMEM或不含藥液的DMEM培養(yǎng)基（對(duì)照組）培養(yǎng)細(xì)胞72 h，在普通光鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照并進(jìn)行SA-β-Gal染色。

圖2 清熱利濕飲處理導(dǎo)致HaCat細(xì)胞DNA合成障礙 使用含40μg/m L清熱利濕藥液的DMEM或不含藥液的DMEM培養(yǎng)基（對(duì)照組）培養(yǎng)細(xì)胞48 h，利用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞DNA復(fù)制情況。

圖3 清熱利濕飲處理導(dǎo)致HaCat細(xì)胞p21表達(dá)上調(diào) 使用含40μg/m L清熱利濕藥液的DMEM或不含藥液的DMEM培養(yǎng)基（對(duì)照組）培養(yǎng)細(xì)胞48 h，收取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot（A）或提取RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（B）。

圖4 清熱利濕飲通過(guò)調(diào)控p21表達(dá)影響細(xì)胞衰老 A.轉(zhuǎn)染干擾p21的siRNA（50 nmol/L）或等量的陰性對(duì)照siRNA 入HaCat細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后換含40μg/m L清熱利濕飲或?qū)φ盏腄MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，收取細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行Western blot分析（A）；轉(zhuǎn)染72 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SA-β-Gal染色（B）或DNA合成檢測(cè)（C）。

2.2 清熱利濕飲促進(jìn)HaCaT細(xì)胞p21表達(dá) p53 和p16在細(xì)胞衰老中具有核心的作用。但HaCaT細(xì)胞存在p53突變和p16缺失。因此，筆者分析了衰老和細(xì)胞周期調(diào)控的重要蛋白 p21的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示p21在藥物處理組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，與之對(duì)應(yīng)，清熱利濕飲處理組細(xì)胞內(nèi)Rb的磷酸化水平明顯下調(diào)，見(jiàn)圖3A。realtime PCR結(jié)果顯示，與蛋白變化類(lèi)似，清熱利濕飲處理組細(xì)胞內(nèi)p21mRNA水平也有明顯上調(diào)，見(jiàn)圖3B。

2.3 清熱利濕飲促進(jìn)HaCaT細(xì)胞衰老依賴(lài)于p21的表達(dá) 為了明確p21表達(dá)上調(diào)在清熱利濕飲促細(xì)胞衰老中的作用。筆者使用siRNA干擾p21的表達(dá)，觀察其對(duì)清熱利濕飲促進(jìn)細(xì)胞衰老的影響。結(jié)果顯示，siRNA能夠有效抑制清熱利濕飲促進(jìn)的HaCat細(xì)胞內(nèi)p21表達(dá)增加，見(jiàn)圖4A，并且干擾p21的表達(dá)能有效抑制清熱利濕飲導(dǎo)致的HaCaT細(xì)胞SA-β-Gal染色比例上調(diào)，見(jiàn)圖4B，和DNA合成障礙，見(jiàn)圖4C，表明降低p21的表達(dá)能夠有效抑制清熱利濕飲促進(jìn)HaCaT細(xì)胞衰老和增殖減慢，清熱利濕飲能夠通過(guò)增加p21的表達(dá)誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞衰老和增殖障礙。

3 討論

銀屑病中醫(yī)病因多端，病機(jī)復(fù)雜，歷代醫(yī)家多從血熱、血瘀、血虛論治。按照傳統(tǒng)中醫(yī)理論，清熱利濕法主治濕熱證，但經(jīng)長(zhǎng)期臨床觀察此法對(duì)銀屑病血熱證及血熱夾瘀證同樣有效。機(jī)體有臨床可見(jiàn)的有形之濕，如皮膚腫脹、水皰、糜爛、流滋，伴神疲肢重，便溏不爽，舌質(zhì)紅，苔黃膩，脈弦數(shù)或濡滑。亦有無(wú)形之濕，即在微觀上出現(xiàn)的“濕”，如丘疹、斑丘疹、紅斑，表面上并無(wú)“濕”象，但病理可見(jiàn)表皮角層內(nèi)或角層下中性粒細(xì)胞構(gòu)成的小膿腫。棘層有顯著的細(xì)胞間水腫，真皮上部有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，乳頭部水腫。可認(rèn)為是無(wú)形之濕。由此可推測(cè)銀屑病中醫(yī)辨證分型中血熱證、血熱夾濕和血熱夾瘀證存在聯(lián)系，血分熱、濕、瘀是3型共同的病理基礎(chǔ)，只是血熱證熱重濕瘀輕；血熱夾濕證濕熱同重而瘀輕；血熱夾瘀證瘀熱同重而濕輕。清熱利濕飲是在經(jīng)方龍膽瀉肝湯基礎(chǔ)上經(jīng)加減變化而來(lái)，龍膽瀉肝湯可清肝膽火，瀉濕熱，經(jīng)化裁后，本方功效與龍膽瀉肝湯已有差異。方中金銀花入氣分和血分，功善清熱解毒，疏散風(fēng)熱。土茯苓，解毒除濕，消腫。上兩味相須為用，使熱毒從氣分和血分而解，熱清毒化，共為君藥。龍膽草上清實(shí)火，下瀉濕熱，黃芩清熱燥濕瀉火解毒，梔子清熱利濕，瀉火解毒，三味共用為臣，加強(qiáng)君藥清熱除濕，涼血瀉火解毒之功。牡丹皮，擅清熱涼血，活血散瘀。澤瀉專(zhuān)利水滲濕泄熱，車(chē)前子甘寒清利，利尿效佳，導(dǎo)濕熱下行，使邪有出路；生地黃為清營(yíng)涼血、養(yǎng)陰生津之要藥。當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝，涼血滋陰，防苦寒傷肝。柴胡輕清升散，與苦寒降瀉藥相配，一升一降，調(diào)暢氣機(jī)，以上諸藥共用為佐藥。甘草緩中和胃，調(diào)和諸藥，是為使藥。全方共奏清熱利濕、涼血解毒，活血祛風(fēng)止癢之效。

