一株普通鵟源H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定

曾志燎，茹開卓，溫暖玲，茹正忠*

(1.深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣東深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東深圳 440300)

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一株普通鵟源H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定

曾志燎1，茹開卓1，溫暖玲2，茹正忠1*

(1.深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣東深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東深圳 440300)

從深圳野生鳥類救護(hù)基地的1只普通鵟的泄殖腔拭子中分離到1株禽流感病毒，將該禽流感病毒進(jìn)行雞胚接種和HA、HI試驗(yàn)鑒定、HA基因擴(kuò)增及測(cè)序分析，并進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果表明，該分離株為H9N2亞型禽流感病毒， 按照國際流感病毒系統(tǒng)命名原則將該病毒株暫命名為A/Wild bird /Guangdong/ SZ-YN05/2015(H9N2)。進(jìn)化分析顯示，該毒株屬于4.2.1分支，與SS/94株同源性較低，與A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014(H9N2)的遺傳距離最近。同時(shí)以血凝價(jià)HA 8 log2 病毒尿囊液稀釋200倍靜脈注射接種感染4周SPF雞，感染3 d后從心、肝、肺、腎、氣管、咽及肛分別檢測(cè)到病毒，感染7 d后從心、肝、肺、腎、氣管均未分離到病毒，咽部病毒分離率2/6，肛部病毒分離率3/6。

H9N2亞型禽流感病毒；分離鑒定；HA基因

禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一種烈性傳染病。禽流感病毒是分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，宿主范圍較廣[1]，據(jù)報(bào)道，主要有雞、火雞、鴨、鵪鶉、鷓鴣及鵝等家禽[2]，天鵝、鴕鳥、燕鷗及海鳩等野禽，甚至還包括了人、老鼠及豬、馬等哺乳動(dòng)物[3]，從而給社會(huì)公共安全帶來了一定的威脅。20世紀(jì)初，包括我國在內(nèi)，泰國、巴基斯坦、澳大利亞、日本及伊拉克等國相繼從死亡野生鳥類中分離到了H7N1、H5N1及H9N2等亞型AIV[4]。截止2016年初，摩洛哥于2016年1月中旬首次暴發(fā)了H9N2亞型禽流感[5]，而我國的上海、山東及安徽等近幾年也相聚分離到了幾株H9N2亞型禽流感病毒[6-7]，而H9N2亞型禽流感能夠跨地域出現(xiàn)，與野生鳥類的遷徙不無關(guān)系。據(jù)研究表明，我國的華東和華南等養(yǎng)禽業(yè)比較發(fā)達(dá)的地區(qū)為H9N2亞型禽流感病毒的主要分布區(qū)[8]，而深圳屬于華南地區(qū)，同時(shí)也是候鳥留鳥等的遷徙途徑之地，野生鳥類作為病原的攜帶者，是病毒跨地域擴(kuò)散的潛在宿主。因此，務(wù)必引起一定程度的重視[9]。

本研究是將2015年從深圳野生鳥類救護(hù)基地的1只普通鵟的拭子中分離到的1株禽流感病毒進(jìn)行鑒定與生物信息學(xué)分析及致病性試驗(yàn)，為野生禽類的禽流感流行情況和防控提供一定的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本和SPF雞 樣本來源于2015年廣東省深圳市野生鳥類救護(hù)基地的1只普通鵟的拭子樣本,置于病毒運(yùn)輸保存液中低溫保存；9日齡～11日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 H9標(biāo)準(zhǔn)抗原購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；抗新城疫病毒、抗H5和H9亞型禽流感病毒等標(biāo)準(zhǔn)陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；病毒核酸提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA 聚合酶、質(zhì)粒pMD 18-T simple vector 、大腸埃希菌DH5α、DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；膠回收純化試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離與HA亞型的鑒定 無菌處理采集的泄殖腔拭子，按照0.1 mL/胚接種9日齡～11日齡SPF雞胚尿囊腔，37℃孵化，每天照蛋2次，連續(xù)觀察6 d，棄去24 h污染死胚，將死亡或?yàn)l死雞胚置4℃ 4 h以上，剖檢，觀察胚胎病變，收獲1 d～4 d內(nèi)活的或死亡的雞胚尿囊液，測(cè)其血凝效價(jià)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算EID50。

將有血凝活性的雞胚尿囊液分別與抗新城疫病毒、抗H5及H9亞型禽流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制(HI)試驗(yàn),具體操作程序按照OIE的國際標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[9],將鑒定過的病毒分裝,置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒特異性片段的PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank中發(fā)表的禽流感病毒基因序列(登錄號(hào): KC986294、AY790313),用 Primer 5 .0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)HA 基因引物，預(yù)期擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為1 696 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列如下：

