LLC種植瘤靶向USPIO標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞MRI活體示蹤試驗(yàn)

王雪芹，張永峰，趙榮榮，王希臻，王海宇

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院影像中心，山東濰坊 261031；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東濰坊 261031)

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LLC種植瘤靶向USPIO標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞MRI活體示蹤試驗(yàn)

王雪芹1，張永峰2，趙榮榮1，王希臻1，王海宇1

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院影像中心，山東濰坊 261031；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東濰坊 261031)

將超順磁性氧化鐵微粒-多聚賴氨酸(USPIO-PLL)標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)移植入小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)種植瘤模型小鼠，利用3.0TMR對(duì)HUMSCs的活體示蹤技術(shù)，觀察移植小鼠體內(nèi)的HUMSCs 磁共振(MRI)信號(hào)及腫塊大小的變化，探討HUMSCs移植肺癌動(dòng)物模型后的定向遷移、轉(zhuǎn)化情況及間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)腫瘤的影響。以PLL為轉(zhuǎn)染劑，用USPIO對(duì)HUMSCs-PLL進(jìn)行磁性標(biāo)記；將磁標(biāo)記的HUMSCs通過鼠尾靜脈移植入Lewis肺瘤細(xì)胞(LLC)種植瘤小鼠體內(nèi)，分別于移植前、移植后1 d、10 d進(jìn)行MRI觀察。結(jié)果顯示，USPIO-PLL可安全有效標(biāo)記HUMSCs，標(biāo)記率大于96%，細(xì)胞活性達(dá)標(biāo)。移植后1 d MRI可監(jiān)測(cè)到HUMSCs到達(dá)腫瘤區(qū)，10 d到達(dá)腫瘤區(qū)MSCs增多，MRI信號(hào)顯著降低(P<0.05)。建模成功后，各試驗(yàn)組移植后1 d和10 d腫瘤體積差異不顯著(P>0.05)；移植后1 d和10 d抑瘤率均為正值。說明3.0T MRI可以有效進(jìn)行標(biāo)記干細(xì)胞移植后的活體示蹤。HUMSCs對(duì)LLC種植瘤有定向趨化作用，可以聚集至腫瘤區(qū)域發(fā)揮抑瘤作用，又可促進(jìn)腫瘤血管生成，多種影響相互交叉最終抑制腫瘤生長(zhǎng)。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；肺癌；超微超順磁性氧化鐵微粒；磁共振成像

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和病死率居首位的惡性腫瘤，治療療效不理想，5年生存期不到15%[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs) 是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，它不單具有多向分化潛能，還能靶向遷移到毀傷組織、炎癥區(qū)域及腫瘤部位[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤的影響越來越吸引醫(yī)療界的關(guān)注，但觀點(diǎn)分歧較大[2-7]，主要分為促進(jìn)腫瘤成長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤成長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、對(duì)腫瘤的成長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移沒有明顯影響3種不同觀點(diǎn)。隨著對(duì)腫瘤研究新思路的不斷擴(kuò)展，MSCs必將成為研究腫瘤發(fā)展和治療的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選健康4周齡～6周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠30只，體重 20 g～30 g，全部小鼠均購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。小鼠隨機(jī)編號(hào)，按如下條件飼養(yǎng)：溫度23 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度40%～70%；飼養(yǎng)籠具為小鼠籠(290 mm×180 mm×160 mm)，分籠飼養(yǎng)；籠具、墊料、飲用水及飼料均按試驗(yàn)要求標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)備，小鼠自主飲食。

1.1.2 主要試劑與藥物 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(Lewis lung cancer cells，LLC)株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)； 多聚賴氨酸(poly-L-lysine, PLL)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清( fetal bovine serum, FBS)，北京Solarbio公司產(chǎn)品；超小型超順磁氧化鐵粒子(uhrasmall superparamagntiec iron oxide，USPIO)，美國(guó)Guerbet公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Signa 3.0T 磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)掃描儀，美國(guó)通用電氣公司產(chǎn)品；HERAcell150i型CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；CKX41倒置顯微鏡，日本奧林帕斯公司產(chǎn)品；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 制備小鼠LLC種植瘤模型

1.2.1.1 小鼠LLC細(xì)胞的解凍與培養(yǎng) 從液氮罐取出小鼠肺癌細(xì)胞(lewis lung carcinoma，LLC)凍存管，即刻置于37℃水浴解凍。待全部解凍后，置于凈化工作臺(tái)，吸取細(xì)胞懸液，注入10倍DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d～3 d傳代1次。

1.2.1.2 小鼠肺癌LLC移植瘤模型制作 將成長(zhǎng)狀況佳的LLC細(xì)胞懸液離心(1 000 r/min，5 min)，上清棄盡，然后加入培養(yǎng)液，細(xì)胞濃度調(diào)達(dá)到5×106個(gè)/mL，用注射器刺入小鼠左側(cè)腋部皮下組織內(nèi)，0.2 mL/只。接種后每天觀察小鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)度等一般狀況及成瘤情況。

1.2.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs)的體外分離、培養(yǎng)及傳代 在凈化工作臺(tái)，將臍帶剪碎至約1 mm×1 mm×1 mm小粒，接種在含有100 mL/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)出原代細(xì)胞。原代細(xì)胞接種到T-25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱，遵照干細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行消化傳代。

