GC-MS、RP-HPLC 法測(cè)定奇亞籽中脂溶性成分及氨基酸含量

李曉嬌，何忠梅，*，鄭京玉，祝洪艷，趙巖，張連學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省人參工程技術(shù)創(chuàng)新中心，吉林長(zhǎng)春130118）

GC-MS、RP-HPLC 法測(cè)定奇亞籽中脂溶性成分及氨基酸含量

李曉嬌1，2，何忠梅1，2，*，鄭京玉1，2，祝洪艷1，2，趙巖1，2，張連學(xué)1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林省人參工程技術(shù)創(chuàng)新中心，吉林長(zhǎng)春130118）

分析奇亞籽中脂溶性成分并建立一種柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測(cè)奇亞籽中游離氨基酸及總氨基酸的含量。采用氣質(zhì)聯(lián)用的方法對(duì)奇亞籽中脂溶性成分進(jìn)行分析，采用高效液相色譜法，以異硫氰酸苯酯進(jìn)行柱前衍生，采用梯度洗脫，于254 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)21種氨基酸含量。揮發(fā)油中鑒定出化學(xué)成分14個(gè)，其中亞麻酸的含量最高可達(dá)83.41%。21種氨基酸在0.005 0 mmol/L～3.250 0 mmol/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2≥0.999 0）。21種游離氨基酸的平均加樣回收率在93.68%～102.36%之間，RSD在0.91%～2.76%之間（n=6）；水解氨基酸的平均加樣回收率在94.86%～105.73%之間，RSD在0.75%～2.83%之間（n=6）。奇亞籽脂溶性成分主要為脂肪酸，其中含量最高的為O-mega3多不飽和脂肪酸α-亞麻酸，柱前衍生反向高效液相色譜法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，適用于奇亞籽中氨基酸含量的測(cè)定。

奇亞籽；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）；反相高效液相色譜（RP-HPLC）；脂溶性成分；氨基酸

近年來(lái)隨著人們生活水平的不斷提高，健康已經(jīng)成為人類(lèi)前進(jìn)與發(fā)展的主要目標(biāo)。真正的健康不是依靠藥物來(lái)維持，而是通過(guò)科學(xué)的營(yíng)養(yǎng)搭配來(lái)起到最主要的作用。而奇亞籽作為一種新型“超級(jí)食品”，越來(lái)越受到大家的關(guān)注。奇亞籽為唇形科鼠尾草屬芡歐鼠尾草（Salvia Hispania L.）的種子，原產(chǎn)于墨西哥南部和瓜地馬拉北部[1]，食用歷史可追溯到公元前3500年[2]。研究表明，奇亞籽富含的多不飽和脂肪酸、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分在抗氧化、降血脂、改善心血管等方面起到了重要作用[3-4]。其中多不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜的重要成分，具有促進(jìn)脂類(lèi)分解、提高機(jī)體免疫、預(yù)防心血管疾病等功能[5]，另外氨基酸不僅是合成蛋白質(zhì)的原料，還具有調(diào)控基因表達(dá)、調(diào)節(jié)組織生長(zhǎng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝等重要作用[6]。在2014年中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布的第10號(hào)關(guān)于批準(zhǔn)塔格糖等6種新食品原料的公告中，奇亞籽作為一種新型食品原料進(jìn)入了國(guó)人的視線。為了確保其安全性和有效性，本文首次采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)奇亞籽脂溶性成分進(jìn)行分析并用柱前衍生反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法對(duì)奇亞籽中21種氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，旨在為奇亞籽在我國(guó)的進(jìn)一步研究利用提供合理性依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

奇亞籽：北京蔻奇亞國(guó)際貿(mào)易有限公司，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張連學(xué)教授鑒定為芡歐鼠尾草（Salvia Hispania L.）的種子；21種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；色譜乙腈：美國(guó)Fisher有限公司；水：娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

1260高效液相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技公司；BSA224S分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；全新氣流式超微粉機(jī)：欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司；KQ-600KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵：鞏義市英峪儀器廠；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；DZF6020真空干燥器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；氨基酸水解管：北京康農(nóng)科技發(fā)展有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 脂溶性成分分析

