抑制YAP對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及p53、Fra-1表達的影響

李書萍，李 波，張 陽

(長沙市第四醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410006)

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)高發(fā)疾病，死亡率占女性腫瘤第二位。流行病調(diào)查顯示，截止到2018年全球?qū)m頸癌發(fā)病率為0.13%，死亡率較高，約80%發(fā)病人群來自經(jīng)濟落后國家[1]。宮頸癌發(fā)生發(fā)展是多種因素共同導(dǎo)致，主要與感染高危型人頭瘤病毒(HPV)加快腫瘤細(xì)胞增殖加快病情發(fā)展有關(guān)[2]。p53是腫瘤抑制因子，惡性腫瘤產(chǎn)生與p53基因突變相關(guān)，p53修復(fù)功能被削弱時會轉(zhuǎn)化為致癌基因加快腫瘤細(xì)胞活性惡化病情。外源性增加野生型p53可促進對宮頸癌細(xì)胞凋亡，合并放療等治療方式可降低腫瘤的生物活性[3]。Fra-1是位于機體染色體11q 3.1上的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)ra-1定位于細(xì)胞核具有調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的作用。在胰腺癌及肺癌中發(fā)現(xiàn)Fra-1過表達狀態(tài)，在宮頸癌組織表達低于癌旁組織[4]。

YAP即Yes相關(guān)性蛋白，具有調(diào)節(jié)器官發(fā)育及加快腫瘤形成等作用。YAP蛋白在多種惡性腫瘤表達上調(diào)，是評價腫瘤獨立預(yù)后的指標(biāo)之一。近些年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)HIppo-YAP對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。正常情況下YAP蛋白受嚴(yán)格控制的，YAP激活后即可造成非控制性增殖和凋亡抑制，進而導(dǎo)致惡性腫瘤產(chǎn)生。YAP是一個候選致癌因子，在宮頸癌患者存在HPV感染，腫瘤細(xì)胞快速增殖時YAP和磷酸化的YAP蛋白顯著升高，當(dāng)將YAP基因被敲除后，腫瘤細(xì)胞增殖被抑制，說明YAP可能是宮頸癌細(xì)胞HPV感染的重要介質(zhì)[5]，但是具體研究機制還不得而知。本文通過外源性干預(yù)YAP蛋白觀察其對細(xì)胞生物活性及p53、Fra-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源、主要試劑與儀器 宮頸癌Hela/SiHa細(xì)胞株均購自上海信裕，本文研究符合我院倫理規(guī)定。主要試劑與儀器YAP-shRNA 及空載體質(zhì)粒(中國上海吉瑪公司)；p53抗體(中國深圳豪地華拓生物科技)；FRA1抗體(中國上海士峰生物)；DMEM培養(yǎng)、FBS、0.25%胰酶消化液(中國中盛溯源生物)；CCK8試劑、二甲基亞砜(DMSO)(上海蔚霆生物)；流式細(xì)胞儀(中國常州必達科生物科技)；Transwell 小室(中國北京優(yōu)尼康生物)；蛋白垂直電泳系統(tǒng)(中國北京君意東方)；倒置生物顯微鏡(中國蘇州景通儀器)；RT-PCR試劑(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將低溫冷藏的Hela細(xì)胞株、SiHa細(xì)胞株，快速移入37℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養(yǎng)基，5% CO2常溫保存，貼壁生長，次日更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長85%時，0.25%胰蛋白酶消化24 h，1∶3傳代，取對數(shù)細(xì)胞1.0× 106/mL進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)生長Hela細(xì)胞株、SiHa細(xì)胞株，接種6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%，把體積為4 μL脂質(zhì)體和體積為200 μL緩沖液依次加入到無菌的EP管中，采用Lipofectamine2000將YAP-shRNA，YAP-shRNA-NC轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入6孔板,轉(zhuǎn)染5 h后，繼續(xù)培養(yǎng)，Hela細(xì)胞株、SiHa細(xì)胞株均分為3組，宮頸癌組(無轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞)，NC組(宮頸癌組+YAP-shRNA-NC)及YAP-shRNA組(宮頸癌組+YAP-shRNA)。

