梨樹(shù)CDPK基因家族進(jìn)化和表達(dá)分析

韓艷麗，李 靜，操慶國(guó)，徐 銀，顏志明,2

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400；2.江蘇現(xiàn)代園藝技術(shù)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212400)

?

梨樹(shù)CDPK基因家族進(jìn)化和表達(dá)分析

韓艷麗1，李 靜1，操慶國(guó)1，徐 銀1，顏志明1,2

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400；2.江蘇現(xiàn)代園藝技術(shù)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212400)

鈣依賴蛋白激酶(CDPK或CPK)在植物生長(zhǎng)和發(fā)育、逆境信號(hào)刺激及其對(duì)病原物的防御反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究利用梨樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)的方法，在全基因組水平上對(duì)梨樹(shù)CDPK基因家族進(jìn)行系譜進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、共線性關(guān)系及表達(dá)情況等分析。結(jié)果表明，梨樹(shù)基因組中共存在31個(gè)CDPK基因，命名為 PbCDPK1 ～ PbCDPK31。系譜分析結(jié)果表明，這些CDPK基因歸屬于4個(gè)亞家族。共線性分析檢測(cè)到12對(duì)CDKP基因間存在顯著的共線性關(guān)系，其中10對(duì)由最近一次發(fā)生的全基因組復(fù)制事件形成。非同義/同義置換率的比率(dN/dS)說(shuō)明CDPK基因在功能上進(jìn)化得非常保守。熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)梨樹(shù)CDPK基因?qū)Ω珊的婢秤许憫?yīng)。試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步開(kāi)展梨樹(shù)CDPK基因家族的功能鑒定和分子進(jìn)化機(jī)制的研究提供參考。

梨樹(shù)；CDPK基因；生物信息學(xué)；進(jìn)化；干旱

植物的生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量往往受到外部逆境的影響，這些因素包括干旱、低溫、高鹽、病原體感染，微生物誘導(dǎo)等。植物體自身形成了一套復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)途徑來(lái)適應(yīng)多變的外界環(huán)境[1]。鈣離子(Ca2+)作為第二信使，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[2]。在植物中，各種不同的內(nèi)源和外部信號(hào)，如光照、激素、生物脅迫及非生物脅迫都會(huì)觸發(fā)胞漿Ca2+濃度的變化。這些鈣信號(hào)被不同Ca2+傳感器分子傳導(dǎo)到下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如目標(biāo)蛋白磷酸化等。鈣依賴蛋白激酶(CDPK或CPK)是植物中研究最為深入和廣泛的Ca2+傳感器之一。到目前為止,已經(jīng)在植物界(從綠藻到顯花植物)以及原生生物中都發(fā)現(xiàn)了CDPK。CDPK蛋白包含一個(gè)N-端可變區(qū)域、有催化活性的蛋白激酶區(qū)、自抑制區(qū)以及包含EF-hand模塊(結(jié)合Ca2+)的CaM區(qū)[3]。CDPK獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使它同時(shí)具備Ca2+感應(yīng)器和效應(yīng)器的功能。CDPK通過(guò)解除其自抑制的機(jī)制使其具有活性。

大量研究表明，CDPK在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育、環(huán)境信號(hào)刺激及其對(duì)病原物的防御反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。擬南芥AtCPK1的過(guò)量表達(dá)顯著提高了NADPH氧化酶活性[4]，激活苯丙氨酸氨基水解酶PAL(Phenylalanine ammonialyase)，導(dǎo)致水楊酸(SA)的積累[5]。AtCPK5能激活呼吸氧化酶同系物D(RBOHD)[6]，從而誘導(dǎo)活性氧(ROS)爆發(fā)。 AtCPK4/11/23通過(guò)調(diào)控K+通道提高植物的抗鹽性[7]。CDPKs也在激素(如ABA、MeJA和乙烯等)信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用[8-9]。此外，一些CDPK基因還參與植物根部發(fā)育和花粉管生長(zhǎng)[10-11]。編碼CDPK的基因以多基因家族的形式存在，目前，在擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn)32個(gè)CDPK基因成員[12]，水稻中檢測(cè)到31個(gè)CDPK基因成員[13]。

