分子標記技術(shù)在辣椒雄性不育中的研究進展

孟雅寧 嚴立斌 范妍芹

（河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所， 石家莊 050051）

分子標記技術(shù)在辣椒雄性不育中的研究進展

孟雅寧 嚴立斌 范妍芹*

（河北省農(nóng)林科學院經(jīng)濟作物研究所， 石家莊 050051）

辣椒是常異花授粉植物，雜交制種成本較高，種子的純度難以保證，這使得辣椒雜交種的利用受到一定的限制，辣椒育種技術(shù)能力亟待提升。而辣椒雄性不育材料的發(fā)現(xiàn)及其遺傳研究為辣椒雜交種的利用提供了很好的遺傳資源和技術(shù)理論基礎(chǔ)。利用雄性不育育種可以降低制種成本，作為辣椒育種的主攻方向，近年來受到越來越多的科研院所重視。介紹了多種分子標記技術(shù)的特點，闡述了有關(guān)辣椒雄性不育研究的進展，涉及已被利用的遺傳類型、不育系和恢復系的研究，并對近年來開發(fā)的不育和保持基因標記、恢復基因標記進展進行了描述，以期為國內(nèi)辣椒育種研究者提供參考。

辣椒；雄性不育；分子標記

AbstractHot pepper is an often cross-pollinated plant, the cost of its hybrid seed production is higher and its seed purity is diffcultly ensured, which limits the use of hot pepper hybrids to a certain extent, so the pepper breeding technology needs to be improved．The discovery and genetic study of pepper male sterile materials would provide a good genetic resource and technical basis for the utilization of pepper hybrids. The use of male sterility in pepper breeding could reduce the cost of hybrid, and as a main direction of pepper breeding, it has been paid much attention to by more and more research institutes. This paper introduces the features of many molecular marker techniques, reviews the progress in the pepper male sterility research in China, including genetic types, male sterile lines and restorer lines, and describes sterile and maintaining gene markers and restoring gene markers developed in recent years, in order to provide a reference for pepper breeding researchers in China.

Key wordshot pepper; male sterility; molecular marker technique

辣椒(Capsicum annuum L.)為常異花授粉作物，雜種優(yōu)勢明顯，優(yōu)良一代雜種比常規(guī)種一般能夠增產(chǎn)30% ～ 50%[1]，并表現(xiàn)出明顯的抗病抗逆性等優(yōu)勢。利用辣（甜）椒雄性不育系生產(chǎn)一代雜交種，可以省去人工去雄手續(xù)，簡化制種程序，提高種子純度。其雄性不育主要分為兩種類型，一類是細胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），育性由細胞質(zhì)和細胞核基因共同控制；另一類是細胞核雄性不育（genic male sterility，GMS），育性僅由細胞核基因控制，不受細胞質(zhì)影響。20世紀90年代以來,隨著RAPD、RFLP、AFLP、SSR標記的應(yīng)用和不斷優(yōu)化,大大豐富了辣椒標記的種類，在辣椒分子標記和遺傳作圖方面取得了很大的進展[2]。目前，越來越多的分子標記被用于飽和遺傳圖譜、構(gòu)建種質(zhì)系統(tǒng)樹、分子輔助育種。

1 分子標記技術(shù)

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標記形式，它以蛋白質(zhì)、核酸分子的突變?yōu)榛A(chǔ)，檢測生物遺傳結(jié)構(gòu)與其變異，并能直接反應(yīng)基因組DNA間的差異[3]。分子標記技術(shù)大致分為三類：第一類基于全基因序列的分子標記，其代表技術(shù)為RFLP、RAPD、SNP和AFLP。第二類基于簡單重復序列的分子標記，指基因組中存在的由2 ～ 6個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列，代表技術(shù)為SSR、ISSR和SPAR。第三類基于已知的特定序列的分子標記,指基因組上一段已知序列的、作為位置標志的單拷貝短DNA片段，主要技術(shù)為EST。目前，分子標記技術(shù)的發(fā)展十分迅速, 被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析[4-6]、圖譜構(gòu)建[7-8]、品種鑒定[9-10]、基因定位分離[11]、性狀定位[12]、基因的表達與調(diào)控[13]和分子標記輔助選擇育種[14-15]等研究領(lǐng)域。幾種常用分子標志的特點見表1。

2 分子標記在辣椒中的應(yīng)用

1956年Edwardson 提出細胞質(zhì)不育類型不存在于自然界中，他將雄性不育分成核不育型和核質(zhì)互作型[16]。1951年，Martin等[17]首次報道隱性單基因控制的辣椒核不育材料，揭開了辣椒雄性不育研究的序幕。Peterson[18]于1958年首次報道了辣椒的核質(zhì)互作型雄性不育現(xiàn)象。此后，在辣椒雄性不育材料中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的基因。