HA-F：TCAAGATGGAAGTAGTATCACT

HA-R：TTTGCCAATTATATACAAATGTTG

1.2.2.2 病毒核酸的提取與擴(kuò)增 根據(jù)病毒核酸提取試劑盒說明書提取收集的雞胚尿囊腔病毒液的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板按以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃ 5 min，然后進(jìn)入循環(huán)：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min～3 min， 35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L的瓊脂糖凝膠上樣孔中，130 V電泳30 min進(jìn)行檢測(cè)。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用于克隆。

1.2.2.3 HA序列的測(cè)定與分析 將膠回收產(chǎn)物連接至pMD 18-T simple vector，進(jìn)行克隆，并將克隆產(chǎn)物送至深圳華大基因有限公司測(cè)序。將所獲取的序列用DNA Star 7.0進(jìn)行拼接與分析，獲得HA全基因序列。從Influenza Virus Sequence Database中選取51株H9N2亞型AIV株HA基因；再從近年本中心從國內(nèi)19省鑒定的100株雞源的H9N2亞型AIV基因序列和29個(gè)WS參考序列；用MEGA4.0基因分析軟件繪制1980年-2015年中國H9N2禽流感病毒HA基因分子進(jìn)化樹。

1.2.3 分離株對(duì)SPF雞的致病性試驗(yàn) 以106EID50或10 log2尿囊液10倍稀釋，靜脈注射接種 3

周齡SPF雞(10只)，接種后3 d～7 d咽肛拭子采集，檢測(cè)排毒情況；接種后3 d和7 d各取3只雞進(jìn)行剖檢，取氣管、肺、肝、脾、腎各1 g，用含雙抗的PBS碾磨勻漿1 mL，接種9日齡雞胚，48 h收取尿囊液測(cè)HA效價(jià)；并于接種后3、7、14、21、28 d各采血1 mL，分離血清，測(cè)抗體效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與HA亞型的鑒定

拭子經(jīng)過處理后接種9 d～11 d SPF雞胚，收集到的雞胚尿囊液能夠凝集1%的雞紅細(xì)胞，血凝價(jià)為10 log2，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算EID50為106。用抗新城疫病毒、H5和H9亞型禽流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制(HI)試驗(yàn)，抗新城疫病毒和抗H5亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對(duì)該病毒血凝不產(chǎn)生抑制作用，而抗H9亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能夠產(chǎn)生抑制作用，血凝抑制效價(jià)達(dá)到8 log2，從而表明這份尿囊液含有H9亞型禽流感病毒。

2.2 病毒特異性片段的PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)定

病毒特異性片段經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到了目的片段，通過克隆及測(cè)序所獲得的HA序列長(zhǎng)度為1 696 bp，包含有完整的開放閱讀框，與預(yù)期相符。將測(cè)序獲得的HA基因序列經(jīng)DNA Star 7.0 軟件包中的Seqman 軟件校對(duì)正確無誤后，登錄NCBI進(jìn)行Blast 分析，分析鑒定為H9N2亞型禽流感病毒，命名為A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015(H9N2)。與GenBank中的毒株A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014(H9N2)的遺傳距離最近，同源性為97.5%。

2.3 分離株對(duì)SPF雞的致病性試驗(yàn)

以血凝價(jià)HA為 8log2 病毒尿囊液稀釋200倍靜脈注射接種感染4周齡SPF雞，感染后3 d，心、肝、肺、腎、氣管、咽及肛分別檢測(cè)到病毒，感染后7 d，心、肝、肺、腎及氣管未分離到病毒，咽部病毒分離率2/6，肛部病毒分離率3/6，如表1所示。