梨樹(shù)在世界果樹(shù)生產(chǎn)中占有重要的位置，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。梨樹(shù)全基因組序列雖已公布，但梨樹(shù)CDPK基因家族的系統(tǒng)分析還未見(jiàn)報(bào)道，CDPK響應(yīng)非生物脅迫的研究處于起步階段。本研究在全基因組水平上識(shí)別和分析梨樹(shù)CDPK基因家族，對(duì)其進(jìn)行系譜發(fā)生、共線性和表達(dá)特性等方面的分析，以期為進(jìn)一步開(kāi)展梨樹(shù)CDPK基因家族的基因功能和分子進(jìn)化機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為‘碭山酥梨’幼苗，由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院保存，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌植株移至霍格蘭培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d進(jìn)行緩苗。將幼苗置于濾紙上，對(duì)植物材料進(jìn)行干旱處理，分別在0、2、4和8 h后收集葉片于液氮速凍，用于RNA提取和基因表達(dá)分析。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 數(shù)據(jù)收集和搜索

從Pear Genome Project(http://peargenome.njau.edu.cn)下載梨(Pyrusbretschneideri)全基因組的注釋序列。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)中下載kinase(PF00069)和EF-hand(PF13499)結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型(HMM)。用HMMER3(http://hmmer.janelia.org/)軟件包以隱馬可夫模型對(duì)梨樹(shù)基因組進(jìn)行搜索，所用選項(xiàng)為“cut_ga”。得到的基因提交到InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)搜索結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 系譜發(fā)生分析

以CDPK基因的全長(zhǎng)氨基酸序列作多序列聯(lián)配，所用軟件為MUSCLE[14]，參數(shù)使用默認(rèn)值。根據(jù)多序列比對(duì)的結(jié)果，使用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，所用算法為鄰近法(neighbor joining，NJ)，對(duì)構(gòu)建的樹(shù)進(jìn)行自舉檢驗(yàn)，重復(fù)設(shè)為1 000。

1.4 共線性檢測(cè)和dN/dS估算

對(duì)CDPK各成員間進(jìn)行共線性檢測(cè)，所用軟件為MicroSyn[15]。采用該軟件檢測(cè)各基因所在基因組區(qū)段之間同源基因在數(shù)量和順序上的保守程度。使用PAML軟件包的codeml程序[16]進(jìn)行計(jì)算。同義置換率 dS(synonymous)和非同義置換率 dN(nonsynonymous)

1.5 熒光定量PCR

利用CTAB法提取梨葉片的總RNA，利用PrimeScript○RRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄cDNA。運(yùn)用軟件Beacon Designer 7.0對(duì)全長(zhǎng)CDPK基因特異的區(qū)域設(shè)計(jì)引物(表1)。常用的看家基因(actin，GenBank登錄號(hào) GU830958)作為熒光定量PCR(qPCR)的內(nèi)參基因。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性4 min，95 ℃;變性40 s，95 ℃；退火20 s，60 ℃；延伸30 s，72 ℃；38個(gè)循環(huán)；熔解曲線溫度為65～95 ℃，反應(yīng)程序?yàn)?5 s，94 ℃，1 min，60 ℃，15 s，95 ℃。所有的反應(yīng)重復(fù)3次。以0 h收集的葉片作為對(duì)照，根據(jù)2-ΔΔCt的方法分別計(jì)算干旱處理2 h、4 h、8 h樣品中各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 梨樹(shù)中CDPK基因的鑒定

本研究以Ser/Thr蛋白激酶區(qū)和EF-hand模塊的HMM在梨全基因組蛋白序列中進(jìn)行搜索，并用InterProScan對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證，共獲得31個(gè)梨樹(shù)CDPK基因。根據(jù)基因與HMM相似性的大小，將這些CDPK基因命名為 PbCDPK1 ～ PbCDPK31(表2)。

