葛花配方顆粒的UPLC指紋圖譜研究Δ

劉夢(mèng)云，江潔怡，畢曉黎1，#，李素梅，李養(yǎng)學(xué)（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣州 510405；.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥配方顆粒生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣州 510095）

葛花配方顆粒的UPLC指紋圖譜研究Δ

劉夢(mèng)云1＊，江潔怡2，畢曉黎1，2#，李素梅2，李養(yǎng)學(xué)2（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥配方顆粒生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣州 510095）

目的：建立葛花配方顆粒的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜。方法：采用UPLC法。色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為264 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣體積為1 μL。以鳶尾苷元為參照物，測(cè)定10批葛花配方顆粒的UPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）進(jìn)行共有峰指認(rèn)和相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：10批葛花配方顆粒的UPLC圖譜有14個(gè)共有峰，相似度均＞0.90。經(jīng)驗(yàn)證，10批樣品UPLC圖譜與對(duì)照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建UPLC指紋圖譜可為葛花配方顆粒的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

葛花配方顆粒；超高液相色譜法；指紋圖譜；鳶尾苷元

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish UPLC fingerprint of Gehua formula granules.METHODS：UPLC method were adopted. The determination was performed on Zorbax Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water at the flow rate of 0.5 mL/min.The detection wavelength was set at 264 nm，column temperature was 25℃，and the sample size was 1 μL. Using tectorigenin as reference substance，UPLC chromatograms of 10 batches of Gehua formula granules were determined.The common peak identification and similarity evaluation were conducted by TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：14 common peaks were identified in UPLC chromatograms of 10 batches of Gehua formula granules and similarities were all higher than 0.90.UPLC chromatograms of 10 batches of samples were in good agreement with control fingerprint.CONCLUSIONS：Established UPLC fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of Gehua formula granules.

KEYWORDSGehua formula granules；UPLC；Fingerprint；Tectorigenin

葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi或甘葛藤P.thomsonii Benth.的干燥花，別名葛條花，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，葛花味甘、性涼、歸脾胃經(jīng)，具有解酒醒脾、解肌退熱、生津止渴、上瀉治痢之功效[1-2]。葛花配方顆粒是由葛花飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒等現(xiàn)代制備工藝方法制成的一種新型制劑，具有免煎易服、易儲(chǔ)存、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也失去了飲片原有的生物形態(tài)特征[3]。因此，只憑借單一指標(biāo)成分已無(wú)法說(shuō)明中藥多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)，而且也無(wú)法進(jìn)行飲片真?zhèn)味ㄐ缘蔫b別和質(zhì)量?jī)?yōu)劣的評(píng)價(jià)。中藥指紋圖譜技術(shù)是一種綜合性的、可量化的鑒定技術(shù)，它具有整體性、系統(tǒng)性、穩(wěn)定性等特點(diǎn)，能較為全面地反映中藥飲片或中藥制劑的內(nèi)在整體質(zhì)量，而今已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

目前，對(duì)葛花飲片的質(zhì)量控制方面研究較多的是采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定黃酮類化合物的含量等[4-5]，筆者尚未見(jiàn)對(duì)葛花配方顆粒質(zhì)量進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。與HPLC法比較，超高效液相色譜法（UPLC）是一種具有分析時(shí)間短、分離效果好、靈敏度和分辨率較高以及試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)的液相色譜法[6-9]。本研究采用UPLC法建立了葛花配方顆粒的指紋圖譜分析方法，對(duì)10批葛花配方顆粒進(jìn)行研究并得出其指紋圖譜共有模式，旨在為快速、有效地評(píng)價(jià)葛花配方顆粒的整體質(zhì)量提供科學(xué)分析方法；同時(shí)，也為葛花配方顆粒臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1290型UPLC儀，包括四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、在線脫氣機(jī)、柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