2.1.1 奇亞籽脂溶性成分制備

將奇亞籽粉碎并過(guò)60目篩，取50 g奇亞籽粉末于燒杯中，加入石油醚500 mL，于35℃條件下超聲提取兩次，每次30 min，合并濾液于70℃水浴蒸干，得到黃色油狀物，計(jì)算奇亞籽脂溶性成分含量為31.1%。取少量奇亞籽脂溶性成分于5 mL離心管，加入適量CaCl2，在65℃條件下放置1h，使其徹底干燥。在該樣品中加入250 μL硅烷化試劑雙（三甲基硅烷）三氟乙酰胺[Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA]，75℃衍生化1.5 h。

2.1.2 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：HP-35ms毛細(xì)管柱（30.0m×0.25mm× 0.25 μm）；載氣為He，流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL；分流比60∶1。

測(cè)試條件：進(jìn)樣口溫度280℃，柱溫60℃，保持1 min，10℃/min升溫至180℃，保持1min，再以20℃/min升溫至280℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）源，電壓70 eV；掃描范圍20 amu～100 amu，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)N IST05。

2.2 氨基酸含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

采用 Ultimate Amino Acid氨基酸色譜專用柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35℃，波長(zhǎng)254 nm。流動(dòng)相A：乙腈-水（80：20，體積比）；流動(dòng)相B：醋酸鈉緩沖溶液（pH 6.5）-乙腈（93∶7，體積比）。線性梯度洗脫條件為：0 min，0%A；7 min，3.5%A；10 min，4.0%A；15 min，6.5%A；18 min，11.0%A；22 min，13.4%A；34 min，30%A；37 min，68%A；42 min，100%A；49 min，100%A；52 min，0%A。流速1.0 mL/min。

2.2.2 溶液的配制

2.2.2.1 衍生試劑配制

衍生試劑A：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻，4℃保存；衍生試劑B：取異硫氰酸苯酯100 μL，加乙腈8 mL，混勻，4℃保存。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液的配制與衍生

稱取一定質(zhì)量的天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、絲氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys-Cys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、賴氨酸（Lys），加0.1 mol/L鹽酸超聲溶解，配制成除天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸質(zhì)量濃度分別為3.25、3.11、3.24 mmol/L外，其他氨基酸濃度為2.5 mmol/L的混合氨基酸對(duì)照品溶液，4℃保存。

精確吸取混合氨基酸對(duì)照品溶液400 μL，置于5 mL離心管中，加入衍生試劑A和B各200 μL，搖勻，靜置1 h，加入正己烷800 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取6 μL進(jìn)行色譜分析。

2.2.2.3 供試品溶液的配制與衍生

1）游離氨基酸供試品溶液的制備

精密稱定奇亞籽樣品粉末2.0 g，加入50%乙醇溶液200 mL，超聲提取兩次，每次30 min，合并濾液于80℃水浴揮至近干，用純凈水定容至10 mL。取1 mL提取液，置于5 mL離心管中，加入衍生試劑A 100 μL，衍生試劑B100μL，搖勻，靜置1h，加入正己烷400μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取6 μL進(jìn)行色譜分析。

2）總氨基酸供試品溶液的制備

精密稱定奇亞籽樣品粉末1.0 g，加入6 mol/L的鹽酸水溶液10 mL、1%的苯酚1 mL，抽真空，重復(fù)3次，于110℃烘箱中水解24 h，過(guò)濾得水解液，水解液于80℃水浴揮干，加入適量純凈水超聲溶解，并用3 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值近中性，最后用純凈水定容至10 mL。吸取奇亞籽樣品定容液1 mL于5 mL離心管中，加入衍生試劑A 100 μL，衍生試劑B 100 μL，搖勻，靜置1 h，加入正己烷400 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取6 μL進(jìn)行色譜分析。

2.2.3 線性關(guān)系考察

分別將“2.2.2.2”項(xiàng)下的混合氨基酸對(duì)照品溶液稀釋為原來(lái)的1、3/4、1/2、1/4、1/8、1/20、1/50、1/100、1/500倍，并按操作方法進(jìn)行衍生，取6μL進(jìn)行色譜分析。以各氨基酸峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，濃度（x，mmol/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，可得18種氨基酸的檢測(cè)濃度在0.0050mmol/L～2.5000mmol/L范圍內(nèi)，天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的檢測(cè)濃度分別在0.006 5 mmol/L～3.250 0 mmol/L、0.006 2 mmol/L～3.110 0 mmol/L、0.006 5 mmol/L～3.240 0 mmol/L范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。21種氨基酸的線性回歸方程及R2值見(jiàn)表1。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