2.2 系譜發(fā)生分析

為了考察CDPK基因家族在梨樹(shù)中的系譜發(fā)生關(guān)系，在多序列聯(lián)配的基礎(chǔ)上，以NJ法構(gòu)建CDPK基因家族的系譜發(fā)生樹(shù)。為了更好地對(duì)梨樹(shù)CDPK基因家族進(jìn)行分類，以31個(gè)梨樹(shù)CDPK基因和32個(gè)擬南芥CDPK基因作聯(lián)合系譜發(fā)生樹(shù)(圖1)。根據(jù)自舉值的大小(一般>50%)和擬南芥CDPK基因的分類信息，將梨樹(shù)CDPK基因分為4個(gè)亞家族，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。亞家族Ⅰ中含有12個(gè)CDPK基因，亞家族Ⅱ具有5個(gè)成員，亞家族Ⅲ存在12個(gè)CDPK基因，而亞家族Ⅳ中只存在2個(gè)基因。

表2 梨樹(shù)CDPK基因家族成員基本信息Table 2 Characteristics of CDPK genes in pear

圖1 梨樹(shù)和擬南芥中CDPK蛋白的聯(lián)合系譜發(fā)生樹(shù)Fig.1 Joined phylogenetic tree of CDPK proteins in pear and Arabidopsis

2.3CDPK基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

梨樹(shù)CDPK基因內(nèi)含子數(shù)目為6、7、9和11個(gè)。在進(jìn)化樹(shù)中，親緣關(guān)系靠近的成員具有相同的內(nèi)含子數(shù)目和相位(圖2)。亞家族Ⅰ包括12個(gè)梨樹(shù)基因，其中9個(gè)基因具有6個(gè)內(nèi)含子，并且內(nèi)含子的相位相同。值得注意的是，亞家族Ⅰ中有3個(gè)基因無(wú)含子插入，這種無(wú)內(nèi)含子的CDPK只在薔薇科植物中發(fā)現(xiàn)，可能薔薇科植物中CDPK基因發(fā)生了內(nèi)含子的丟失事件。所有亞家族Ⅱ中的梨樹(shù)CDPK基因均由7個(gè)內(nèi)含子組成，并且內(nèi)含子相位相同。亞家族Ⅲ中除了3個(gè)基因外，均具有7個(gè)內(nèi)含子。亞家族Ⅳ中2個(gè)梨樹(shù)CDPK基因的內(nèi)含子數(shù)目最多，為11個(gè)。各個(gè)亞家族成員內(nèi)含子數(shù)目和插入相位的保守性說(shuō)明基因結(jié)構(gòu)在各亞家族內(nèi)的保守性。

梨樹(shù)和擬南芥CDPK基因按圖1進(jìn)化樹(shù)中的順序排列CDPKgenes on the left was arranged in Fig. 1；外顯子以方形表示，連接外顯子的線則表示內(nèi)含子 Exon is represented by box and line connecting two exons represents an intron；黑色方形表示蛋白激酶結(jié)構(gòu)域 Protein kinase domain was marked by black color
圖2 梨樹(shù)CDPK基因內(nèi)含子-外顯子
Fig.2 Schematic representations of exon-intron compositions ofCDPKgenes in pear andArabidopsis

2.4 共線性分析

由基因組或基因組片段復(fù)制導(dǎo)致的同源基因，不僅表現(xiàn)為基因序列具有相似性，而且其染色體上相鄰基因的排列序列具有很高的一致性。這種基因排列的保守性稱為共線性。本研究利用MircoSyn軟件對(duì)31個(gè)CDPK基因的基因組區(qū)段之間進(jìn)行共線性分析。結(jié)果表明，在梨樹(shù)基因組內(nèi)，12對(duì)CDKP基因間存在顯著的共線性關(guān)系(表3)。為了估算CDPK基因間復(fù)制事件發(fā)生的大致時(shí)間，筆者考查了CDPK基因間共線性區(qū)段內(nèi)同源基因的平均同義置換率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10對(duì)CDPK基因共線性區(qū)段間的dS在0.06～0.38 的范圍內(nèi)(表3)，而有2對(duì)基因間的dS值大于0.57。非同義/同義置換率的比率(dN/dS)可在蛋白水平上度量選擇壓力。12對(duì)存在共線性關(guān)系的CDKP基因?qū)Φ膁N/dS均遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明CDPK基因在進(jìn)化上非常保守，氨基酸在純化選擇(負(fù)選擇)壓力下保守地突變。