表1 A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015(H9N2)感染 SPF雞病毒分布情況

3 討論

2015年從深圳野生鳥類救護(hù)基地的一只普通鵟的泄殖腔拭子中分離到的H9N2亞型禽流感病毒，按照國際流感病毒系統(tǒng)命名原則將該病毒株暫命名為A/Wild bird /Guangdong/ SZ-YN05/2015(H9N2)，為國內(nèi)外首次從普通鵟中分離到的禽流感病毒。禽流感是由A型流感病毒引起的可感染禽類和人類等具有宿主廣泛性的一類高度接觸性傳染病。世界上第1株H9N2亞型禽流感病毒Ty/Wisconsin/1/66于1966年由Homme分離得到，在我國的第1株H9N2亞型禽流感病毒被陳伯倫所分離[10]，時(shí)隔半個(gè)世紀(jì)，雖然H9N2目前還沒有對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成明顯的損失，只是潛在的降低生產(chǎn)能力等，但是，禽流感病毒的HA亞型基因與NA亞型基因的復(fù)雜性，決定了禽流感高變異的性質(zhì)，低致病性會(huì)向高致病性突變，且宿主范圍也越來越廣，從1999 年第1次分離到了人源H9N2 亞型禽流感病毒后，人源H9N2 亞型禽流感的報(bào)道逐漸增多，可見H9N2亞型禽流感傳播的廣泛性。據(jù)報(bào)道，某些宿主存在高致病性和低致病性禽流感混合感染的情況，在此條件下，很難否定高致病性禽流感與低致病性禽流感的基因會(huì)因抗原漂移發(fā)生重組變異甚至產(chǎn)生新的病毒[11]，增加禽流感的防控難度。

野生鳥類攜帶禽流感病毒現(xiàn)象十分普遍，在雞、鴨、鵝、斑鳩、麻雀、百靈、八哥及天鵝等許多鳥類身上都檢測(cè)出AIV抗體陽性[12]。經(jīng)研究揭示，遷徙候鳥在禽流感病毒全球性傳播中扮演著“載體”和“傳播器”的重要角色[13]。野禽尤其是水禽是流感病毒的巨大儲(chǔ)庫，迄今已在88種鳥類中分離到病毒。候鳥可以在遷徙過程中通過直接接觸或水媒介將自身攜帶的病毒傳播給家禽[14]。而在一些地方，存在人類捕捉候鳥的情況，從而使禽流感病毒得以感染人類。雖然從野生鳥類，包括野鴨身上分離出的禽流感病毒基本上都是低致病性病毒，但是，AIV具有高度的誘導(dǎo)突變能力，能迅速改變其類型和毒力，最終成為具有高致病性的類型。因此，家禽暴發(fā)禽流感與野鳥是密切相關(guān)的。為了控制野生鳥類向家禽傳播禽流感，進(jìn)而預(yù)測(cè)和有效防治禽流感的暴發(fā)，對(duì)野鳥的帶毒狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析是十分必要的。野鳥群體龐大，種類繁多，候鳥來去路徑復(fù)雜，存在傳播擴(kuò)散禽流感病毒的較高風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)該區(qū)域野生鳥類及周邊區(qū)域家禽建立長(zhǎng)期科學(xué)的禽流感流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查，及時(shí)客觀的評(píng)價(jià)周邊區(qū)域感染及防控狀態(tài)，對(duì)禽流感疫情的預(yù)警和制定科學(xué)的防控措施有著重要意義。

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Isolation and Identification of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus fromButeobuteo

ZENG Zhi-liao1, RU Kai-zhuo1, WEN Nuan-ling2, RU Zheng-zhong1

(1.ShenzhenWildlifeRescueCentre,Shenzhen,Guangdong, 440300，China; 2.ShenzhenZhenheliEcologicalEnvironmentConstructionCo.,Ltd.,Shenzhen,Guangdong, 440300，China)

An avian influenza virus was isolated from the cloacal swab of aButeobuteoin Shenzhen Wild Bird Rescue Center. The avian influenza virus was identified by inoculating chicken embryo and hemagglutination(HA), hemagglutination inhibition(HI), HA gene amplification and sequencing, as well as pathogenicity test. The results showed that the isolate was H9N2 subtype avian influenza virus, and named A/Wild bird/Guangdong/SZ-YN05/2015 (H9N2), according to the international influenza virus system naming rules. The phylogenetic analysis showed that the strain belonged to 4.2.1 and had the same homology with SS/94 strain, and the genetic distance from A/Chicken/Shandong/GM-TH/2014 (H9N2) was the closest. At the same time, 4 week SPF chickens were infected with the virus by intravenous injection with 8 log2 HA titer diluted 200 times. After 3 days of infection, the virus was detected from the heart, liver, lung, kidney, trachea, pharynx and anus swabs respectively.But after 7 days, the virus was not isolated from heart, liver, lung, kidney, trachea, while pharyngeal virus isolation rate was 2/6, anal virus isolation rate was 3/6.

H9N2 subtype Avian influenza virus; isolation and identification; HA gene

2016-12-01

深圳市城管局科研項(xiàng)目(201421)

曾志燎(1985-)，男，廣東河源人，獸醫(yī)師，獸醫(yī)碩士，主要從事野生動(dòng)物救護(hù)和野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)工作。*通訊作者

S852.659.5;S865.34

B

1007-5038(2017)07-0112-04