正交試驗(yàn)優(yōu)化獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素的醇提工藝Δ

許啟榮，周 瓊，張紫萍，陳 糾(廣州市第十二人民醫(yī)院藥劑科，廣州 510620)

正交試驗(yàn)優(yōu)化獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素的醇提工藝Δ

許啟榮＊，周 瓊，張紫萍，陳 糾(廣州市第十二人民醫(yī)院藥劑科，廣州 510620)

目的:優(yōu)選獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素的醇提工藝。方法:采用高效液相色譜法測(cè)定雷公藤紅素的含量。以提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為考察因素，以雷公藤紅素的提取率為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果:最優(yōu)醇提工藝為45%甲醇提取3次、每次2 h、料液比1∶8;驗(yàn)證試驗(yàn)中，雷公藤紅素的平均提取率為0.917mg/g(RSD=2.85%，n=3)。結(jié)論:本研究?jī)?yōu)化的醇提工藝穩(wěn)定可行、提取率較高，適用于獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素的提取。

獨(dú)子藤;雷公藤紅素;單因素;正交試驗(yàn);高效液相色譜法

獨(dú)子藤(Celastrusmonospermus Roxb.)為衛(wèi)矛科南蛇屬植物，分布于越南、印度及我國(guó)福建、廣東、云南、貴州、廣西等省區(qū)的林帶中[1]。研究表明，獨(dú)子藤含有一定量的生物堿和三萜類成分，其中木栓烷型三萜類化合物具有顯著的抗癌活性[2]。

雷公藤紅素又名南蛇藤醇/素，外觀呈紅色針狀結(jié)晶，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，分子式為C29H38O4，分子量為450，能與半胱氨酸的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)[3]，具有抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等多種藥理活性[4]。目前，對(duì)獨(dú)子藤中雷公藤紅素的提取報(bào)道較少，其優(yōu)化提取工藝報(bào)道更少。本文對(duì)獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素提取工藝的主要影響因素進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)研究，為更合理有效地提取藤果實(shí)中的雷公藤紅素提供參考。

1 材料

1.1 儀器

SartoriusBP211D電子天平(德國(guó)賽多利斯公司); 1100高效液相色譜(HPLC)儀，包括G1315B二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、1100色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)。

1.2 藥材、對(duì)照品與試劑

雷公藤于2008年10月采自廣東陽(yáng)春地區(qū)，由廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院李書淵教授鑒定為獨(dú)子藤(Celastrus monospermus Roxb.)的果實(shí);雷公藤紅素對(duì)照品(上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號(hào):P0259，純度:≥98%);甲醇、磷酸均為色譜純。

2 獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素醇提液的制備和含量測(cè)定

2.1 雷公藤紅素醇提液的制備

稱取獨(dú)子藤果實(shí)約15.0 g，粉碎，精密稱定，甲醇回流提取3次，提取液過濾后合并，回收甲醇，干燥至無(wú)醇味。將樣品用三氯甲烷超聲溶解，在硅膠柱上用三氯甲烷洗脫，回收洗脫液，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?00m L量瓶中，用0.45μm微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

