轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ對肝癌細(xì)胞株MHCC97H增殖能力的影響

張 雷 王 林 耿智敏 萬 永 孟凡迪 孟憲魁

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·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ對肝癌細(xì)胞株MHCC97H增殖能力的影響

張 雷 王 林 耿智敏 萬 永 孟凡迪 孟憲魁

目的 觀察轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ對肝癌細(xì)胞株MHCC97H的增殖能力的影響，以期對闡明原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供1個(gè)新的研究思路。方法 應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染、RNA干擾(RNAi)以及過表達(dá)技術(shù)，在肝癌細(xì)胞株MHCC97H中干預(yù)TAZ的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞RNA和總蛋白，應(yīng)用qRT-PCR和Western blot等方法檢測TAZ、Nek7的表達(dá)。選用細(xì)胞計(jì)數(shù)kit-8(CCK-8)法檢測細(xì)胞活性和增殖能力。結(jié)果 與NC組相比，轉(zhuǎn)染了TAZ特異性靶向干擾片段之后，TAZ的mRNA與蛋白表達(dá)水平均出現(xiàn)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；Nek7表達(dá)也出現(xiàn)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；功能實(shí)驗(yàn)(CKK8)發(fā)現(xiàn)MHCC97H細(xì)胞活性和增殖能力也降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。另一方面，過表達(dá)了TAZ之后，Nek7表達(dá)水平也相應(yīng)上調(diào)了，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；MHCC97H細(xì)胞活性和增殖能力也提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)論 轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ能通過調(diào)控Nek7的表達(dá)對肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖能力產(chǎn)生影響，該發(fā)現(xiàn)對于闡明TAZ在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

TAZ;Nek7;肝癌；MHCC97H細(xì)胞；增殖

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1219～1223)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球五大高發(fā)腫瘤之一[1]。在我國，與腫瘤相關(guān)的死亡人數(shù)中肝癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)高居第二位[2]，目前治療肝癌還是以手術(shù)切除為主，輔以放、化療或者生物治療等[3]，但由于肝癌發(fā)病隱秘，早期癥狀不典型，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)既已經(jīng)到中晚期，所以治療效果不理想，五年生存率很低[4]。研究肝癌的發(fā)生發(fā)展對更好地預(yù)防和治療肝癌有重大意義，對臨床治療也能提供新的思路和策略。轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ首次報(bào)道是于2000年Kanai等[5]發(fā)現(xiàn)其能夠與14-3-3蛋白結(jié)合。近期的研究證明TAZ是Hippo信號通路中的重要效應(yīng)分子[6]，通過轉(zhuǎn)錄共激活作用調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[7]。國內(nèi)外的研究表明TAZ是1個(gè)癌基因，在乳腺癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、骨肉瘤等[8-11]腫瘤中都呈現(xiàn)高表達(dá)并與臨床預(yù)后相關(guān)。分子機(jī)制方面，Wang等[12]發(fā)現(xiàn)在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中TAZ呈表達(dá)，并通過上調(diào)CTGF 和 PDGF-β的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤形成。Nek7(NIMA-related kinase-7)是1個(gè)能參與細(xì)胞周期調(diào)控的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn)Nek7在肝癌組織中高表達(dá)且能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖,可作為肝癌的1個(gè)生物標(biāo)記。依據(jù)以上證據(jù)，我們推測TAZ通過調(diào)控Nek7的表達(dá)在肝癌細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究以肝癌細(xì)胞株MHCC97H為研究對象，探討TAZ對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響，為闡明肝癌的發(fā)生發(fā)展提供分子機(jī)制理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

MHCC97H(人肝癌細(xì)胞株)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。細(xì)胞計(jì)數(shù)kit-8(CCK-8)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司(USA)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、實(shí)時(shí)熒光定量(SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus))試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、RcoRⅠ、T4DNA連接酶、pyrobest DNA聚合酶、DpnI酶、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等均購自寶大連生物工程有限公司(TaKaRa)。兔抗人TAZ、Nek7、GAPDH多克隆抗體購自美國Proteintech。山羊抗兔IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TRIzol 試劑、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購自北京天根生物科技有限公司。設(shè)計(jì)的TAZ靶向siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。TAZ過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建引物和TAZ、Nek7、GAPDH的qRT-PCR引物等均由生工生物工程(上海)有限公司合成。pCMV5-HA載體購自promega(USA)。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞株MHCC97H置于37 ℃、CO2含100 U/ml雙抗、10%胎牛血清的DMEM(Gibco,USA) 全培養(yǎng)液換液傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞于6 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度約70%時(shí)饑餓培養(yǎng)4 h，然后用LipofectaminTM2000按照說明書的操作步驟將TAZ靶向siRNA(序列：CCGUUUCCCUGAUUUCCUUTT)以及陰性對照(序列：ACUCUGGACUGAAUCGACGAU)轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中。于轉(zhuǎn)染4～6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測MHCC97H細(xì)胞中TAZ、Nek7、GAPDH的mRNA水平

