水稻Ds標(biāo)記的曲穗突變體的分子鑒定

焦翠翠+郭妍妍+吳均章+孫丙耀

摘要：在經(jīng)過Ac/Ds基因標(biāo)簽系統(tǒng)獲得的水稻Ds插入突變株系中得到1株水稻曲穗突變體植株，對該突變體進(jìn)行初步表型觀察，結(jié)果顯示，成熟期突變體植株的稻穗有一定的彎曲；同時采用TAIL-PCR方法獲得曲穗突變體Ds側(cè)翼基因序列，結(jié)果證明含有1個Ds插入位點(diǎn)；對Ds側(cè)翼序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Ds插入在2個基因之間，其下游是編碼類泛素特異性蛋白酶1（Ulp1）的基因，該基因與穗的形成有一定的關(guān)聯(lián)；利用RACE技術(shù)擴(kuò)增Ds插入位點(diǎn)下游基因的cDNA的3′端序列，序列比對發(fā)現(xiàn)，Ds插入前后其下游基因序列無變化。預(yù)測Ds的插入影響了Ulp1基因的啟動子區(qū)域，進(jìn)而影響水稻的花序生長發(fā)育形成穗彎曲水稻突變體。本研究結(jié)果可能在穗型的遺傳及發(fā)育以及改良優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻方面有一定的作用。

關(guān)鍵詞：水稻；穗型；遺傳；發(fā)育；改良；Ulp1；Ac/Ds；3′-RACE技術(shù)

中圖分類號： S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）11-0026-03

在20世紀(jì)五六十年代，我國利用半矮化育種及水稻雜種優(yōu)勢技術(shù)，水稻產(chǎn)量有很大的提高，但近年來，水稻產(chǎn)量一直處于停滯不前的狀態(tài)[2]。株型育種是水稻超高產(chǎn)遺傳育種的重要方向，而穗型與水稻株型密切相關(guān)，是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一。因而，通過對穗型的研究進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量是很多育種專家所重視的問題。在水稻發(fā)育生物學(xué)研究及實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，與彎曲穗型水稻比較而言，直立穗型能夠改善灌漿結(jié)實(shí)期群體結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)抗倒伏性，提高群體生長率等生理生態(tài)特性，但大多數(shù)的研究只是簡單地運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)對其性狀進(jìn)行簡單考察，對直立穗型和彎曲穗型分子機(jī)制方面的研究較少[3-5]。闡明相關(guān)穗彎曲與穗直立基因的遺傳機(jī)理，為水稻育種研究提供參考依據(jù)，這也是研究優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻的未來研究方向。本研究對水稻Ds插入突變株系中出現(xiàn)的曲穗突變體進(jìn)行表型觀察，并擴(kuò)增Ds側(cè)翼序列進(jìn)行基因的初步鑒定，在此基礎(chǔ)上采用RACE擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增Ds標(biāo)記基因的cDNA序列，分析Ds的插入對水稻穗型變化影響的分子機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

曲穗突變體水稻來源于水稻品種Dongjin （Oryza sativa L. var. japonica cv. Dongjin）的Ac/Ds插入突變體系，由韓國國立慶尚大學(xué)Han Chang-deok教授實(shí)驗(yàn)室提供，委托江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所對種子進(jìn)行播種并栽培。在生長期期間多次觀察其表型，并取田間栽培的野生型與突變體水稻完整植株，帶回實(shí)驗(yàn)室取其幼嫩的新鮮組織，提取植物基因組DNA和RNA用于后續(xù)試驗(yàn)研究。抽穗期間，突變體較野生型水稻抽穗較早并在該期間株高有顯著差異；成熟期，突變體與野生型植株穗彎曲程度存在明顯差異（圖1）。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)轉(zhuǎn)座子Ds的序列特點(diǎn)，在Ds的3′末端設(shè)計(jì)引物SP1、SP2、SP3，分別與隨機(jī)簡并引物AD1、AD2搭配，進(jìn)行TAIL-PCR的3輪擴(kuò)增；以TAIL-PCR擴(kuò)增獲得的Ds側(cè)翼水稻序列設(shè)計(jì)3′-RACE擴(kuò)增特異引物。除了RACE的通用引物外，其他引物均采用Primer Premier 6.0和Oligo 7軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見表1。

1.2.2突變體水稻Ds側(cè)翼序列的擴(kuò)增采用TaKaRa植物DNA提取試劑盒，對野生型和突變體水稻的單株葉片DNA進(jìn)行分離提??；采用核酸微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop 2000）對所提取的DNA進(jìn)行濃度和純度檢測，選取純度較高的DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)模板；