1.2.3 RT-PCR檢測3組細(xì)胞YAP、p53及FRA1基因水平 檢測Hela細(xì)胞株、SiHa細(xì)胞株YAP表達，檢測Hela細(xì)胞株p53及FRA1基因，嚴(yán)格按照PCR儀器說明書進行操作。各組宮頸癌細(xì)胞放入離心管中，1 000 r/min分離20 min，采用Trizol法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA進行轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得反體系，條件為：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃終點。每個細(xì)胞設(shè)置6個復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 CCK8檢測Hela細(xì)胞活力 取生長良好的對數(shù)生長細(xì)胞1.0× 106/mL的Hela細(xì)胞，進行Hela細(xì)胞活力實驗，加入0.25%胰蛋白酶消化后，將Hela細(xì)胞制成懸浮液，放入離心管中，按照1 000 r/min分離5 min后，計算細(xì)胞數(shù)。按照每孔800個細(xì)胞，接種6孔板，飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)1、2、3 d后，加入20 μL，10%的CCK-8溶液，450 nm下計算每孔吸光值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測Hela凋亡率 取生長良好的對數(shù)生長細(xì)胞1.0× 106/mL的Hela細(xì)胞接種到6孔板中，常規(guī)飽和濕度下進行培養(yǎng)，加入0.25%消化酶，離心機2 000 r/min運轉(zhuǎn)10 min，加入1 mL PI染色進行染色，40～60 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測Hela凋亡程度。

1.2.6 Transwell小室法檢測Hela細(xì)胞遷移能力 在培養(yǎng)室中防放置Transwell小室，上層加入Hela細(xì)胞懸液，下層加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，將100 μg/mL TMP溶液加入至下室，37.5 ℃，培養(yǎng)24 h后，取出小室，棉簽拭去殘留Hela細(xì)胞，純凈水沖洗3次，甲醛固定15 min，顯微鏡×400倍下計算Hela細(xì)胞遷移數(shù)量，隨機選擇4個視野，取實驗3次的平均值。

1.2.7 免疫印跡檢測p53、Fra-1蛋白水平 細(xì)胞濃度及接種數(shù)量同上，加入0.25%消化液，放入離心管中分離上清液，提取蛋白，然后煮沸、變性，進行電泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，5 min/次，分別加入p53、Fra-1，GAPDH抗體(1∶500)、二抗(1∶2 000)，雜交60 min后，純凈水反復(fù)沖洗3次，將膜浸入ECL液體中，檢測獲取圖象。

2 結(jié)果

2.1 RT-PC檢測Hela、SiHa細(xì)胞株中YAP基因水平 NC組與宮頸癌組Hela細(xì)胞株中YAP基因水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，YAP-shRNA組中Hela細(xì)胞株中YAP基因水平均低于NC組與宮頸癌組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 Hela、SiHa細(xì)胞株中YAP基因水平比較(n=6)

2.2 Hela細(xì)胞增殖能力比較 宮頸癌組和NC組Hela細(xì)胞吸光度(A)值在24、48、72 h比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞吸光度(A)值均低于宮頸癌組和NC組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并呈現(xiàn)時間依賴性(見表3)。

表3 各組Hela細(xì)胞增殖能力比較(n=6)

2.3 各組Hela細(xì)胞凋亡率比較 宮頸癌組、NC組和YAP-shRNA組Hela細(xì)胞凋亡率分別為(6.21±0.50、7.14±1.18、65.45±1.30)%，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6221.000，P<0.001)。宮頸癌組和NC組Hela細(xì)胞凋亡率組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞凋亡率高于宮頸癌組(P<0.001)和NC組(P<0.001)(見圖1)。