收集經(jīng)處理的MHCC97H細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol試劑法提取各組細(xì)胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，隨后以此cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt值表示各基因 mRNA 的相對表達(dá)水平。TAZ、Nek7、GAPDH的qRT-PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 Western blot檢測TAZ、Nek7、GAPDH蛋白表達(dá)水平

收集經(jīng)處理的MHCC97H細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。采用Western blot檢測TAZ、Nek7、GAPDH蛋白表達(dá)水平，Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的表達(dá)情況以TAZ或Nek7條帶的灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.5 設(shè)計(jì)引物及構(gòu)建pCMV5-HA-TAZ過表達(dá)質(zhì)粒

根據(jù)Genbank的基因序列設(shè)計(jì)引物,其中限制性內(nèi)切酶BamH I序列：GTTGGATCCATGAATCCGGCCTCGGCGCC，RcoRⅠ序列：GACGAATTCTTACAGCCAGGTTAGAAAGG。提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，利用T4 DNA連接酶連接TAZ全長片段與pCMV5-HA空載體，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA，酶切及測序驗(yàn)證。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)kit-8(CCK-8)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力

肝癌細(xì)胞MHCC97H經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA或者過表達(dá)質(zhì)粒之后，接種到96孔板中分別培養(yǎng)24、48、72及96 h，實(shí)驗(yàn)終止前2 h按照CCK-8試劑盒說明要求加入20 μl試劑，37°孵育2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光值，根據(jù)各組所得數(shù)據(jù)制作OD值曲線。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；t檢驗(yàn)被用于兩組間數(shù)據(jù)的比較；方差分析用于多組間數(shù)據(jù)的比較，而Tukey 法或Dunnett’s T3 法用于組間兩兩比較分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中的所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染TAZ靶向siRNA后TAZ、Nek7、GAPDH的mRNA和蛋白表達(dá)情況

取生長狀態(tài)良好的MHCC97H細(xì)胞，按如下分組：siTAZ組、陰性對照組(siNC組)、空白對照組(Blank組)，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA，24 h后提取RNA，進(jìn)行qRT-PCR；48 h后提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示：與陰性對照組(TAZ mRNA的相對表達(dá)水平為3.48±0.43,蛋白的相對表達(dá)水平2.28±0.31)相比，siTAZ(TAZ mRNA 的相對表達(dá)水平為1.07±0.15,蛋白的相對表達(dá)水平0.81±0.21)有明顯靶向干擾效果，能使TAZ的mRNA水平下降70%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；蛋白表達(dá)水平下降65%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。進(jìn)一步檢測Nek7的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，其mRNA水平從相對表達(dá)量1.08下降至0.31，下降70%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)；蛋白從相對表達(dá)量0.98下降至0.25水平下降75%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TAZ與Nek7之間存在關(guān)聯(lián)，TAZ可以調(diào)控Nek7的表達(dá)。

A為qRT-PCR量化數(shù)據(jù)柱狀圖,B為Western blot成像圖。

2.2 TAZ表達(dá)水平降低對肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與siNC組相比，siTAZ組MHCCC97H細(xì)胞活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 MHCC97H細(xì)胞CKK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量化圖

2.3 TAZ過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

提取人肝癌細(xì)胞株MHCC97H細(xì)胞中的總RNA，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證：成功擴(kuò)增出TAZ基因編碼區(qū)的外顯子序列，結(jié)果見圖3。為排除PCR產(chǎn)物為非特異性擴(kuò)增所得，我們以GAPDH為對照，確保所得的PCR產(chǎn)物準(zhǔn)確可靠。以得到的產(chǎn)物為基礎(chǔ)成功構(gòu)建了TAZ的過表達(dá)質(zhì)粒，用HA-TAZ表示。

圖3 TAZ PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像圖

2.4 過表達(dá)TAZ后TAZ、Nek7、GAPDH mRNA和蛋白表達(dá)情況

將得到的HATAZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MHCC97H細(xì)胞中，24 h后提取RNA，進(jìn)行qRT-PCR；48 h后提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western blot，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染了HA-Vector質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染了HA-TAZ質(zhì)粒組細(xì)胞的TAZ mRNA表達(dá)水平從(3.25±0.37)上升至(6.74±0.56)，蛋白水平從(2.65±0.45)上升至(5.89±0.51)；Nek7的mRNA和蛋白表達(dá)水平也分別增高200%和150%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見圖4。

A為qRT-PCR量化數(shù)據(jù)柱狀圖,B為Western blot成像圖。

2.5 TAZ表達(dá)增強(qiáng)使MHCC97H細(xì)胞增殖能力提高

將轉(zhuǎn)染了HA-Vector或者HA-TAZ質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞接種到96孔板中，CKK-8檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖5所示：與HA-Vector組相比，轉(zhuǎn)染了HA-TAZ組的細(xì)胞活力明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