2.1 分子標記在辣椒胞質(zhì)雄性不育中的應(yīng)用

細胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility CMC）發(fā)生的分子機理研究以及雄性不育相關(guān)基因的研究主要集中在線粒體基因上[19]。是指由于雄蕊退化、花粉敗育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉的一種母性遺傳現(xiàn)象，廣泛存在于高等植物中[20]。植物胞質(zhì)雄性不育由細胞質(zhì)不育基因（S-）和細胞核不育基因（rfrf）共同控制，但核內(nèi)恢復基因（Rf）能夠抑制不育基因（S-）的表達，從而使育性恢復。在農(nóng)業(yè)制種過程中，利用胞質(zhì)雄性不育生產(chǎn)雜交種子，不但可以省去人工去雄，降低制種成本，還能確保雜交種子純度，是植物雜種優(yōu)勢利用的基礎(chǔ)和重要途徑[21-23]。

表 1 不同分子標記的特點

隨著近年來分子技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過分子標記技術(shù)查找不育基因、保持基因和恢復基因，并進行基因定位，是目前做得最多的分子層面研究。Lee 等[24]報道了雄性部分恢復現(xiàn)象(partial restoration)，Pr/Pr 基因型的花粉表現(xiàn)為全可育，pr/pr 基因型的花粉表現(xiàn)部分可育，研究表明該基因與Rf連鎖，并開發(fā)了1個與 pr緊密連鎖（相距1.8 cM）的CAPS 標記PR-CAPS 和與3個Rf連鎖的標記（OPP13-CAPS，AFRF8-CAPS和 CRFSCAR）。王得元[25]以辣椒細胞質(zhì)雄性不育系93-A及其保持系93-B為材料，對辣椒細胞質(zhì)雄性不育基因及其保持基因開展了RAPD標記研究，結(jié)果表明：OPK-17550、OPK-171500標記可能與細胞質(zhì)雄性不育基因相連鎖，OPH-112000標記可能與保持系中的保持基因相連鎖。Kim等[26]利用2個RAPD標記OP131400（0.37 cM）、OW18800（8.12 cM）和1個CAPS標記 AFRF8CAPS（1.8 cM）對Rf基因進行了定位。王述彬[27]利用RAPD技術(shù)對細胞質(zhì)雄性不育系21A與其相應(yīng)保持系21B的基因組DNA進行了比較分析,在380個隨機引物中找到了辣椒細胞質(zhì)雄性不育系21A基因組DNA特異的RAPD片段CMS Y15500、CMS BE5850和CMS BG1900。李晶晶[2]對4 000條辣椒 EST序列進行篩選，獲得了119條含有SSR的EST，共設(shè)計出35對EST-SSR引物，占所有EST序列的0.87%。以不育系、保持系基因組DNA為模板，對EST-SSR引物進行篩選，首次獲得Pe21、Pe26和Pe27等3對特異引物，并擴增出特異片段分別為CMSPe2160、CMSPe26250、CMSPe27300。魏兵強等[28]利用近等基因系原理和RAPD標記技術(shù)，獲得了一個與不育基因連鎖的序列全長864 bp的不育標記BH19-S900。

2010年楊娟等[29]公布首次應(yīng)用SSR分子標記定位了辣椒恢復基因Rf，同時選擇30份恢復系辣椒材料，用AF208834引物進行PCR擴增，鑒定了Rf基因的純合性，純度為63.33%。劉光照等[30]利用cDNA-AFLP技術(shù)對質(zhì)-核互作型雄性不育材料進行分析，在線粒體中得到差異片段并進行SNP分析。王寧[31]用423個可獲得清晰目標條帶的多態(tài)標記，構(gòu)建了一張包含17個連鎖群的密度較高的種內(nèi)圖譜。該圖譜共372個標記，其中基于KASPar技術(shù)的SNP標記278個，SSR標記65個，CAPs標記23個，Indel標記4個，SCAR 標記1個，辣味連鎖標記1個；圖譜跨度1 407.0 cM，標記間平均距離3.78 cM，每個連鎖群包含的標記數(shù)目在5 ～40個，連鎖群的長度在 21.2 ～ 183.8 cM，圖譜上的標記都與染色體相對應(yīng)，這是辣椒中第一個報道的基于KASPar技術(shù)的SNP標記為主的圖譜。

2.2 分子標記在辣椒細胞核不育中的應(yīng)用

辣椒細胞核遺傳的雄性不育（GMS）僅受細胞核內(nèi)一對隱性基因控制，其選育和轉(zhuǎn)育方法較簡便，育成時間短，恢復譜廣。目前在辣椒上發(fā)現(xiàn)的與GMS相關(guān)的核基因約有20個[32]。研究大多集中在辣椒核不育基因的分子標記輔助選擇和育性相關(guān)基因的克隆方面[33]。