表3 梨樹(shù)各CDPK基因之間的共線性關(guān)系及非同義置換率(dN)和同義置換率(dS)Table 3 Synteny related to genes in CDPK gene family in pear

2.5 表達(dá)分析

通過(guò)對(duì)擬南芥中同源基因的功能以及梨樹(shù)CDPK基因的進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)， PbCDPK10、 PbCDPK22、 PbCDPK27、 PbCDPK5和 PbCDPK7很可能與梨樹(shù)逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)(見(jiàn)討論)。選取這5個(gè)CDPK基因，通過(guò)qPCR技術(shù)考查它們?cè)诒磉_(dá)水平上是否響應(yīng)干旱逆境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱處理能顯著影響這5個(gè)基因的表達(dá)，并具有類似的表達(dá)模式(圖3)。干旱處理2～4 h，每個(gè)基因的表達(dá)開(kāi)始上升，但沒(méi)有顯著的變化，在處理8 h后表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，最高為處理的8.7倍。

3 討 論

CDPK蛋白由多基因家族編碼，廣泛存在于植物中。本研究在梨基因組中共發(fā)現(xiàn)31個(gè)CDPK基因。在目前已測(cè)序的薔薇科植物中，草莓、桃和蘋果中分別存在15、15和26個(gè)CDPK基因。梨樹(shù)和蘋果中的CDPK基因數(shù)目接近，是草莓和桃的2倍左右。據(jù)報(bào)道，在顯花植物中，物種特異性的全基因組復(fù)制事件通常導(dǎo)致基因家族成員數(shù)目在不同物種間的差異[17]。在薔薇科植物中，梨樹(shù)和蘋果樹(shù)的基因組比草莓和桃多發(fā)生了一次全基因組復(fù)制[18]。這個(gè)復(fù)制事件很可能是導(dǎo)致梨樹(shù)和蘋果樹(shù)中CDPK基因家族數(shù)目增加的主要原因。

H2、H4和H8分別表示脫水處理2、4和8 h H2, H4, and H8, dehydrated for 2, 4, 8 h；對(duì)照(CK)的表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1 Expression of control (CK) was normalized to 1
圖3 定量 RT-PCR 表達(dá)分析5個(gè)梨樹(shù)CDPK基因在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)干旱處理的響應(yīng)
Fig.3 Quantitative RT-PCR analysis of 5PbCDPKgenes expression response to drought stress

為了初步推測(cè)梨樹(shù)CDPK基因的功能，把梨樹(shù)31個(gè)CDPK基因和擬南芥的32個(gè)CDPK基因作聯(lián)合系譜發(fā)生樹(shù)分析。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,可以分析分子之間的起源關(guān)系,預(yù)測(cè)分子的功能。同一亞家族或小的分枝往往具有相似的功能。另外，據(jù)報(bào)道，在梨樹(shù)基因組序列中保留了發(fā)生2次全基因組復(fù)制的證據(jù)，一次為“古代六倍體化”事件(大約140百萬(wàn)年前)和最近一次發(fā)生的全基因組復(fù)制事件(30～45百萬(wàn)年前)。通過(guò)分析CDPK基因所在染色體區(qū)段內(nèi)的共線性，可以推測(cè)這些基因的起源及復(fù)制時(shí)間等特性。在梨樹(shù)基因組內(nèi)，在10對(duì)存在顯著的共線性關(guān)系的CDKP基因間，其共線性區(qū)段間同義置換率較小(0.06～0.38)，很可能由最近一次發(fā)生的全基因組復(fù)制事件形成，而另外2對(duì)CDPK基因共線性區(qū)段間的dS較大，說(shuō)明它可能起源于較古老的“古代六倍體化”基因組復(fù)制事件。

