建立捻轉血矛線蟲單蟲種分離株的方法

王逢會，王波波，蔡葵蒸

(1．延安大學 醫(yī)學院，陜西延安 716000；2．西北民族大學 生命科學與工程學院，蘭州 730030)

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建立捻轉血矛線蟲單蟲種分離株的方法

王逢會1，王波波2，蔡葵蒸2

(1．延安大學 醫(yī)學院，陜西延安 716000；2．西北民族大學 生命科學與工程學院，蘭州 730030)

為獲得捻轉血矛線蟲單蟲種感染性三期幼蟲(L3)，以尾鞘長、尾鞘末端尾絲有無和尾絲長占尾鞘長的比例為依據(jù)，從自然混合感染有捻轉血矛線蟲的綿羊糞便中培養(yǎng)并分離該種線蟲的L3，然后用6 000條分離的L3經(jīng)口灌服3～4月齡綿羊。結果顯示，綿羊感染后17 d從糞便中檢出蟲卵，105 dEPG(每克糞便蟲卵數(shù))達4 410，至168 d下降為2 010；人工感染10個月后將綿羊剖殺，從其皺胃中收集到捻轉血矛線蟲成蟲2 261條。經(jīng)鑒定，從人工感染綿羊的糞便中培養(yǎng)和分離出的L3符合捻轉血矛線蟲L3的特征。

捻轉血矛線蟲；感染性幼蟲；綿羊；人工感染

毛圓科線蟲(Trichostrongylidae)病是危害養(yǎng)羊業(yè)的主要寄生蟲病，特別以捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)病為代表，無論是在熱帶、亞熱帶、溫帶還是寒冷的高原地區(qū)均普遍發(fā)生,對全世界的畜牧業(yè)生產(chǎn)危害嚴重[1]。為控制該病，過去幾十年來頻繁使用驅蟲藥，導致捻轉血矛線蟲對苯并咪唑(Benzimidazole)、阿維菌素(Abamectin)、左旋咪唑(Levamisole)三大類驅蟲藥均產(chǎn)生抗藥性[2-4]。隨著對該線蟲抗藥性、功能基因及生物防治等研究的不斷深入，需要建立單一蟲種的感染模式，以保證試驗數(shù)據(jù)的可靠性[5]。目前，建立捻轉血矛線蟲單一蟲種感染的方法[6-7]首先是尋找自然感染該線蟲的羊只剖檢，取出其真胃(皺胃)，再從胃內容物和胃黏膜中收集成蟲，形態(tài)鑒定后挑取雌蟲作為試驗材料，壓碎雌蟲釋放出蟲卵或反復從雌蟲子宮內沖洗獲得蟲卵，收集蟲卵培養(yǎng)獲得純凈的L3，L3經(jīng)人工感染羊只后，在羊體內成熟、繁殖以供試驗之用。上述方法需要大量的雌蟲，但該蟲種感染生產(chǎn)中屠宰羊只的強度不高，需要屠宰較多的羊才能獲得足夠的蟲卵，這樣不僅增加收集成本，而且由于雌蟲子宮內的蟲卵很大一部分未成熟，導致孵化率較低。本研究擬采用簡化的感染性幼蟲識別方法，從自然混合感染捻轉血矛線蟲的綿羊糞便中培養(yǎng)分離獲得該種線蟲的L3，人工感染綿羊來建立單蟲種的動物感染模式。

1 材料與方法

1.1 糞便來源

參照流行病學調查結果，甘肅榆中縣夏官營地區(qū)的綿羊混合感染捻轉血矛線蟲、蛇形毛圓線蟲、細頸線蟲等，其中捻轉血矛線蟲為優(yōu)勢蟲種，收集該地區(qū)經(jīng)蟲卵檢查陽性的綿羊糞便，備用。

1.2 試驗動物

3～4月齡、體質量15 kg左右的健康綿羊1只，購于榆中縣夏官營某養(yǎng)殖戶，用丙硫咪唑(15 mg/kg)和左旋咪唑(10 mg/kg)聯(lián)合驅蟲。試驗羊飼養(yǎng)于隔離房間，飼喂?jié)崈舻母刹荩a飼麩皮和玉米，自由飲水，驅蟲1周后，經(jīng)糞便蟲卵檢查無蟲卵后備用。

1.3 L3的分離培養(yǎng)

按照Wang等[8]的方法，將“1.1”中收集的新鮮綿羊糞便在托盤中搓碎，盛于醫(yī)用搪瓷盒中，糞便約占搪瓷盒體積的2/3，噴水加濕至糞便用手捏略有水滲出為宜，加蓋后置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天或隔天檢查并攪拌糞便，如盒蓋上無水滴，補噴水分至適當?shù)臐穸炔嚢杈鶆?。連續(xù)培養(yǎng)7 d后，將糞便堆成圓錐狀并使堆頂與盒蓋接觸，次日用蒸餾水將爬到盒蓋上的L3沖入燒杯中，然后翻攪糞便并根據(jù)具體情況補充水分，將糞便重新堆積，加蓋繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)3 d沖洗盒蓋上的L3于燒杯中，備用。