一定條件下，細(xì)胞能夠存活并表現(xiàn)出低水平的新陳代謝，出現(xiàn)細(xì)胞周期G1期停滯和不可逆的生長(zhǎng)停滯，這便是細(xì)胞衰老[2]。細(xì)胞衰老與凋亡均是機(jī)體清除損傷細(xì)胞的重要途徑，是生物體生長(zhǎng)發(fā)育和正常功能維持所不可或缺的生命活動(dòng)[3]。由于能有效抑制細(xì)胞增殖，衰老被認(rèn)為是抑制細(xì)胞過(guò)度增生相關(guān)疾病如腫瘤的重要屏障之一[4]。表皮基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖是銀屑病病理生理的重要特征，而抑制細(xì)胞過(guò)度增殖也是治療銀屑病的有效手段[5]。在本研究中，筆者對(duì)清熱利濕飲對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞衰老的影響進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示清熱利濕飲可明顯促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的衰老，這提示促進(jìn)細(xì)胞衰老是清熱利濕飲治療銀屑病的重要機(jī)制之一。

在細(xì)胞衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，p53和p16是關(guān)鍵蛋白，抑制p53和p16可有效緩解如癌基因誘發(fā)的細(xì)胞衰老[6]。但許多研究結(jié)果也證實(shí)，在一定條件刺激下，細(xì)胞也呈現(xiàn)出非依賴(lài)p53和p16的衰老[7]。這時(shí)，p21和p38-MAPK等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞衰老中就扮演著關(guān)鍵的角色。HaCaT細(xì)胞內(nèi)p53基因突變導(dǎo)致其喪失轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，而p16的表達(dá)也有明顯的下調(diào)。筆者的研究結(jié)果顯示，清熱利濕飲能夠上調(diào)HaCaT細(xì)胞內(nèi)p21的表達(dá)，利用siRNA抑制p21能夠有效緩解清熱利濕飲導(dǎo)致的細(xì)胞衰老，提示p53 和p16喪失功能的細(xì)胞中，清熱利濕飲可通過(guò)影響p21的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞衰老。

p21是一重要的抑癌基因，可通過(guò)抑制CDK激酶活性和Rb磷酸化而抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞內(nèi)，p21的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后多水平的精確調(diào)控。本研究顯示，清熱利濕飲處理可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p21mRNA含量升高，提示清熱利濕飲可轉(zhuǎn)錄激活p21的表達(dá)。但具體的作用機(jī)制如何?有研究顯示Chk2在HaCaT細(xì)胞內(nèi)可通過(guò)參與p21的轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響細(xì)胞衰老[8]。清熱利濕飲是否是通過(guò)調(diào)控Chk2上調(diào)p21的轉(zhuǎn)錄從而影響HaCaT細(xì)胞衰老？而在p53具有功能的角質(zhì)形成細(xì)胞中清熱利濕飲是否也具有促細(xì)胞衰老的作用?這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步探討。

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Roleand M echanism ofQingre LishiRecipe in Senescence of HaCaT Cells

Sun Shuna1,LiXiangyu1,WeiHaifeng2,LiGuangyuan3,Xin Jingxin4,JiYun1,Zhang Xiaojie1
1.Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250000,China;2.Shandong University of TraditionalChineseMedicine,Jinan 250355,China;3.Shandong Branch of Agricultural Bank ofChina,Jinan 250001,China;
4.Taishan MedicalUniversity,Taian 271016,China

Objective In order to investigate the effect of Qingre Lishi recipe in the senescence of HaCaT cells,and to analyze itsmolecular actionmechanism.M ethods The effectof Qingre Lishi recipe on cell senescencewas detected using SA-β-Gal staining;the DNA replication was examined through BrdU incorporation assay;gene expression was detected by Western blot and realtime PCR.Results Compared with the control group,Qingre Lishi recipe treatment significantly promoted senescence in HaCaT cells.Western blot showed that Qingre Lishi recipe increased expression of p21 protein. Moreover,inhibition of p21 effectively alleviated the cell senescence caused by Qingre Lishi recipe.Conclusion Qingre Lishi recipe could promote HaCaT cellsenescence by upregulatingexpression ofp21.

Qingre Lishirecipe;Cellularsenescence;p21

R758.5

：A

：1672－0709（2017）03-0220－04

2016-12-12）