Zometa對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-9、TIMP-1及COX-2表達(dá)的影響

冷華平 段永壯 李寬寬 錢華兵

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Zometa對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-9、TIMP-1及COX-2表達(dá)的影響

冷華平 段永壯 李寬寬 錢華兵

目的 探討唑來(lái)膦酸(Zometa)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-9、TIMP-1及COX-2表達(dá)情況的影響。方法 應(yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，研究Zometa對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS的影響；應(yīng)用WB和qRT-PCR，研究Zometa對(duì)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)COX-2、MMP-9和TIMP1蛋白和mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 Zometa抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，且這些影響都存在劑量依賴性；經(jīng)不同濃度Zometa處理后，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)COX-2、MMP-9 蛋白和mRNA表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸降低，TIMP-1 蛋白mRNA表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸升高，且都存在劑量依賴性。結(jié)論 Zometa通過(guò)調(diào)節(jié)COX-2、MMP-9和TIMP1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來(lái)影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，可作為治療惡性骨腫瘤的藥物，且對(duì)患者預(yù)后情況的改善有一定的價(jià)值。

Zometa；骨肉瘤細(xì)胞；MMP-9；TIMP-1；COX-2

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1224～1228)

骨腫瘤1種是臨床上常見(jiàn)的惡性骨性腫瘤，其中骨肉瘤的發(fā)病率和死亡率居原發(fā)性惡性骨腫瘤之首。腫瘤的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散是人類癌癥死亡率高的主要原因之一，并且對(duì)癌癥的治療產(chǎn)生嚴(yán)重阻礙。僅使用具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的治療劑可能對(duì)骨腫瘤無(wú)效，因此，抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力已經(jīng)成為評(píng)估抗癌藥物的重要標(biāo)準(zhǔn)。MMP-9和COX-2表達(dá)的誘導(dǎo)作用與骨腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，能促進(jìn)腫瘤侵襲和增殖，因此MMP-9和COX-2表達(dá)的抑制作用在癌癥治療中起關(guān)鍵作用。Zometa(唑來(lái)膦酸)是第三代二膦酸鹽，它是二膦酸鹽家族成員之一，可以降低骨骼并發(fā)癥(骨骼相關(guān)事件，SREs)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度[1-2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Zometa對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中MMP-9、TIMP-1及COX-2表達(dá)情況的影響，分析Zometa對(duì)骨腫瘤疾病的治療及預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人骨肉瘤細(xì)胞U2OS購(gòu)于上海復(fù)祥生物科技有限公司，凍存在本實(shí)驗(yàn)室，以進(jìn)行后續(xù)的復(fù)蘇，作為靶細(xì)胞使用。將細(xì)胞維持在含有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)，100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)定

應(yīng)用MTT測(cè)定來(lái)評(píng)估Zometa對(duì)U2O細(xì)胞活力的影響。將U2OS和Saos2細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種在96孔培養(yǎng)板中，并用Zometa(sigma Aldrich，USA)(0、20、40、60和80 μmol/L)處理或保持未處理(Ctrl組)72 h，在含有5%CO2的潮濕環(huán)境中于37 ℃下孵育。 隨后，使用MTT測(cè)定(5 mg/ml MTT)評(píng)估細(xì)胞活力。使用Tecan Sunrise Elisa-Reader(Tecan Group，Ltd，Mannedorf，Switzerland)在490 nm的測(cè)試波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

1.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

U2OS細(xì)胞在96孔板中以5×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度培養(yǎng)，并用Zometa(0、20、40、60和80 μmol/L)處理或保持未處理(對(duì)照)24 h。將細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3次，加入75%乙醇于4 ℃下過(guò)夜。用PBS洗滌固定的細(xì)胞3次，用10 μl RNA酶在37 ℃下孵育30 min，用10 μl PI進(jìn)行染色，然后在黑暗中4 ℃孵育30 min。應(yīng)用FACScan流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。應(yīng)用ModFit LT軟件(Verity Software House，USA)進(jìn)行凋亡細(xì)胞的百分比。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