1.4 從L3混懸液中分離捻轉血矛線蟲L3

參考Van Wyk等[9]采用的牛羊線蟲L3形態(tài)學鑒定方法，以尾鞘長、尾鞘末端尾絲有無和尾絲長與尾鞘長的比例為依據(jù)，從“1.3”獲得的L3混懸液中分離捻轉血矛線蟲L3。捻轉血矛線蟲L3的尾鞘末端有尾絲，尾絲長占尾鞘長的10%～16%(圖1)。取“1.3”獲得的L3混懸液適量于直徑8 cm的平皿中，用4 ℃冷卻的蒸餾水調節(jié)至幼蟲適合挑出的濃度。將平皿置于倒置顯微鏡(Olympus,IX2-SLP,Japan)下，用特制的玻璃毛細吸管于4×物鏡下將符合捻轉血矛線蟲L3特征的幼蟲挑出，放入新的平皿中。初次挑蟲時，可將挑出的幼蟲先置于載玻片上，加1滴稀碘液使幼蟲停止活動或死亡變直，加蓋玻片用顯微鏡測微尺測量蟲體長度、尾鞘長度，觀察頭端形狀和腸細胞數(shù)量，確定符合捻轉血矛線蟲L3特征并積累經(jīng)驗后，再從混合幼蟲懸液中挑出所要的L3，直至達到所需數(shù)量。接種動物前再在倒置顯微鏡下核查1次，剔除個別不具特征性的L3。

A.總長 Total length；B.幼蟲尾端 Tip of larval tail；C.尾鞘 Sheath tail；D.尾絲 Filament

1.5 試驗動物的人工感染

將“1.4”中分離的L3混合均勻，取20 μL加載玻片上于顯微鏡下計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果計算每毫升原蟲液中所含的幼蟲數(shù)。用注射器改造的自制灌藥裝置，參考Waghorn等[10]所報道的劑量，給試驗羊經(jīng)口灌服6 000條L3，隔離飼養(yǎng)17 d后，從直腸取新鮮糞便，用麥克馬斯特氏法(McMaster)統(tǒng)計EPG，以后每隔一段時間進行糞便蟲卵計數(shù)，每次計數(shù)重復3次，取平均值，以感染時間為橫坐標，每克糞便平均蟲卵數(shù)為縱坐標在Excel中作圖。同時收集部分糞便樣品按“1.3”方法進行L3的培養(yǎng)與鑒定。

1.6 人工感染羊剖檢和目的蟲種鑒定

“1.5”中的感染羊只隔離飼養(yǎng)10個月后，采用畜禽全身寄生蟲學剖檢法檢查體內蟲體[11]，并對收集到的成蟲進行蟲種鑒定，以確定是否為單蟲種感染。

2 結果與分析

2.1 人工感染綿羊糞便中蟲卵檢測

用分離的L3感染試驗羊后，于接種后第17 天從糞便中檢查到少量蟲卵，糞便中蟲卵量隨感染時間增加快速上升，第105 天時排出蟲卵量達峰值(平均4 410)，此后緩慢下降，至第168 天平均為2 010(圖2)。

圖2 人工感染綿羊糞便的蟲卵量Fig.2 Dynamic changes of eggs in feces from artificially infected sheep

2.2 人工感染綿羊糞便中L3的特征

感染綿羊后，經(jīng)糞便培養(yǎng)收集到形態(tài)一致的L3(圖3-A、3-E)，幼蟲頭端在口腔和食道之間沒有橫帶(圖3-B)，尾端有尾鞘、至尖端漸細、末端有尾絲(圖3-C)，幼蟲小腸細胞為16～18個，幼蟲體長、食道長和尾鞘等的測量結果見表1。從表1可知，從人工感染綿羊糞便中分離培養(yǎng)的L3符合捻轉血矛線蟲L3的特征。

A.殺死后的幼蟲 Killed larva； B.幼蟲的頭端 The cranial extremity of larva；C.幼蟲尾部 The tail of larva；D.蟲卵 Eggs；E.活動時的幼蟲 Living larva
圖3 人工感染綿羊糞便中分離培養(yǎng)的蟲卵和L3
Fig.3 The eggs and the L3 in feces from artificially infected sheep and adult in its body

表1 人工感染綿羊糞便分離培養(yǎng)的L3性狀Table 1 Measurements of infective L3 cultured from feces of artificially infected sheep μm

2.3 人工感染綿羊體內成蟲的收集和鑒定

人工感染羊感染10個月后剖殺，從其皺胃中收集到成蟲2 261條，回收率37.7% (2 261/6 000)，經(jīng)蟲種鑒定均符合捻轉血矛線蟲雌、雄蟲特征，在感染羊其他內臟器官中均未發(fā)現(xiàn)有蟲體寄生。

