大翅薊屬植物提取物對(duì)皮膚屏障功能損傷的修復(fù)作用探討

陳俊杰，唐翠，嚴(yán)明強(qiáng)，沈玲華（.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海004；.上海浦恩生化科技有限公司，上海0006；.嘉法獅（上海）貿(mào)易有限公司，上海00）

·論著·

大翅薊屬植物提取物對(duì)皮膚屏障功能損傷的修復(fù)作用探討

陳俊杰1，唐翠1，嚴(yán)明強(qiáng)2，沈玲華3
（1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200433；2.上海浦恩生化科技有限公司，上海200063；3.嘉法獅（上海）貿(mào)易有限公司，上海201203）

目的 觀察大翅薊屬植物提取物對(duì)皮膚屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響，探討其屏障修復(fù)作用。方法 通過(guò)使用膠帶黏貼的方法，對(duì)離體培養(yǎng)的皮膚造成皮膚屏障功能損傷模型，每隔2 d涂抹大翅薊屬植物提取物，7 d后評(píng)估損傷皮膚的淋巴上皮Kazal型相關(guān)抑制因子（Lympho-epithelial Kazal type related inhibitor，LEKTI），兜甲蛋白（Loricrin，LOR），內(nèi)披蛋白（Involucrin，INV）絲聚合蛋白（Filaggrin，F(xiàn)LG）的表達(dá)情況。結(jié)果 正常皮膚和受損皮膚的LEKTI，LOR，INV，F(xiàn)LG染色均有增強(qiáng)，受損皮膚增強(qiáng)更為明顯。結(jié)論 大翅薊屬植物提取物可以提高皮膚FLG、LOR、INV、LEKTI的表達(dá)，進(jìn)而提高皮膚屏障功能。

皮膚屏障；中間絲聚合蛋白；兜甲蛋白；外皮蛋白；淋巴上皮Kazal型相關(guān)抑制因子

大翅薊屬植物富含黃酮類(lèi)化合物、倍半萜烯及其內(nèi)酯和甾醇類(lèi)化合物等具有生物活性的成分，具有抗腫瘤、抗菌、調(diào)節(jié)心肺功能、愈創(chuàng)等藥理活性。皮膚屏障功能主要位于表皮，表皮分化過(guò)程中涉及的相關(guān)蛋白：中間絲聚合蛋白（Filaggrin，F(xiàn)LG）、兜甲蛋白（Loricrin，LOR）及外皮蛋白（Involucrin，INV），淋巴上皮Kazal型相關(guān)抑制因子（Lympho-epithelial Kazal type related inhibitor，LEKTI），對(duì)于維持皮膚的屏障功能都具有重要的作用，是皮膚屏障功能的重要標(biāo)志物[1-3]。皮膚屏障功能缺陷與多種皮膚疾病有關(guān)。膠帶黏貼是皮膚科常用的研究方法，也是目前公認(rèn)的建立皮膚屏障損傷模型簡(jiǎn)單有效的方法[4]。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定大翅薊屬植物提取物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)提取物）對(duì)人受損皮膚中相關(guān)蛋白FLG、LOR、 INV及LEKTI表達(dá)的影晌，探討其對(duì)表皮屏障功能的修復(fù)作用，從而為臨床上治療皮膚屏障功能相關(guān)疾病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 anti-LEKTI單克隆抗體（clone 1C11G6,ref:sc-32330）購(gòu)自SantaCruz；anti-Involucrin單克隆抗體（clone SY5,ref:sc-21748）購(gòu)自Santa Cruz；anti-Loricrin多克隆抗體（ref:PRB-145）購(gòu)自Covance；anti-filaggrin單克隆抗體（cloneOKTB1,ref: BT 576）購(gòu)自BTI；VIP顯色試劑盒購(gòu)自VECTOR laboratories。

1.2 方法

1.2.1 外植體準(zhǔn)備 皮膚來(lái)源于48歲的做腹部整形術(shù)的白人女性，9例外植體做膠帶黏貼處理，另外9例外植體是正常皮膚。所有外植體保存于有機(jī)外植體介質(zhì)（BEM）中。保存條件為37℃，潮濕，5% CO2。培養(yǎng)液每天更新。具體分組見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組表