使用BioCoatTMMatrigelTM侵襲室進(jìn)行細(xì)胞侵襲測(cè)定。Matrigel涂層在實(shí)驗(yàn)前于DMEM培養(yǎng)基中水化30 min。將懸浮在0.5 ml無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞(5×104)加入到Matrigel上腔中。用不同濃度Zometa(0、20、40、60和80 μmol/L)處理1 h后，將含有50nM TPA 0.5 ml的無(wú)血清培養(yǎng)基加入到底部孔。然后將腔室孵育24 h。孵育后，用棉簽將上室細(xì)胞移出，遷移的細(xì)胞用含有0.2%結(jié)晶紫色粉末的2%乙醇染色。在光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計(jì)侵襲的細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)

細(xì)胞劃痕修復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞遷移測(cè)定。將細(xì)胞(5×104)接種在24孔培養(yǎng)皿中直至達(dá)到90%整合。細(xì)胞保持在無(wú)血清培養(yǎng)基中12 h。使用移液管尖小心地劃傷單層細(xì)胞。PBS洗滌除去細(xì)胞碎片，將細(xì)胞置于無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后將遷移的細(xì)胞用冷的75%甲醇吹動(dòng)30 min，并用PBS洗滌3次。在0和24 h拍攝培養(yǎng)物，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移到受傷區(qū)域的數(shù)量。

1.6 蛋白免疫印跡分析

應(yīng)用WB分析檢測(cè)Zometa對(duì)MMP-9、COX-2、TIMP-1蛋白的表達(dá)水平的影響。在37 ℃ 5%CO2的潮濕環(huán)境中，Zometa(0、20、40、60和80 μmol/L)處理U2OS細(xì)胞24 h，之后使用RIPA蛋白提取試劑(Beyotime)裂解細(xì)胞，從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。在4 ℃下12 000×g離心10 min后，通過(guò)10%SDS-PAGE分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Sigma)上。將膜在PBS和5%脫脂乳中封閉1 h，并用針對(duì)MMP-9、COX-2、TIMP-1的一抗(Cell Signaling Technology)將膜在4 ℃孵育過(guò)夜。將膜用HRP綴合的二抗(Cell Signaling Technology)在室溫下孵育1 h。β-tubulin蛋白表達(dá)作為內(nèi)參。應(yīng)用Quantity One軟件(Life Technologies)評(píng)估相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.7 熒光定量實(shí)時(shí)PCR(Quantitative realtime-PCR，qRT-PCR)

采用qRT-PCR檢測(cè)Zometa對(duì)MMP-9、COX-2、TIMP-1 mRNA的表達(dá)水平的影響。在37 ℃ 5%CO2的潮濕環(huán)境中，Zometa(0、20、40、60和80 μmol/L)處理U2OS細(xì)胞24 h，應(yīng)用TRIzol試劑(Invitrogen)從細(xì)胞提取總RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green(Takara)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。以β-Actin作為內(nèi)參。應(yīng)用ABI7500系統(tǒng)(Applied Biosystems)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。用熔解曲線分析來(lái)確定PCR產(chǎn)物的特異性。用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)的倍數(shù)變化。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min，95 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 20.00進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表示方式為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，Zometa組在20、40、60、80 μmol/L Zometa處理后，細(xì)胞增殖能力顯著降低(*P<0.05)。提示，Zometa抑制骨肉瘤細(xì)胞U2OS的增殖，且存在劑量依賴性。

2.2 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，用不同劑量Zometa(20～80 μmol/L)處理后，Zometa組細(xì)胞凋亡顯著增強(qiáng)(*P<0.05)(圖2)。

2.3 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞遷移和侵襲的影響

如圖3所示，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，Zometa組中細(xì)胞遷移(圖3A)和侵襲(圖3B)能力均顯著降低(P<0.05)，且這種降低隨Zometa濃度增加而改變。