*：與宮頸癌組比較，P<0.05；&：與NC組比較，P<0.05。圖1 各組Hela細(xì)胞凋亡率比較

2.4 Hela細(xì)胞遷移數(shù)目比較 宮頸癌組、NC組和YAP-shRNA組Hela細(xì)胞遷移數(shù)目分別為(85.1±12.03、83.9±13.5、41.39±7.50)個，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.645，P<0.001)。宮頸癌組和NC組Hela細(xì)胞遷移數(shù)目組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞遷移數(shù)目低于宮頸癌組(P<0.001)和NC組(P<0.001)(見圖2)。

*：與宮頸癌組比較,P<0.05；&：與NC組比較,P<0.05。圖2 各組Hela細(xì)胞遷移數(shù)目比較

2.5 Hela細(xì)胞p53、Fra-1蛋白水平比較 宮頸癌組、NC組和YAP-shRNA組Hela細(xì)胞p53蛋白表達水平分別為(1.03±0.17、0.98±0.16、2.23±0.26)，F(xiàn)ra-1蛋白表達水平分別(0.74±0.08、0.72±0.06、1.12±0.15)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fp53蛋白=99.610，P<0.001；FFra-1蛋白=338.300，P<0.001)。宮頸癌組和NC組Hela細(xì)胞p53、Fra-1蛋白水平組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞p53蛋白水平高于宮頸癌組(P<0.001)和NC組(P<0.001)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞Fra-1蛋白水平高于宮頸癌組(P<0.001)和NC組(P<0.001)(見圖3)。

*：與宮頸癌組比較，P<0.05；&：與NC組比較,P<0.05。圖3 各組Hela細(xì)胞p53、Fra-1蛋白水平比較

2.6 Hela細(xì)胞p53、Fra-1 mRNA水平比較 宮頸癌組、NC組和YAP-shRNA組Hela細(xì)胞p53mRNA表達水平分別為(1.00±0.00、0.97±0.05、1.68±0.21)，F(xiàn)ra-1mRNA表達水平分別(1.00±0.00、0.95±0.08、1.37±0.18)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Fp53 mRNA=337.600，P<0.001；FFra-1 mRNA=292.800，P<0.001)。宮頸癌組和NC組Hela細(xì)胞p53mRNA、Fra-1mRNA水平組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞p53mRNA水平高于宮頸癌組(P<0.001)和NC組(P<0.001)，YAP-shRNA組Hela細(xì)胞Fra-1mRNA水平高于宮頸癌組(P<0.001)和NC組(P<0.001)(見圖4)。

*：與宮頸癌組比較,P<0.05；&：與NC組比較,P<0.05。圖4 各組Hela細(xì)胞p53、Fra-1 mRNA水平比較

3 討論

YAP蛋白首次在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與TEAD信號通路相結(jié)合后能抑制細(xì)胞凋亡。Hippo-YAP作為重要的信號傳到信號通路，在腫瘤疾病中發(fā)揮重要生物學(xué)作用[6-8]。已經(jīng)證實YAP蛋白在胃癌、卵巢癌及肺癌中表達上調(diào)，YAP-shRNA或體外干預(yù)能夠通過抑制YAP蛋白而抑制腫瘤復(fù)制，改善病情[9]。Hela細(xì)胞生物學(xué)來源與美國女性的宮頸癌細(xì)胞系相比，具有增殖、遷移快的特點，常應(yīng)用與宮頸癌實驗研究。細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞分裂是主要增殖方式，細(xì)胞凋亡屬于主動過程，激活基因通過維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而調(diào)控細(xì)胞活性。在腫瘤狀態(tài)下，YAP蛋白失效增加本身活性參與腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展[10-11]。裴峰等[12-13]表示通過體外建立宮頸癌細(xì)胞株實驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除YAP蛋白時宮頸癌增殖及遷移能力降低。本文證實YAP-shRNA組Hela細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，增殖及遷移數(shù)目均降低，說明YAP-shRNA能夠抑制宮頸癌發(fā)展。沉默YAP蛋白后期誘導(dǎo)生長因子及凋亡抑制信號能力減弱，腫瘤抑制因子呈現(xiàn)高表達，從而減少宮頸癌細(xì)胞惡性增殖及遷移，細(xì)胞活性顯著降低。YAP是Hippo通路的轉(zhuǎn)錄因子，其磷酸化后與相關(guān)因子結(jié)合可促進下游因子表達，提高腫瘤細(xì)胞的生物行為，因此抑制YAP蛋白的表達可有減緩腫瘤的發(fā)展。