1.2.2 角質(zhì)層損傷 用膠帶（3M，550）連續(xù)黏貼10次。

1.2.3 配方應(yīng)用 每2 d（D0，D2，D4，D6）在外植體上涂抹2mg配方。

1.2.4 組織學(xué)取樣 D0，所有外植體取樣并分割為二，一半-80℃冷凍，另一半甲醛固定。D7，各批次樣品經(jīng)過(guò)同樣的方法取樣處理。

1.2.5 組織學(xué) 經(jīng)甲醛固定的樣本24 h后，用石蠟浸潤(rùn)脫水，包埋，嵌入，切片，與急速冷凍的硅烷化載玻片結(jié)合。

冷凍的樣本經(jīng)切片后，與硅烷化載玻片結(jié)合。使用顯微照相系統(tǒng)照相存儲(chǔ)。

1.2.6 熒光免疫 LEKTI免疫染色：石蠟包埋樣本，使用anti-LEKTI單克隆抗體免疫染色LEKTI，生物素/鏈霉親和素加強(qiáng)信號(hào)，異硫氰酸熒光素（FITC）顯示。原子核由碘化丙啶復(fù)染。

Involucrin免疫染色：石蠟包埋樣本，使用anti-Involucrin單克隆抗體免疫染色I(xiàn)nvolucrin，生物素/鏈霉親和素加強(qiáng)信號(hào)，VIP顯色試劑盒顯示。原子核由Masson復(fù)染。

Loricrin免疫染色：冰凍組織樣本，使用anti-Loricrin多克隆抗體免疫染色Loricrin，生物素/鏈霉親和素加強(qiáng)信號(hào)，異硫氰酸熒光素（FITC）顯示。原子核由碘化丙啶復(fù)染。

FLG免疫染色：冰凍組織樣本，使用antifilaggrin單克隆抗體免疫染色filaggrin，生物素/鏈霉親和素加強(qiáng)信號(hào)，異硫氰酸熒光素（FITC）顯示。原子核由碘化丙啶復(fù)染。

2 結(jié)果

2.1 LEKTI 7 d后，LEKTI染色結(jié)果顯示，正常皮膚陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯變化，提取物組熒光染色增強(qiáng)；受損皮膚陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組輕微減弱，提取物組熒光增強(qiáng)明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 LOR 7 d后，正常皮膚和受損皮膚LOR染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯變化，受損皮膚提取物組染色明顯增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

2.3 FLG 7 d后，正常皮膚和受損皮膚FLG染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組無(wú)明顯變化，陽(yáng)性對(duì)照組和提取物組熒光均明顯增加。見(jiàn)圖3。

2.4 INV 7 d后，正常皮膚和受損皮膚INV染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組無(wú)明顯變化，陽(yáng)性對(duì)照組和提取物組染色均明顯增加。見(jiàn)圖4。

3 討論

大翅薊主產(chǎn)于新疆烏魯術(shù)齊、古爾班通古特沙漠（瑪納斯）、伊犁谷地（伊寧）、準(zhǔn)噶爾阿拉套地區(qū)（塔城等），生于山坡、荒地或水溝邊。在土耳其、伊朗等國(guó)，大翅薊有悠久的藥用歷史。在新疆當(dāng)?shù)?，維吾爾族醫(yī)生用大翅薊果實(shí)來(lái)治療皮膚病。中醫(yī)認(rèn)為大翅薊“酸涼，入肝經(jīng)，涼血止血”，“內(nèi)服，煎湯，3～ 9 g”，“全草供藥用，有止血之功效”[5-6]。大翅薊屬植物的化學(xué)成分和藥理活性研究報(bào)道始見(jiàn)于上世紀(jì)60年代，近40年來(lái)國(guó)外學(xué)者對(duì)該屬植物的化學(xué)成分、藥理活性進(jìn)行了大量的研究。2000年，伊朗學(xué)者Koochek等[7]研究發(fā)現(xiàn)大翅薊的不同藥用部位的醇提物對(duì)手術(shù)造模形成的創(chuàng)傷有愈創(chuàng)作用，其中花的70%乙醇提取物促進(jìn)傷口愈合的功效最強(qiáng)。