突變體基因組DNA進(jìn)行Ac/Ds元件插入檢測，確認(rèn)含有Ds插入后進(jìn)行Ds側(cè)翼序列擴(kuò)增；以曲穗突變體基因組作為模板，以隨機(jī)簡并引物AD1和AD2分別與特異引物SP1、SP2、SP3搭配進(jìn)行TAIL-PCR的3輪反應(yīng)擴(kuò)增Ds的側(cè)翼序列；根據(jù)引物設(shè)計(jì)特點(diǎn)，TAIL-PCR的2、3輪反應(yīng)產(chǎn)物大小應(yīng)相差36 bp，然后對第3輪反應(yīng)特異條帶進(jìn)行割膠，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0回收、純化特異擴(kuò)增產(chǎn)物；將其產(chǎn)物連接到PMD19-T Vector進(jìn)行TA克隆，16 ℃條件下連接過夜；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取10個單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；將菌液PCR驗(yàn)證為陽性克隆的菌液，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，獲得Ds側(cè)翼序列。

1.2.3Ds標(biāo)記基因cDNA的RACE擴(kuò)增對野生型和曲穗突變體的不同組織，利用Trizol法提取總RNA。采用TaKaRa公司Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒，建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其作為RACE擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

第1輪RACE反應(yīng)體系（50 μL）包括5 μL的10×Buffer、3 μL的dNTPs （2.5 mmol/L）、1.5 μL引物US、0.3 μL的引物UL、1.5 μL的1輪特異引物、0.25 μL rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）以及約200 ng cDNA模板。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個循環(huán)。第2輪反應(yīng)中，以通用引物NUP與第2輪的特異引物搭配，為了得到理想的結(jié)果，再以第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板重復(fù)第2輪反應(yīng)。退火溫度依據(jù)特異引物與NUP的解鏈溫度（Tm）值確定。依據(jù)預(yù)測的RACE目標(biāo)條帶大小以及2、3輪結(jié)果比對，選取第3輪反應(yīng)中合適的電泳遷移條帶，經(jīng)膠回收、TA克隆后，將菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4突變體中Ds的染色體定位、插入位點(diǎn)以及Ds標(biāo)記基因的生物信息學(xué)分析將測序獲得的Ds側(cè)翼序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行在線比對（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），確定突變體基因組上Ds的染色體定位和基因位點(diǎn)。將測序獲得的cDNA的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行在線比對，分析Ds插入前、后標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1曲穗突變體基因組上Ds的插入位點(diǎn)

對曲穗突變體進(jìn)行基于TAIL-PCR技術(shù)的Ds側(cè)翼序列的擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。以突變體基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增獲取得到Ds側(cè)翼序列，通過NCBI-BLAST在線比對和分析發(fā)現(xiàn)，Ds插入在3號染色體上（Sequence ID：dbj|AP014959.1|），插入在2個基因之間，下游為類泛素特異性蛋白酶1（Ulp1）基因（圖3），該基因與穗的形成有一定的關(guān)聯(lián)，由此推測Ds的插入會對下游基因Ulp1的表達(dá)有影響。

2.2Ds標(biāo)記基因cDNA末端序列的分析

TAIL-PCR擴(kuò)增的Ds側(cè)翼序列分析表明，Ds插入在2個基因之間，但下游基因?qū)λ氲男纬捎嘘P(guān)聯(lián)，以此為基礎(chǔ)，提取下游基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)2對不同的RACE特異引物，并分別以野生型和曲穗突變體水稻總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板進(jìn)行RACE擴(kuò)增反應(yīng)并對其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析（圖4），第1對特異性引物組合RACE1-1和RACE1-2中，曲穗突變體第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物有1條約為400 bp的主條帶，第2對特異性引物組合RACE2-1和RACE2-2中，野生型和突變體2、3輪擴(kuò)增產(chǎn)物都有1條約為800 bp的主條帶，經(jīng)序列測定800 bp左右的條帶為特異擴(kuò)增產(chǎn)物。測序結(jié)果顯示，Ds插入前后，下游編碼Ulp1的基因序列無變化。預(yù)測Ds的插入位置對Ulp1基因的啟動子結(jié)構(gòu)有一定的影響，有研究表明Ulp1調(diào)節(jié)SUMO/Smt3代謝途徑，而SUMO/Smt3途徑對細(xì)胞分化及細(xì)胞生長、DNA的復(fù)制與修復(fù)、核蛋白導(dǎo)入和靶向以及植物開花時期有重要作用[6-7]。