3 討 論

采用簡化的L3鑒別技術，從自然感染捻轉血矛線蟲的羊群中采集新鮮糞便，培養(yǎng)并分離出捻轉血矛線蟲L3，用獲得的L3接種3～4月齡羔羊后，于不同時間段檢查糞便中的蟲卵。結果表明，感染17 d后從糞便中排出蟲卵，至105 d達到高峰。從人工感染羊的糞便中培養(yǎng)分離得到的捻轉血矛線蟲L3形態(tài)一致，符合捻轉血矛線蟲L3的特征[6]。試驗羊感染10個月后采用畜禽全身寄生蟲學剖檢法，從其皺胃中回收到該種成蟲，并無其他蟲體寄生，證明本法所分離和接種的L3屬于捻轉血矛線蟲，也說明本研究采用的建立捻轉血矛線蟲單蟲種感染的方法是可行的。此外，由于節(jié)約前期收集成蟲所需成本，因而更適合于在生產(chǎn)中應用。

捻轉血矛線蟲是最常見的胃腸線蟲，根據(jù)筆者的實踐經(jīng)驗，只要糞便檢查中能夠查出蟲卵，且每克糞便中的蟲卵數(shù)在100以上，就能夠在糞便培養(yǎng)中收集到相當數(shù)量的捻轉血矛線蟲L3，因而采用本法獲取捻轉血矛線蟲L3并不困難。捻轉血矛線蟲L3尾鞘較長，為蛇形毛圓線蟲(Trichostrongyluscolubriformis) 尾鞘的2.6倍左右[9]，尾部具有尾絲，尾絲占尾鞘長的10%～16%，而后者無尾絲，因此當二者混合感染時很容易區(qū)別。與以往報道[12]的采用觀察頭部結構、計數(shù)腸細胞數(shù)量、測量蟲體大小等方法鑒別糞便中的L3相比，本研究采用的鑒別L3的方法省去逐條測量的麻煩，而是在倒置顯微鏡視野中根據(jù)尾絲的有無及估測尾絲占尾鞘的比例就可以從L3混懸液中鑒別分離捻轉血矛線蟲L3。然而，對于初學者來說，在實際工作中需要一定的培訓才可以做到?？梢允孪瘸槿∫伤圃摲N線蟲的L3在顯微鏡下測量其尾鞘、尾絲的長度，根據(jù)資料對比是否符合目的L3的特征，然后在倒置顯微鏡下觀察幼蟲活動和尾部特征，反復訓練即可在1 d內掌握該項技術。另外，在挑取幼蟲過程中由于捻轉血矛線蟲L3在溫度較高時運動性較強，有時不易挑取和辨認。為解決這一問題，將L3混懸液在 4 ℃冰箱中冷卻使其活動減慢或靜止，這樣更容易辨認和挑取捻轉血矛線蟲L3。

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KONG F Y.Domestic Animal Parasitology[M].2nd ed.Beijing:Publishing House of China Agricultural University,1997:365-371(in Chinese).

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

A Simple Method to Establish a Monospecific Isolate ofHaemonchusContortus.

WANG Fenghui1,WANG Bobo2and CAI Kuizheng2.

(1.Medical College of Yan’an University,Yan’an Shaanxi 716000,China; 2.College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

To obtain infective third-stage larvae (L3) of a monospecificHaemonchuscontortus, based on the length of the sheath tail,the presence or absence of filament at the end of the sheath tail and the proportion of the sheath tail comprised of filamen,L3 larvae ofHaemonchuscontortuswere cultured and isolated from the feces of sheep infected with natural mixed nematodes. Then three to four month-old lamb was administered orally with the 6 000 L3 larvae isolated. The results showed that eggs were detected in the feces of the tested sheep at 17 days after infection. The amount of eggs excreted reached to 4 410 eggs per gram (EPG) of feces at 105 days after infection,then it declined to 2 010 EPG at 168 days. On 10 months post infection the sheep was killed and 2 261 adult worms ofH.contortuswere collected from sheep’s abomasum. The L3 larvae cultured and isolated from feces of artificially infected sheep were matched the characteristics of L3 larvae ofH.contortusby morphological identification.

Haemonchuscontortus; Infective larvae; Sheep; Artificial infection

2016-04-15 Returned 2016-05-30

Changjiang Scholars and Innovative Research Team University (No.IRT13091).

WANG Fenghui,female,master,lecturer.Research area:parasitebiology.E-mail:xsybz930612@126.com

CAI Kuizheng,male,Ph.D,professor.Research area:systematics and bio-control of animal parasite. E-mail:ckz000@126.com

日期：2017-06-29

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.036.html

2016-04-15

2016-05-30

教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”(IRT13091)。

王逢會，女，碩士，講師，研究方向為寄生蟲生物學。E-mail:xsybz930612@126.com 通信作者：蔡葵蒸，男，博士，教授， 研究方向為動物寄生蟲系統(tǒng)分類學和生物防治。E-mail:ckz000@126.com

S855.9

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1004-1389(2017)07-1085-05