取混合氨基酸對(duì)照品溶液400 μL，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法衍生后連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果：21種氨基酸峰面積的RSD在0.26%～1.93%之間（n=6），表明儀器精密度良好。

表1 21種氨基酸的線性關(guān)系Table 1 Linear regression equation of the 21 kinds of amino acids

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2.3”項(xiàng)下奇亞籽供試品溶液1 mL，衍生后分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果：奇亞籽中21種氨基酸峰面積的RSD為0.48%～2.02%（n=6）；表明奇亞籽供試品溶液在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批奇亞籽樣品6份，按“2.2.2.3”項(xiàng)下方法制備游離氨基酸和總氨基酸的供試品溶液并衍生后，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算氨基酸含量。結(jié)果：在奇亞籽中，21種游離氨基酸百分含量的RSD值在1.01%～2.33%之間（n=6），測(cè)定總氨基酸的21種氨基酸百分含量的RSD在0.59%～2.51%之間（n= 6）表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn)

2.2.7.1 游離氨基酸回收率試驗(yàn)

取樣品1.0 g，精密稱定，共取6份，分別加入混合氨基酸對(duì)照品適量（1 mL），按“2.2.2.3”項(xiàng)下1）游離氨基酸檢測(cè)方法分別提取、衍生、進(jìn)樣，平行6次，計(jì)算各氨基酸的回收率。結(jié)果：21種游離氨基酸的平均回收率在93.68%～102.36%之間，RSD在0.91%～2.76%之間（n=6）。

2.2.7.2 總氨基酸回收率試驗(yàn)

取樣品0.5 g，精密稱定，共取6份，分別加入混合氨基酸對(duì)照品適量（2 mL），按照“2.2.2.3”項(xiàng)下2）總氨基酸檢測(cè)方法分別提取、衍生、進(jìn)樣，平行6次，計(jì)算各氨基酸的回收率。結(jié)果：21種總氨基酸的平均回收率在94.86%～105.73%之間，RSD在0.68%～2.73%之間（n=6）。

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

2.3.1 奇亞籽脂溶性成分測(cè)定結(jié)果

對(duì)奇亞籽脂溶性成分的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 奇亞籽脂溶性成分GC-MS分析結(jié)果Fig.1 Analysis of the liposoluble constituent of chia seeds by GC-MS

奇亞籽脂溶性成分組成見(jiàn)表2。

表2 奇亞籽脂溶性成分組成Table 2 The components of the liposoluble constituent of chia seeds by GC-MS

奇亞籽脂溶性成分測(cè)定結(jié)果如圖1和表2所示，脂溶性成分主要為亞麻酸，含量最高可達(dá)83%。亞麻酸是一種ω-3系列多不飽和脂肪酸，目前研究主要存在于深海魚(yú)油中。

2.3.2 奇亞籽種氨基酸檢測(cè)結(jié)果

按“2.2”項(xiàng)下方法制備21種氨基酸混合對(duì)照品溶液、奇亞籽供試品溶液、空白溶液，取上述溶液各6 μL進(jìn)樣，分別測(cè)定并計(jì)算其游離氨基酸和總氨基酸含量，色譜圖見(jiàn)圖2。

奇亞籽中游離和水解氨基酸的種類(lèi)和含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 奇亞籽中游離和水解氨基酸的種類(lèi)和含量測(cè)定結(jié)果（x±s）Table 3 Species and content of the free amino acids and hydrolyzed amino acids in chia seeds

從表3中得出，奇亞籽中檢測(cè)到的游離氨基酸總量為：548.27 μg/g；總氨基酸總量為：25 903.81 μg/g。奇亞籽中檢測(cè)到游離氨基酸種類(lèi)為17種，其中含7種人體必需氨基酸；總氨基酸種類(lèi)為19種，其中含8種人體必需氨基酸。