圖5 MHCC97H細(xì)胞CKK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)量化圖

3 討論

肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤，與國外相比，我國肝癌具有年輕化、發(fā)病率高、死亡率高等特點(diǎn)[14]。雖然，近十幾年的部分研究成果已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床檢測和治療[3,15-16]，但是肝癌術(shù)后的恢復(fù)情況仍然不樂觀，因此，我們有必要深入了解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，這將有助于臨床制定出更有利的治療策略。腫瘤的發(fā)生是1個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜的慢性過程，現(xiàn)代觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤發(fā)生最主要是由于細(xì)胞內(nèi)蛋白平衡紊亂，抑癌基因失活，促癌基因表達(dá)增加。腫瘤細(xì)胞1個(gè)最主要的特點(diǎn)就是永生性，它能擺脫細(xì)胞死亡的過程，進(jìn)而發(fā)展成不受限制的增殖，最終導(dǎo)致向其他細(xì)胞或組織侵襲[17]。結(jié)合以上這兩點(diǎn)，我們選擇肝癌的增殖領(lǐng)域來研究，以經(jīng)典的肝癌細(xì)胞株MHCC97H為研究對象，以期發(fā)現(xiàn)更多的治療肝癌的分子靶點(diǎn)。

轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ/WWTR1是新近發(fā)現(xiàn)的、具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白，它包含1個(gè)保守的WW區(qū)域、1個(gè)14-3-3結(jié)合位點(diǎn)以及C端的PDZ結(jié)合模體[18]。做為Hippo信號通路中的重要效應(yīng)分子，在哺乳動(dòng)物中,TAZ能起到控制器官大小的作用[19]；另外還有研究表明，TAZ可以控制細(xì)胞的增殖[20]。眾多的研究表明TAZ為1個(gè)癌基因，它參與了腫瘤的形成，并能促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[21]。在肝癌中，TAZ的表達(dá)比癌旁高[22]，提示TAZ在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，TAZ基因的表達(dá)發(fā)生改變時(shí)，肝癌細(xì)胞MHCC97H的細(xì)胞活性和增殖能力也會發(fā)生改變，兩者的改變是正相關(guān)的。這說明TAZ能夠控制肝癌細(xì)胞的增殖，可以作為1個(gè)新的生物治療的靶點(diǎn)。

盡管很多基因和通路已經(jīng)被證明可以作為肝癌的早期檢測、診斷和生物治療靶點(diǎn)，但是更多可能的、新的生物標(biāo)記仍然需要被發(fā)掘。最近的1項(xiàng)研究表明Nek7在肝癌中高表達(dá)，且能控制細(xì)胞周期進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們推測TAZ可以通過調(diào)控Nek7的表達(dá)來影響肝癌細(xì)胞的增殖。為了驗(yàn)證我們的設(shè)想，我們應(yīng)用RNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)技術(shù)改變TAZ的表達(dá)，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，Nek7同樣隨著TAZ的變化而變化，而且還能影響肝癌細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果驗(yàn)證了我們之前的推測，為將Nek7定義為肝癌的生物治療靶點(diǎn)提供了更多的證據(jù)。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ可以調(diào)控Nek7的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖，為揭示原發(fā)性肝癌初始發(fā)生啟動(dòng)機(jī)制提供1個(gè)嶄新思路。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Transcriptional Coactivator TAZ on Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line MHCC97H

ZHANG Lei,WANG Lin,GENG Zhimin,et al.

The First Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi’an,710061

Objective To study the effect of transcriptional co-activator TAZ(transcriptional coactivator with PDZ binding motif)on the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H,to provide a new research idea for clarifying the occurrence and development mechanism of hepatocellular carcinoma(HCC).Methods Change the expression of TAZ in hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H by using cell transfection,RNA interference(RNAi)and over expression.After transfection,the RNA and total proteins were extracted,and then the expression of TAZ and Nek7 were detected by qRT-PCR and western blot.Cell counting kit-8(CCK-8)assay was performed to detect the cell viability and proliferation.Results Compared with the non-control(NC)group,the TAZ’s mRNA and protein expression were down regulated after transfected the TAZ specific targeting interfere fragments,the difference was statistically significant(P<0.0001)correspondingly,the expression of Nek7 were decreased;meanwhile the functional tests(CKK8)showed that the viability and proliferation of MHCC97H cells were also decreased.On the other hand,the expression of Nek7 was increased after up-regulating the TAZ’s expression;as a result,the viability and proliferation ability of MHCC97H cells was also increased.Conclusion The transcriptional co-activator TAZ can affect the proliferation of HCC cell line MHCC97H by regulating the expression of Nek7,which can provide some experimental basis for elucidating the role of TAZ in the progression of hepatocellular carcinoma.

TAZ;Nek7;Hepatocellular carcinoma;MHCC97H cells;Proliferation

710061 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院

孟憲魁

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.08.001

R735.7

A

1001-5930(2017)08-1219-05

2016-08-24

2017-06-12)