據(jù)報(bào)道，在擬南芥32個(gè)CDPK成員和31個(gè)水稻CDPK成員中，多數(shù)CDPK與逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[19]。Sheen[20]發(fā)現(xiàn)，在干旱和鹽誘導(dǎo)條件下，擬南芥AtCPK1和AtCPK2的表達(dá)量顯著增加,而擬南芥 AtCPK10和 AtCPK30參與了對(duì)ABA和非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究中發(fā)現(xiàn)，在梨樹(shù)和擬南芥CDPK的進(jìn)化樹(shù)中，AtCPK1和AtCPK2為1對(duì)直系同源基因，和AtCPK1和AtCPK2最同源的梨樹(shù)基因?yàn)?PbCDPK10、 PbCDPK22和 PbCDPK27。而這3個(gè)梨樹(shù)CDPK基因由最近發(fā)生的一次全基因組形成，基因間的dN/dS均遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明它們?cè)诩兓x擇壓力下進(jìn)化得非常保守。 AtCPK10和 AtCPK30也為1對(duì)直系同源基因，而 PbCDPK5和 PbCDPK7跟 AtCPK10和 AtCPK30的親緣關(guān)系最近，它們也是由最近發(fā)生的一次全基因組復(fù)制形成，并且基因間的dN/dS均遠(yuǎn)小于1。這些證據(jù)表明 PbCDPK10、 PbCDPK22和 PbCDPK27以及 PbCDPK5和 PbCDPK7很可能與梨樹(shù)逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。qPCR試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干旱處理8 h后，這5個(gè)基因的表達(dá)量顯著提高，說(shuō)明通過(guò)系譜發(fā)生樹(shù)、共線性和選擇壓等分析推測(cè)的CDPK基因的功能和試驗(yàn)結(jié)果較為一致。

4 結(jié) 論

在梨樹(shù)基因組中共存在31個(gè)CDPK基因，歸屬于4個(gè)亞家族。在梨樹(shù)基因組內(nèi)，12對(duì)CDKP基因間存在顯著的共線性關(guān)系，其中10對(duì)由最近一次發(fā)生的全基因組復(fù)制事件形成，而另外2對(duì)CDPK基因可能起源于較古老的“古代六倍體化”基因組復(fù)制事件。梨樹(shù)CDPK基因在功能上進(jìn)化得非常保守。通過(guò)系譜發(fā)生樹(shù)、共線性和選擇壓等分析推測(cè) PbCDPK10、 PbCDPK22、 PbCDPK27、 PbCDPK5和 PbCDPK7可能與梨樹(shù)逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。qPCR試驗(yàn)在表達(dá)水平上表明這5個(gè)梨樹(shù)CDPK基因?qū)Ω珊的婢秤许憫?yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步開(kāi)展梨樹(shù)CDPK基因家族的功能鑒定和分子進(jìn)化機(jī)制的研究提供參考。

Reference：

[1] XIONG L,SCHUMAKER K S,ZHU J K.Cell signaling during cold,drought,and salt stress[J].PlantCell,2002,14(Suppl):165-183.

[2] SANDER S D,BROWNL E E,CHARPER J F.Communicating with calcium[J].PlantCell,1999,11(4):691-706.

[3] KLIMECK A M,MUSZYNSK A G.Structure and functions of plant calcium-dependent protein kinases [J].ActaBiochimicaPolonica,2007,54(2):219-233.

[4] XING T,WANG X J,MALIK K,etal.Ectopic expression of anArabidopsiscalmodulin-like domain protein kinase-enhanced NADPH oxidase activity and oxidative burst in tomato protoplasts[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2001,14(10):1261-1264.

[5] COCA M,SAN SEGUNDO B.AtCPK1 calcium-dependent protein kinase mediates pathogen resistance inArabidopsis[J].PlantJournal,2010,63(3):526-540.

[6] DUBIELLA U,SEYBOLD H,DURIAN G,etal.Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(21):8744-8749.

[7] MA S Y,WU W H.AtCPK23 functions inArabidopsisresponses to drought and salt stresses [J].PlantMolecularBiology,2007,65(4):511-518.

[8] ZHAO R,SUN H L,MEI C,etal.TheArabidopsisCa2+-dependent protein kinase CPK12 negatively regulates abscisic acid signaling in seed germination and post-germination growth[J].NewPhytologist,2011,192(1):61-73.

[9] MUNEMASA S,HOSSAIN M A,NAKAMURA Y,etal.TheArabidopsiscalcium-dependent protein kinase,CPK6,functions as a positive regulator of methyl jasmonate signaling in guard cells[J].PlantPhysiology,2011,155(1):553-561.