2.2 雷公藤紅素的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品貯備液的制備 稱取雷公藤紅素對(duì)照品5.03mg，精密稱定，甲醇溶解，定容至25m L量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.201 2mg/m L的對(duì)照品貯備液。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱:Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:甲醇-5%磷酸(80∶20，V/V);流速:1.0m L/m in;檢測(cè)波長(zhǎng):426 nm;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20μL。在此色譜條件下，取“2.1”和“2.2.1”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果，理論板數(shù)以雷公藤紅素計(jì)不低于18 076，分離度＞1.5。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0m L于5m L量瓶中，甲醇定容，搖勻，制得系列對(duì)照品工作液。依次吸取對(duì)照品工作液各20μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以雷公藤紅素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=3.377 8×103x-1.852 3×104(r=0.999 3)。結(jié)果表明雷公藤紅素在40.24～200.12μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取雷公藤紅素對(duì)照品貯備液，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果峰面積的RSD=3.03%(n=6);連續(xù)6 d分別進(jìn)樣1次測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD=4.38%(n=6)。結(jié)果表明日內(nèi)、日間精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次的雷公藤果實(shí)，按“2.1”項(xiàng)方法處理后，分別于室溫放置0、1、2、4、6 h后按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，峰面積的RSD= 3.37%(n=5)，表明樣品于室溫環(huán)境下6 h穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的雷公藤果實(shí)，共5份，按“2.1”項(xiàng)下方法處理后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD=4.46%(n=5)，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一批次的雷公藤果實(shí)，按“2.1”項(xiàng)方法處理后，分別按高、中、低質(zhì)量(1.0、0.5、0.1mg)加入雷公藤紅素對(duì)照品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收為95.38% (RSD=4.26%，n=9)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

3 單因素考察及正交試驗(yàn)

3.1 單因素考察

3.1.1 甲醇體積分?jǐn)?shù) 固定提取時(shí)間為2 h、提取1次、料液比為1∶10，分別考察甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%、35%、45%、55%、65%、75%時(shí)雷公藤紅素的提取率(提取到的雷公藤紅素的質(zhì)量/處理前雷公藤果實(shí)的質(zhì)量)。結(jié)果，甲醇體積分?jǐn)?shù)在25%～45%之間雷公藤紅素提取率呈上升趨勢(shì)，45%之后開始下降，45%時(shí)提取率最高。故本試驗(yàn)確定45%甲醇為固定的提取溶劑。

3.1.2 提取時(shí)間 固定提取次數(shù)為1次、料液比為1∶10，分別考察提取時(shí)間為1、1.5、2、2.5、3 h條件下雷公藤紅素的提取率。結(jié)果，提取時(shí)間在1～2 h內(nèi)雷公藤紅素提取率呈明顯上升趨勢(shì)，2.5 h之后基本趨于平穩(wěn)并幾乎沒有增加。故確定以提取時(shí)間1.5～2.5 h為正交試驗(yàn)的考察水平。

3.1.3 提取次數(shù) 固定料液比為1∶10、提取時(shí)間為2 h，分別考察提取次數(shù)為1、2、3、4、5次時(shí)雷公藤紅素的提取率。結(jié)果，提取1～3次時(shí)雷公藤紅素提取率明顯增加，提取4～5次時(shí)提取率增加甚微。考慮到提取3次可能已經(jīng)將雷公藤紅素基本提取完全，故確定以提取1～3次為正交試驗(yàn)的考察水平。

3.1.4 料液比 固定提取時(shí)間為2 h、提取1次，分別考察料液比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12時(shí)雷公藤紅素的提取率。結(jié)果，隨著料液比的增加，雷公藤紅素提取率有所增加，而料液比為1∶8～1∶12時(shí)提取率增加趨勢(shì)不明顯。考慮到今后的生產(chǎn)成本，故確定以料液比1∶8～1∶10為正交試驗(yàn)的考察水平。

3.2 正交試驗(yàn)

以提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)為考察因素，以雷公藤紅素提取率為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表1，設(shè)計(jì)安排與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平表Tab 1 Factorsand levels

由表2可知，極差R值顯示因素作用主次為B＞A＞C，即提取次數(shù)是重要影響因素。方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)提取率的影響達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。結(jié)合環(huán)境保護(hù)與經(jīng)濟(jì)考量，確定最優(yōu)提取工藝組合為A3B3C1，即提取2 h、提取3次、料液比為1∶8。此條件下雷公藤紅素的提取率為0.995mg/g。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Design and resultoforthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Resultof varianceanalysis

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)提取工藝，稱取適量的獨(dú)子藤果實(shí)共3份，按“2.1”項(xiàng)下方法處理后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，平均提取率為0.917mg/g(RSD=2.85%，n= 3)，表明此條件具有良好的重復(fù)性、工藝穩(wěn)定，可用于雷公藤紅素的提取。