圖1 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響

圖2 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響

2.4 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞中COX-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，不同濃度Zometa(0、20、40、60和80 μmol/L)處理U2OS細(xì)胞24 h后，COX-2(4A)、MMP-9(4B)蛋白表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)濃度為40、60和80 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組比較有顯著差異性(*P<0.05)。而在用不同濃度Zometa處理后，TIMP-1蛋白表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸升高，且存在劑量依賴性(圖4C)。

2.5 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞中COX-2、MMP-9、TIMP-1mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，不同濃度Zometa(0、20、40、60和80 μmol/L)處理U2OS細(xì)胞24 h后，COX-2(圖5A)、MMP-9(圖5B) mRNA表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸降低，TIMP-1 mRNA(圖5C)表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸升高，且都存在劑量依賴性。

3 討論

惡性腫瘤通常歸因于其侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，僅使用具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力的治療劑可能對(duì)骨腫瘤無(wú)效。臨床上，癌癥患者出現(xiàn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移，則意味著死亡率的增加。

Zometa(唑來(lái)膦酸)是第三代二膦酸鹽，屬于二膦酸鹽家族成員之一，可以降低骨骼并發(fā)癥(骨骼相關(guān)事件，SREs)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度[3]。與其它二膦酸鹽相比，它更方便使用，且更有效，能進(jìn)一步減少SREs的發(fā)生[4-5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Zometa具有直接的抗腫瘤活性[6]。已研究227名女性患有乳腺癌骨轉(zhuǎn)移(主要是溶骨性病變)使Zometa(注射輸入15 min，每4周一次，持續(xù)1年)的作用，發(fā)現(xiàn)與安慰劑組相比，Zometa治療組患者SREs顯著降低[7]。本實(shí)驗(yàn)中，但使用不同濃度Zometa培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞，觀察m肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Zometa抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，且這些影響都存在劑量依賴性。

腫瘤的轉(zhuǎn)移性是1個(gè)多步驟的過(guò)程，涉及癌細(xì)胞與原發(fā)性腫瘤的分離，以及它們遷移、粘附和入侵到淋巴管或血液中。血管外滲是由細(xì)胞外蛋白酶作用所介導(dǎo)，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs )在這一過(guò)程中發(fā)揮著急作用?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的鋅依賴性內(nèi)肽酶。實(shí)驗(yàn)研究表明，MPP-2涉及與各種生理和病理狀況相關(guān)的骨重建過(guò)程，包括骨轉(zhuǎn)移形成[8]。腫瘤細(xì)胞可以分泌和/或誘導(dǎo)破骨細(xì)胞釋放蛋白消解酶MMP-2和MMP-9到骨微環(huán)境中，降解骨基質(zhì)蛋白，從而破壞骨質(zhì)，使其釋放相關(guān)生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β，TGF-β)等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。反過(guò)來(lái)，這些因素可能刺激腫瘤細(xì)胞釋放其它可溶性生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素和蛋白消解酶，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、宿主組織遷移和侵襲，形成惡性循環(huán)[10]。研究表明，抑制MMP2和MMP9破壞了腫瘤轉(zhuǎn)移骨質(zhì)降解的能力。MMP2主要由成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌，并參與MMP13的活化和基底膜的降解。MMP9主要由破骨細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞)產(chǎn)生，據(jù)報(bào)道其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)至關(guān)重要。MMP2和MMP9能夠切割Ⅰ型，Ⅳ型和Ⅴ型膠原，并且在骨基質(zhì)降解中是有重要作用[11]。TIMP-1是MMP-9的特異性內(nèi)源抑制劑，二者的生理活性高度相關(guān)。TIMP-1能夠降低MMP-9的活性，使細(xì)胞外基質(zhì)保持穩(wěn)定，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。環(huán)氧合酶-2(Cyclo-oxygenase-2，COX-2)是1種炎癥相關(guān)酶，在慢性炎癥組織的腫瘤起始中起關(guān)鍵作用[13]。它是骨腫瘤組織中最主要的血管生長(zhǎng)因子，其過(guò)表達(dá)是包括乳腺癌在內(nèi)的多種上皮癌腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性特征，且COX-2抑制劑具有化學(xué)預(yù)防和治療作用。對(duì)小鼠和人類乳腺癌模型的研究表明，乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的COX-2通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生，如宿主抗腫瘤免疫細(xì)胞失活、增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力、促進(jìn)腫瘤相關(guān)血管發(fā)生等。MMP-9和COX-2表達(dá)的誘導(dǎo)作用與腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMPs催化細(xì)胞外ECM的降解，并促進(jìn)腫瘤侵襲和增殖，因此MMP-9和COX-2表達(dá)的抑制作用在癌癥治療中起關(guān)鍵作用。