[10] ESTRUCH J J,KADWELL S,MERLIN E,etal.Cloning and characterization of a maize pollen-specific calcium-dependent calmodulin-independent protein kinase [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1994,91(19):8837-8841.

[11] IVASHUTA S,LIU J,LOHAR D P,etal.RNA interference identifies a calcium-dependent protein kinase involved inMedicagotruncatularoot development[J].PlantCell,2005,17(11):2911-2921.

[12] HRABAK E M,CHAN C W,GRIBSKOV M,etal.TheArabidopsisCDPK-SnRK superfamily of protein kinases[J].PlantPhysiology,2003,132(2):666-680.

[13] RAY S,AGARWAL P,ARORA R,etal.Expression analysis of calcium-dependent protein kinase gene family during reproductive development and abiotic stress conditions in rice (OryzasativaL.spp.indica) [J].MolecularGeneticsandGenomics,2007,278(5):493-505.

[14] EDGAR R C.MUSCLE:a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity[J].BMCBioinformatics,2004,19(5):113.

[15] CAI B,YANG X,TUSKAN G A,etal.MicroSyn:a user friendly tool for detection of microsynteny in a gene family[J].BMCBioinformatics,2011,12(1):79.

[16] YANG Z.PAML:a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood [J].ComputerApplicationsintheBiosciences,1997,13(5):555-556.

[17] CANNON S B,MITRA A,BAUMGARTEN A,etal.The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families inArabidopsisthaliana[J].BMCPlantBiology,2004,20(3):116-124.

[18] WU J,WANG Z,SHI Z,etal.The genome of the pear (PyrusbretschneideriRehd.) [J].GenomeResearch,2013,23(2):396-408.

[19] HARPER J F,BRETON G A.Decoding Ca2+signals through plant protein kinases [J].AnnualReviewofPlantBiology,2004,55(1):263-288.

[20] SHEEN J.Ca2+-dependent protein kinases and stress signal transduction in plants[J].Science,1996,274(5294):1900-1902.

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Evolution and Expression Analysis ofCDPKGene Family in Pear (Pyrusspp.).

HAN Yanli1,LI Jing1,CAO Qingguo1,XU Yin1and YAN Zhiming1,2.

(1.Jiangsu Polytechnical College of Agriculture and Forestry,Zhenjiang Jiangsu 212400, China; 2.Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Zhenjiang Jiangsu 212400，China)

Calcium-dependent protein kinase (CDPK or CPK) plays important roles in plant growth and development, stress response, and immune and defense signaling, etc. This study aims to provide valuable foundation for further study of biological function and evolutionary relationship in this family. Bioinformatic method was used to comprehensively analyze phylogenetic relationship, synteny relationship and expression pattern ofCDPKgene family in pear (Pyrusspp.).A total of 31CDPKgenes were identified in pear, namely PbCDPK1- PbCDPK31, and they were phylogenetically clustered into 4 subfamilies. The synteny relationship showed that significant synteny relationship were detected within 12CDPKgene pairs, of which 10 were evolved form the recent whole genome duplication event. Purifying selection also played a critical role in the function evolution ofCDPKfamily genes through nosynonymous/synonymous substitution analysis. FiveCDPKgenes responded to drought stress based on the quantitative real-time RT-PCR (qPCR). The results of this study might lay a significant foundation for further studies on the gene functions and molecular evolutionary mechanism ofCDPKgene family in pear.

Pear (Pyrusspp.);CDPKgene; Bioinformatics; Evolution; Drought

2016-03-30 Returned 2016-05-20

Jiangsu Natural Science Foundation(No.BK20131243); Jiangsu Sanxin(Three New)Agricultural Project(No.SXGC[2015]311); Qinglan Project of Jiangsu Province.

HAN Yanli, female, master. Research area:fruit molecular biology.E-mail:45600134@qq.com

日期：2017-06-29

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170629.1108.020.html

2016-03-30

2016-05-20

江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131243)；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程(SXGC[2015]311)；江蘇省青藍(lán)工程。

韓艷麗，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡?shù)分子生物學(xué)。E-mail: 45600134@qq.com

S661.2

A

1004-1389(2017)07-1026-07