3討論與結(jié)論

玉米Ac/Ds雙因子系統(tǒng)屬于DNA轉(zhuǎn)座元件hAT超家族的成員，近年來運(yùn)用Ac/Ds雙元件系統(tǒng)構(gòu)建水稻突變體庫已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，日本、美國、韓國、荷蘭、澳大利亞等不同的國家都有科學(xué)家致力于水稻突變體庫的構(gòu)建，這為高通量突變體篩選、功能基因組學(xué)研究以及突變體庫的構(gòu)建和育種奠定了基礎(chǔ)。同時，利用水稻基因組中大量的序列信息去闡明基因的生物學(xué)功能、鑒定以及克隆相關(guān)農(nóng)藝性狀的基因，對改良水稻的生產(chǎn)性能和品質(zhì)具有重要意義。

穗型是水稻的重要形態(tài)特征之一，與水稻產(chǎn)量水平有著密切的聯(lián)系，是水稻理想株型育種和栽培研究關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。有研究表明，直立穗型和彎曲穗型在直鏈淀粉含量、不同部位粒型分布等方面都有區(qū)別[9-10]，在實(shí)際生產(chǎn)中由于直立穗型群體的實(shí)粒數(shù)、千粒質(zhì)量明顯高于彎曲穗型群體，特別是直立穗群體的二次枝梗實(shí)粒率比彎曲型群體高10%以上，以及直立穗更能充分利用光照條件進(jìn)行光合作用，更傾向于直立穗型的培育[11]。已有的研究大部分從形態(tài)及生理方面著手討論彎曲穗型與直立穗型的不同點(diǎn)，但彎曲穗型與直立穗型在分子機(jī)制方面的差異有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于控制水稻穗型基因的研究顯示，定位在第2條染色體短臂端nDel標(biāo)記EJ-4和dCAPs標(biāo)記EJ-5之間的 FUWA 基因，定位在第6號染色體短臂端SSR標(biāo)記的Rm253和RM19623之間的EP4基因，定位在9號染色體的qPE9-1基因，在粒長、粒寬、穗彎曲、穗直立等穗型方面進(jìn)行調(diào)控[2，5，12-13]。本研究結(jié)果顯示，曲穗突變體的Ds插入在2個基因之間，其下游基因?yàn)閁lp1的基因，Ds標(biāo)記基因cDNA末端序列的分析顯示曲穗突變體水稻與野生型水稻序列無變化，但表型觀察結(jié)果證明兩者在穗型彎曲度上確實(shí)存在差異，Ac/Ds雙元件檢測也確實(shí)有Ds元件的插入，TAIL-PCR結(jié)果也證明含有1個Ds的拷貝，說明Ds的插入對突變體穗的形成有影響。Ds插入位置下游基因Ulp1在穗型發(fā)育過程中有一定的調(diào)節(jié)作用。穗型的調(diào)控涉及許多不同的生化途徑，包括泛素化途徑，近年來關(guān)于控制穗部性狀相關(guān)基因陸續(xù)被克隆出來，如控制穗型粒寬、粒質(zhì)量編碼E3泛素連接酶的GW2基因可能參與降解促進(jìn)細(xì)胞分裂的蛋白的過程，進(jìn)而對水稻穎殼、粒質(zhì)量和產(chǎn)量方面進(jìn)行控制，如編碼核定位蛋白的GW5基因，通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)控制穗型粒寬、粒質(zhì)量[14-15]。水稻穗部性狀是由多基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，另外已經(jīng)克隆的水稻穗型基因還包括D2、GS3、GS5、GW8、TAW1等基因[16-20]，隨著測序技術(shù)的發(fā)展和分子標(biāo)記的應(yīng)用以及突變體的挖掘，已克隆出來的控制穗部性狀的基因揭示了粒穗調(diào)控的相關(guān)機(jī)制，也為利用分子育種手段改良品種奠定了一定的基礎(chǔ)。但是，Ulp1參與的泛素化調(diào)解途徑以及在穗型調(diào)控的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步確認(rèn)。

另外，本研究對獲得的Ulp1基因沒有進(jìn)行表達(dá)譜的分析，在后續(xù)研究中運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)得到該基因在水稻不同組織的表達(dá)差異，進(jìn)一步分析Ds插入是否會對Ulp1基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。

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