p53是位于染色體17號短臂上的蛋白因子，進化相對保守，p53作用多樣，能夠修復(fù)損傷細(xì)胞，加快細(xì)胞滅活，抑制多種親癌信號的表達[14]。p53可通過誘導(dǎo)相應(yīng)編碼的蛋白活性調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物活性。p53主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)，在正常機體內(nèi)p53具有監(jiān)測基因組完整性作用，具有修復(fù)細(xì)胞基因損傷等特點，當(dāng)p53基因發(fā)生突變時，會導(dǎo)致細(xì)胞癌變。相關(guān)文獻證實，Hela細(xì)胞株中p53蛋白激活后誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，p53表達激活后Hela細(xì)胞增殖分裂，減少Hela細(xì)胞從G期向S期擴增，改善宮頸癌病情[15]。本文證實YAP-shRNA組p53表達升高，產(chǎn)生原因在于抑制YAP后P53抑制腫瘤細(xì)胞分化能力增強，P53表達升高誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。在肺癌細(xì)胞中，YAP蛋白活性表達下調(diào)時可激活p53基因表達，p53參與了YAP蛋白抑制肺癌細(xì)胞凋亡的過程[16]。在肝癌細(xì)胞中YAP蛋白能夠發(fā)揮蛋白執(zhí)行功能，能夠上調(diào)p53水平發(fā)揮腫瘤抑制作用，進而加快肝癌細(xì)胞凋亡[17]。在食管癌Eca-109細(xì)胞中干擾YAP能夠顯著升高p53水平、降低食管癌細(xì)胞增殖分裂[18]。

宮頸癌中Fra-1及p53表達下調(diào)，而MDM2活性增加，體外實驗表示，當(dāng)敲除MDM2后，HPV病毒p53活性升高[19]。Henken等[20]研究發(fā)現(xiàn)過表達Fra-1能夠降低MDM2水平。FRA1具有促進腫瘤增殖、分化、侵襲和凋亡等生物學(xué)功能，F(xiàn)ra-1在許多腫瘤中異常表達并發(fā)揮相關(guān)作用，F(xiàn)ra-1在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、鼻咽癌、甲狀腺癌和其他癌癥中過度表達腫瘤，但是宮頸癌中Fra-1的表達降低[21]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中沉默YAP蛋白能夠通過下調(diào)Fra-1水平而抑腫瘤細(xì)胞分裂增殖[22]。這與本文研究結(jié)果不同，其原因在于，F(xiàn)ra-1在不同腫瘤疾病作用機制存在差異性。但已有文獻證實[23-24]，過表達Fra-1能夠通過上調(diào)p53活性而減少Hela細(xì)胞的能量代謝及體外分裂，但是具體研究機制還需要進行后續(xù)實驗。本文Hela細(xì)胞YAP-shRNA后，F(xiàn)ra-1表達升高，減少Hela生物學(xué)效應(yīng)，減少腫瘤發(fā)生對于臨床治療有一定的參考價值。

本文未建立YAP蛋白過表達組，討論中YAP與Fra-1之間的研究機制還需要進一步完善，對實驗結(jié)果可能產(chǎn)生偏差，后期本課題組會加強和其他相關(guān)研究單位合作，增加樣本量，細(xì)化實驗內(nèi)容，為宮頸癌臨床研究提供實踐依據(jù)。綜上所述，YAP在宮頸癌細(xì)胞中存在高表達，沉默后能夠降低宮頸癌Hela細(xì)胞株增殖及遷移能力，加快細(xì)胞凋亡率，這可能與激活P53及Fra-1基因相關(guān)。