圖2 奇亞籽氨基酸HPLC分析結(jié)果Fig.2 Analysis of the amino acids of chia seeds by HPLC

3 討論

本文采用GC-MS法從奇亞籽脂溶性成分中共分析出14種成分，其中含量最高的為ω-3-亞麻酸，占脂溶性成分的84.41%。多項(xiàng)研究表明，經(jīng)常食用或?qū)ⅵ?3多不飽和脂肪酸作為飲食補(bǔ)充劑可以帶來(lái)許多健康益處，包括預(yù)防心血管疾病，高血壓以及炎癥性疾病等[7-8]。與亞麻酸相比，ω-6-亞油酸的來(lái)源更廣泛。研究表明，攝入過(guò)多的ω-6系列多不飽和脂肪酸可能導(dǎo)致促進(jìn)炎癥的發(fā)生，并進(jìn)一步降低機(jī)體免疫力[9]。奇亞籽中的亞麻酸可以提高飲食中ω-3/ω-6比例，且可以轉(zhuǎn)化成二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）。DHA有腦黃金之稱，是大腦發(fā)育必不可少的不飽和脂肪酸，目前DHA與EPA的來(lái)源主要是海藻和深海魚(yú)油[10-11]，但是這兩種來(lái)源提煉成本高，而奇亞籽含有已知自然資源中最高比例的ω-3-亞麻酸[12]。目前氨基酸的測(cè)定主要包括氨基酸自動(dòng)分析儀分析法、高效液相色譜法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]和紫外檢測(cè)法等，其中應(yīng)用最廣的就是高效液相色譜法。有研究報(bào)道通過(guò)氨基酸分析儀對(duì)奇亞籽18種氨基酸含量進(jìn)行了測(cè)定，但是并未檢測(cè)其游離氨基酸含量，無(wú)法全面地反映奇亞籽中氨基酸的含量[15]。本文通過(guò)RP-HPLC法測(cè)得奇亞籽中游離氨基酸含量為：548.27 μg/g、總氨基酸總量為：25 903.81 μg/g。其中含量最高的為天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。其中天冬氨酸和谷氨酸能夠改善心肌缺血、促進(jìn)有氧代謝的恢復(fù)，在心肌保護(hù)中起到了重要的作用[16]。精氨酸是目前發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)功能最多的氨基酸，其在細(xì)胞分裂、傷口復(fù)原和分泌激素等方面均起著重要的作用，而且能夠提高機(jī)體免疫力并促進(jìn)肌肉合成[17]。由此可得，奇亞籽有很大的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用。

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收稿日期：2016-11-25

Determination the Contents of Liposoluble Constituent and Amino Acids in Chia Seeds by GC-MS，RP-HPLC Methods

LI Xiao-jiao1，2，HE Zhong-mei1，2，*，ZHENG Jing-yu1，2，ZHU Hong-yan1，2，ZHAO Yan1，2，ZHANG Lian-xue1，2
（1.College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.Technology Innovation Center of Jilin Ginseng Project，Changchun 130118，Jilin，China）

To investigate the liposoluble constituent and determinate the contents of 21 kinds of free and hydrolyzed amino acids in chia seeds by pre-column derivatization reversed phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）.The liposoluble constituent in samples were identified and determined by gas chromtography-mass spectrometry（GC-MS）.The samples were derived with phenyl isothiocyanate and detected by RP-HPLC.The contents of 21 kinds of free and hydrolyzed amino acids in chia seeds were determined by gradient elution chromatography at the wavelength 254 nm.Fourteen compounds were separated in the liposoluble constituent of chia seeds，and the content of linolenic acid could up to 83.41%.There was a good linear relationship of the 21 kinds of amino acids in the range of 0.0050 mmol/L-3.2500 mmol/L（the coefficients of correlation were all over 0.9990）.The average recoveries of 21 kinds of free amino acids were 93.68%-102.36%（RSD=0.91%-2.76%，n=6）；while the average recoveries of 21 kinds of hydrolyzed amino acids were 94.86%-105.73%（RSD=0.75%-2.83%，n=6）.The main component in the liposoluble constituent of chia seeds was unsaturated fatty acid，while the content of O-mega3-linolenic acid was hightest.The methodology validation showed that the method of pre-column derivatization RP-HPLC was suitable for determination of free and hydrolyzed amino acids in chia seeds.

chia seeds；gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）；reversed phase high performance liquid chromatography（RP-HPLC）；liposoluble constituent；amino acids

2016-11-20

李曉嬌（1989—），女（漢），碩士，研究方向：植物成分分析及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

*通信作者：何忠梅，女，副教授，研究生導(dǎo)師，博士，主要從事植物藥有效成分及其作用機(jī)制研究工作。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.036