4 討論

近年來(lái)，雷公藤紅素的多種藥理活性不斷被發(fā)現(xiàn)，如抗炎及免疫抑制、抗纖維化、抗腫瘤血管生成、增強(qiáng)瘦素敏感性等[5]，有望用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]、糖尿病[7]、阿爾茨海默病[8]、肥胖癥[9]和多種癌癥[10]。雷公藤紅素的抗腫瘤機(jī)制一直不明確，直至2006年中美科學(xué)家聯(lián)合發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的抗癌新機(jī)制后，其抗白血病作用得到越來(lái)越多的重視[11]。

本試驗(yàn)在文獻(xiàn)[12-13]的基礎(chǔ)上，比較了兩種流動(dòng)相[乙腈-5%磷酸(80∶20)、甲醇-5%磷酸(80∶20)]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2種流動(dòng)相下對(duì)照品的峰形更好。比較了3種檢測(cè)波長(zhǎng)(425、426、544 nm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)426 nm波長(zhǎng)處有較好的吸收，干擾少;篩選了3種流速(0.8、1.0、1.2m L/m in)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速為1.0m L/m in時(shí)分離效果較好，流速低時(shí)有拖尾現(xiàn)象，流速高時(shí)分離不完全。

目前，對(duì)雷公藤中活性成分的提取溶劑主要有水、甲醇、乙醇、二氯乙烷，本試驗(yàn)在文獻(xiàn)[14-16]的基礎(chǔ)上，選擇了甲醇提取;因素與水平的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[17]，并對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效率的影響進(jìn)行了單因素考察，最終確定45%甲醇作為提取溶劑。比較了直接進(jìn)樣和經(jīng)硅膠柱層析純化再進(jìn)樣的色譜圖。結(jié)果顯示，前者雜質(zhì)峰較多，對(duì)色譜柱的污染較大;而后者能有效去除其他極性雜質(zhì)，雷公藤紅素分離較好，可有效排除其他干擾。

本試驗(yàn)優(yōu)選得到的獨(dú)子藤果實(shí)中雷公藤紅素的最佳提取工藝為45%甲醇回流提取3次，每次2 h，料液比為1∶8。該法簡(jiǎn)便易行、工藝穩(wěn)定，可用于獨(dú)子藤中雷公藤紅素的提取。

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Optim ization of M ethanol Extraction Technology for Trip terine in the Fruit of Celastrus monospermus by Orthogonal Design

XU Qirong，ZHOU Qiong，ZHANG Zhiping，CHEN Jiu(Dept.of Pharmacy，Guangzhou 12th Hospital，Guangzhou 510620，China)

OBJECTIVE:To optim ize the methanol extraction technology of tripterine in the fruit of Celastrus monospermus. METHODS:HPLC was adopted to determ ine the content of tripterine.Using extraction time，extraction times，solid-liquid ratio as investigation factors，extraction rate of tripterine as investigation index，orthogonal testwas designed，and verification testwas conducted.RESULTS:The optimalmethanol extraction technology was as follow as 45%methanol extracting 2 h each time w ith solid-liquid ratio of 1∶8 for 3 times.In the verification test，the average extraction rate of tripterine was 0.917 mg/g(RSD=2.85%，n=3).CONCLUSIONS:The optim ized methanol extraction technology is stable and feasible w ith high extraction rate，and is suitable for the extraction of tripterine in the fruit of C.monospermus.

Celastrusmonospermus;Tripterine;Single factor;Orthogonal test;HPLC

R932

A

1001-0408(2017)19-2677-03

2017-01-12

2017-05-01)

(編輯:劉明偉)

廣東省自籌經(jīng)費(fèi)類科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.粵科規(guī)財(cái)字〔2015〕110號(hào))

＊主管藥師。研究方向:臨床藥學(xué)。電話:020-38981270。E-mail:x82521326@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.24