圖1 LEKTI（免疫熒光染色×400）

圖2 LOR（免疫熒光染色×400）

圖3 FLG（免疫熒光染色×400）

圖4 INV（免疫組化染色×400）

皮膚屏障功能主要位于角質(zhì)層。磚墻模型是現(xiàn)在公認(rèn)的表皮角質(zhì)層屏障結(jié)構(gòu)模型。其主要包括角質(zhì)細(xì)胞及其角化包膜（磚）和細(xì)胞間的脂質(zhì)雙分子層（泥）。兜甲蛋白、內(nèi)披蛋白、絲聚合蛋白等相互交聯(lián)形成角化包膜，角質(zhì)細(xì)胞鑲嵌在其中構(gòu)成了皮膚的物理屏障結(jié)構(gòu)。

FLG是表皮角質(zhì)層內(nèi)的一種親水性蛋白，其前體是絲聚蛋白原（Profilaggrin），主要存在于顆粒層。當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞從顆粒層向角質(zhì)層分化時(shí)，顆粒層的絲聚蛋白原迅速去磷酸化成為可溶性的FLG。單體的FLG與角蛋白絲結(jié)合，使其變得更為致密，同時(shí)隨著角質(zhì)細(xì)胞成熟脫水，F(xiàn)LG分解生成大量的天然保濕因子，這對(duì)保持皮膚的水合作用和皮膚屏障至關(guān)重要[8]。Filaggrin還可以調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞增殖，增加其對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)的易感性[9]，因此Filaggrin在表皮細(xì)胞分化中也起著重要作用，是KC終末分化的重要標(biāo)志之一。它的異常表達(dá)可以削弱皮膚屏障功能，導(dǎo)致多種皮膚病的發(fā)生。

LOR、INV是2種重要的終末分化蛋白，兩者皆參與角質(zhì)化套膜的組成，在維持皮膚屏障功能中發(fā)揮著重要作用。LOR是角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化的一種疏水性蛋白，開(kāi)始表達(dá)在顆粒層，占角化套膜蛋白量的80%，是角化細(xì)胞套膜的主要加固蛋白[10]。INV是角質(zhì)化套膜的另一重要組份，位于角質(zhì)化套膜的外層，形成角質(zhì)化套膜的基本骨架，與含有-OH的神經(jīng)酰胺共價(jià)結(jié)合，由此將脂質(zhì)基質(zhì)和角化細(xì)胞致密地連接起來(lái)，共同形成皮膚的屏障結(jié)構(gòu)[11]。

LEKTI是一種新型的絲氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛存在于皮膚及黏膜、扁桃體、胸腺等器官。在表皮中，LEKTI主要在棘層上部及顆粒層表達(dá)[12]。它可以抑制絲氨酸蛋白酶對(duì)角質(zhì)層橋粒蛋白的降解作用，提高角質(zhì)層細(xì)胞間的黏合力，從而起到保護(hù)皮膚屏障的作用[13]。

筆者的體外研究表明，大翅薊屬植物提取物可以提高FLG、LOR、INV、LEKTI的表達(dá)，從而提高表皮屏障的“磚墻”結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)“磚墻”結(jié)合力，進(jìn)而提高皮膚屏障功能。但這其中的具體機(jī)制還不清楚，尚有待進(jìn)一步研究。

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（收稿:2016-09-03）

·消息·

Repair EffectofOnopordon Extracton the Damaged Skin Barrier Function

Chen Junjie1,Tang Cui1,Yan Mingqiang2,Shen Linghua3
1.School of Life Sciences Fudan University,Shanghai200433,China;2.Shanghai Puen Biotech Co.Ltd.,Shanghai200063, China;3.GattefosseChina Trading Co.Ltd.,Shanghai201203,China

Objective In order to study the expression of four skin barrier related proteins induced by the onopordon extract and explore its repairment.Methods The extractwasapplied topically every two daysatD0,D2,D4 and D6 on the normal and damaged skin which was performed by tape stripping in vitro,the expression of lympho-epithelial Kazal type related inhibitor(LEKTI),loricrin(LOR),involucrin(INV),and filaggrin(FLG)were investigated by immunohistochemistry after 7 days.Results The staining intensity of four proteins increased in normal and damaged skin,especially the damaged skin. Conclusion Onopordon extract can improve the expression of FLG,LOR,INV,LEKTI,and improve the skin barrier function.

Skin barrier;Filaggrin;Loricrin;Involucrin;Lympho-epithelialKazal type related inhibitor

R758.1

：A

：1672－0709（2017）03-0193－04