Lee等[34-36]通過運用 BSA 法和 AFLP技術(shù)找到了一個與彩色甜椒“Paprika”ms 基因緊密連鎖的CAPS 標記PmsM1-CAPS，距離ms位點2～ 3 cM；獲得了3個與辣椒ms3位點緊密連鎖的AFLP分子標記，其中一個 AFLP標記已成功轉(zhuǎn)化為CAPS標記GMS3-CAPS，能夠區(qū)分純合體和雜合體；并發(fā)現(xiàn)了一個與ms1緊密連鎖的SCAR 標記，離ms1位點約3 cM。李國琴等[37]采用c DNAAFLP方法，從辣椒雄性不育兩用系 HW58的可育株花蕾與不育株花蕾中獲得陽性差異 TDF（transcription derived fragment，轉(zhuǎn)錄衍生片段）, 通過電子克隆獲得865 bp的c DNA 序列，其與煙草CP26基因序列的同源性高達90%，命名為CaCP26（Gen Bank 登錄號為 GQ999612）。韓清[33]等利用cDNA-AFLP技術(shù)，比較分析了辣椒核雄性不育兩用系中不育植株與可育植株花藥發(fā)育過程中基因表達的差異。用1024對選擇性擴增引物進行篩選，共獲得了168個轉(zhuǎn)錄衍生片段（transcript-derived fragment，TDFs）。通過BLAST比對分析，多數(shù)TDFs未找到對應(yīng)的同源序列，可能代表了新基因；48個TDFs在數(shù)據(jù)庫中找到了同源序列（Gen Bank 登錄號：JK993564 ～ JK993611），并對這些序列進行功能分類。

嚴慧玲等[38]利用SRAP分子標記技術(shù)，篩選了225對SRAP引物組合及1393對EcoRⅠ和MseⅠ引物組合，獲得了與隱性核不育基因連鎖的2個SRAP標記E37M39和E44M93，其片段長度分別為200 bp和500 bp，與育性基因的遺傳距離分別為6 cM和12 cM。Bartoszewski等[39]將核隱性雄性不育基因ms8定位在染色體P4的長臂上，該基因位于SCAR-P2（4.6 cM）和C2-At5g-25900（34.5 cM）標記之間，這是第一次報道辣椒核不育基因定位的連鎖群與染色體編號一致。劉辰等[40]通過半定量RT-PCR 技術(shù)分析候選EST在辣椒可育株和不育株中的表達情況。利用RACE技術(shù)獲得4個育性相關(guān)基因（CaSEP1、CaPROF、CaOlee 6和CaPCP）。其中，CaSEP1全長1 108 bp，編碼221個氨基酸，含有一個 MADS 結(jié)構(gòu)域和一個K結(jié)構(gòu)域；CaPROF全長767 bp，編碼131個氨基酸，含有一個PROF結(jié)構(gòu)域；CaOlee 6全長523 bp，編碼85個氨基酸，含有一個Olee6結(jié)構(gòu)域； CaPCP全長563 bp，編碼66個氨基酸。

3 展望

辣椒雄性不育是替代雜交制種中人工去雄最有效的方法，目前在韓國、印度和中國開展較多，我國很多地方已經(jīng)育成了不育品種，并用于商業(yè)化雜交制種，但是利用分子標記技術(shù)進行辣椒雄性不育研究的報道還不多[41]。辣椒雄性不育的基礎(chǔ)研究還十分薄弱，離全面認識辣椒雄性不育的機理相距甚遠，發(fā)現(xiàn)的20個雄性不育基因除少部分精確定位到染色體上，大部分還未精確定位。2014年辣椒進行了全基因組測序，構(gòu)建了高密度的連鎖圖譜，并組裝得到高質(zhì)量的基因組精細圖譜，其中約90%的基因都錨定到這些染色體上[42-43]。測序的完成有助于從更深層次探索辣椒雄性不育的分子機理。

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Research Progress in Molecular Marker Techniques on Hot Pepper Male Sterility

MENG Yaning YAN Libin FAN Yanqin*
（Institute of Economic Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051, China）

2017-02-19

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0101704)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蔬菜創(chuàng)新團隊項目（HBCT2013050202）；河北省青年基金（C2016301087）；基本科研業(yè)務(wù)費（A2015050102）

孟雅寧（1984-），女，助理研究員，碩士，研究方向為蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種；Tel：0311-87652104，E-mail：yaningmeng@126.com

*通信作者：范妍芹（1961-），女，研究員，主要從事辣、甜椒栽培和遺傳育種方面的研究工作；Tel：0311-87652104，E-mail：tianjiaoshi@126.com