圖3 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖4 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞中COX-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

圖5 Zometa 對(duì)U2OS細(xì)胞中COX-2、MMP-9、TIMP-1mRNA表達(dá)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9和COX-2在侵襲性乳腺癌中過(guò)表達(dá)，與乳腺癌患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、死亡率高密切相關(guān)，當(dāng)它們的表達(dá)被抑制時(shí)，可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中WB和qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度Zometa處理后，骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)COX-2、MMP-9 蛋白和mRNA表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸降低，TIMP-1蛋白mRNA表達(dá)水平隨濃度的增加而逐漸升高，且都存在劑量依賴性。提示，Zometa可能通過(guò)抑制COX-2、MMP-9的表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，Zometa通過(guò)調(diào)節(jié)COX-2、MMP-9和TIMP1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，來(lái)影響骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。提示Zometa可作為治療惡性骨腫瘤的藥物，且對(duì)患者預(yù)后情況的改善有一定的價(jià)值。然而，COX-2、MMP-9和TIMP1在細(xì)胞中的變化情況涉及到多種信號(hào)通路，對(duì)惡性骨腫瘤的影響還需要進(jìn)一步深入探究。

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(編輯：吳小紅)

Effects of Zometa on MMP-9,TIMP-1 and COX-2 in Osteosarcoma Cells

LENG Huaping，DUAN Yongzhuang，LI Kuankuan,et al.

Zhengzhou Yihe Hospital Affiliated to He'nan University,Zhengzhou,450000

Objective To investigate the effect of Zometa on the expression of MMP-9,TIMP-1 and COX-2 in osteosarcoma cells.Methods Using cell proliferation assay,apoptosis assay,cell migration and invasion assay to investigate the effects of Zometa on COX-2,MMP-9 and TIMP1 in osteosarcoma cells.Using WB and qRT-PCR to investigate the effects of Zometa on COX-2,MMP-9 and TIMP-1 in osteosarcoma cells.Results Zometa inhibited the proliferation,migration and invasion,and promoted the apoptosis of osteosarcoma cells.The mRNA and protein expression of COX-2 and MMP-9 in osteosarcoma cells were markedly decreased,whereas the mRNA and protein expression of TIMP-1 was significantly increased following exposure to different concentrations of Zometa.Those effects were dose-dependent.Conclusion Zometa suppress the proliferation,migration and invasion of osteosarcoma cells and induce apotosis by regulating the expression of COX-2,MMP-9 and TIMP-1.Zometa can be used as a drug for the treatment of malignant bone tumors,and improve the prognosis of patients with a certain value.

Zometa;Osteosarcoma cells;MMP-9;TIMP-1;COX-2

450000 河南大學(xué)附屬鄭州頤和醫(yī)院(冷華平，李寬寬，錢華兵)；450000 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(段永壯)

段永壯

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.08.002

R738.1

A

1001-5930(2017)08-1224-05

2017-04-06

2017-05-23)