葛花配方顆粒[廣東佛山一方制藥有限公司，批號(hào)：1506110、1504711、1504710、1505032、1504605、1504022、1505013、1505020、1505013、1506015（S1～S10），規(guī)格：2.0 g/袋]；鳶尾苷對(duì)照品（批號(hào)：S-026-150421，純度：＞98%）、鳶尾苷元對(duì)照品（批號(hào)：S-027-150421，純度：＞98%）均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～4.5 min，0→10%A；4.5～6.0 min，10%→20%A；6.0～7.5 min，20%→25%A；7.5～9.0 min，25%→30%A；9.0～12 min，30%→40%A）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取鳶尾苷對(duì)照品2.39 mg、鳶尾苷元對(duì)照品2.48 mg，置于同一50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成鳶尾苷、鳶尾苷元質(zhì)量濃度分別為47.8、49.6 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品約1.0 g，精密加50%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1506110）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以鳶尾苷元峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1506110）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以鳶尾苷元峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：1506110）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以鳶尾苷元峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，14個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD＜3.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜的生成及共有峰的指認(rèn)

2.4.1 UPLC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)10批樣品的UPLC圖譜進(jìn)行分析，得UPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 10批樣品UPLC疊加指紋圖譜Fig 1 UPLC superposed fingerprints of 10 batches of samples

圖2 樣品UPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 UPLC control chromatograms of samples

2.4.2 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004A版）對(duì)10批樣品的UPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，10批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.983、0.998、0.999、0.997、1.000、0.997、0.995、0.999、1.000、0.999。其中，9號(hào)峰為蔦尾苷，14號(hào)峰為蔦尾苷元。本試驗(yàn)以14號(hào)（鳶尾苷元）峰為對(duì)照峰確定了葛花配方顆粒樣品的14個(gè)指紋共有峰，并通過(guò)相似度計(jì)算軟件得到10批葛花配方顆粒的對(duì)照?qǐng)D譜及各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度，結(jié)果相似度均＞0.9，表明各批葛花配方顆粒樣品的色譜峰整體上基本一致、相關(guān)性良好。各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表1、表2。

表1 10批樣品UPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 1 Relative retention time of common peaks for UPLC fingerprints of 10 batches of samples

表2 10批樣品UPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 2 Relative peak area of common peaks for UPLC fingerprints of 10 batches of samples

3 討論

3.1 供試品溶劑的選擇

結(jié)合葛花藥材中所含的化學(xué)成分，本研究分別以70%乙醇溶液、乙醇、甲醇、50%甲醇溶液為溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果以50%甲醇溶液為溶劑所得的色譜峰峰形較好、分離度適中，所得的色譜能最大限度地反映葛花配方顆粒的特征。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)指紋圖譜進(jìn)行全波長(zhǎng)的掃描，并結(jié)合三維色譜圖綜合考慮了不同波長(zhǎng)下色譜峰的分離度、數(shù)目、基線等因素，最后選用色譜峰信息較為豐富的264 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

本研究分別考察了乙腈-水、甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)及其不同比例下的色譜行為，結(jié)果以乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，所得的色譜峰峰形較好、基線較平穩(wěn)。

3.4 檢測(cè)方法的優(yōu)化

本試驗(yàn)首先通過(guò)HPLC儀對(duì)葛花配方顆粒的色譜條件進(jìn)行摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分析時(shí)間為40 min左右。為了縮短分析時(shí)間，后期采用UPLC法對(duì)其色譜條件進(jìn)行優(yōu)化并建立了10批葛花配方顆粒指紋圖譜共有模式，結(jié)果分析時(shí)間縮短至10 min內(nèi)，大大提高了工作效率，同時(shí)節(jié)約了試劑、降低了成本。

綜上所述，本研究所建UPLC指紋圖譜可為葛花配方顆粒的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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Study on UPLC Fingerprint of Gehua Formula Granules

LIU Mengyun1，JIANG Jieyi2，BI Xiaoli1，2，LI Sumei2，LI Yangxue2（1.School of Graduate，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China；2.Guangdong Engineering Technology Research Institute of TCM/Guangdong Key Laboratory of TCM Research and Development/Key Laboratory of Key Production Technology for TCM Formula Granule，Guangzhou 510095，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2978-03

2016-08-09

2016-10-11）

（編輯：張 靜）

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015B070701010）

＊碩士研究生。研究方向：中藥制劑分析。E-mail：liumengyu n218@163.com

#通信作者：主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，博士后。研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。電話：020-83501292。E-mail：2335128654@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.27