1.2.3 USPIO標(biāo)記HUMSCs和表面標(biāo)記物鑒定 USPIO加到P3代MSCs培養(yǎng)液中進(jìn)行標(biāo)記，細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)100 mL/L FBS和雙抗DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第4代細(xì)胞，配制成細(xì)胞懸液，用鼠抗人PE標(biāo)記的CD73及同型對(duì)照10 μL，4℃避光孵育30 min，PBS液洗滌3次后流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及磁標(biāo)記HUMSCs移植 LLC移植瘤模型建模成功后進(jìn)行細(xì)胞移植，小鼠稱重，隨機(jī)分成2組：對(duì)照組15只(NS組)，試驗(yàn)組15只(MSCs組)。NS組，注射生理鹽水0.2 mL/只；MSCs組，用1 mL醫(yī)用注射器將0.2 mL USPIO標(biāo)記HUMSCs(細(xì)胞濃度3×106/mL)細(xì)胞懸液經(jīng)鼠尾靜脈注射。

1.2.5 USPIO標(biāo)記HUMSCs移植后小鼠3.0TMRI動(dòng)態(tài)觀察

1.2.5.1 MRI掃描方式及條件 分別于建模成功后及HUMSCs移植后1 d和10 d進(jìn)行MR觀察，常規(guī)準(zhǔn)備后，用GE3.0MR掃描儀和腕關(guān)節(jié)線圈，將麻醉后小鼠按標(biāo)準(zhǔn)姿勢(shì)固定于大注射管內(nèi)，小鼠置入腕關(guān)節(jié)線圈內(nèi)。掃描體位、掃描序列及掃描參數(shù)(略)。

1.2.5.2 信號(hào)變化 信號(hào)改變以下列公式計(jì)算：△SI=[(SIL-SIU)/SIU]×100%(△SI為信號(hào)變化率，SIL為腫瘤區(qū)標(biāo)記細(xì)胞信號(hào)，SIU為腫瘤組織信號(hào))。

1.2.5.3 腫瘤MRI變化 MRI觀察間充質(zhì)干細(xì)胞移植肺癌小鼠后生殖存活、遷移、歸巢情況，并分別于HUMSCs移植前、后行MRI，觀察記錄腫瘤的大小、部位、形態(tài)、信號(hào)變化等情況，測(cè)量腫瘤體積。

1.2.5.4 計(jì)算抑瘤率 移植10 d后進(jìn)行MRI掃描，然后斷頸椎處死全部小鼠，完整切除小鼠肺瘤體后稱重，按公式計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=(NS組瘤重均值-HUMSCs組瘤重均值)/NS組瘤重均值×100%，正值表示間充質(zhì)干細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)，負(fù)值表示促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 依據(jù)不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、不同的目的采取相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法，所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0完成。

2 結(jié)果

2.1 成功培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

顯微鏡下觀察干細(xì)胞形態(tài)特征及成長(zhǎng)狀況，用人臍帶成功培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，用USPIO-PLL作為細(xì)胞內(nèi)對(duì)比劑可以安全高效的標(biāo)記HUMSCs，標(biāo)記率大于96%，細(xì)胞成長(zhǎng)狀況良好。

2.2 3.0MRI圖像結(jié)果

2.2.1 病變區(qū)信號(hào)變化 腫瘤在T1加權(quán)序列呈等或稍低信號(hào)，T2WI、T2FLAIR序列呈稍高信號(hào)(圖1)，移植后 1 d和10 d MR FSE T2WI掃描序列上在腫瘤周圍可見呈現(xiàn)點(diǎn)狀、短線狀低信號(hào)，即USPIO標(biāo)記的MSCs MR信號(hào)，1 d時(shí)MRI低信號(hào)位于腫瘤邊緣(圖2)；10 d時(shí)病灶區(qū)低信號(hào)明顯多于1 d，且有向病灶中心遷移趨勢(shì)(圖3和表1)，說明MSCs可向小鼠腫瘤區(qū)定向趨化，且10 d到達(dá)病灶MSCs數(shù)目較1 d增多并向腫瘤中心遷移，進(jìn)行增殖、分化。NS對(duì)照組于 FSE T2WI 加權(quán)像上未見明顯信號(hào)減低區(qū)。

圖1 LLC種植成功后MRI圖像

2.2.2 腫瘤體積比較 建模成功后腫瘤體積為1.92cm3±1.16 cm3，MSCs組移植后1 d為1.86 cm3±1.36 cm3，移植后10 d為 1.12 cm3±1.06 cm3，MSCs移植后10 d體積較NS組及移植前有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NS組不同時(shí)間體積差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

圖2 MSCs移植1天MRI圖像

圖3 MSCs移植10MRI圖像

序列Sequence移植后1d1dayaftertransplantation移植后10d10daysaftertransplantationFPFSET2WI21.66±5.3852.68±4.3559.16<0.01

2.3 抑瘤率

表3顯示，移植10 d抑瘤率為19.8%， 1 d為抑瘤率為5.08%，均為正值。

3 討論

3.1 MSCs與腫瘤關(guān)系

近年來，MSCs對(duì)腫瘤作用成為醫(yī)療界研究熱點(diǎn)，來自不同實(shí)驗(yàn)室的研究帶來不同聲音[2,5-8]，主要有3種不同的觀點(diǎn)，即可促進(jìn)腫瘤的成長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，可抑制腫瘤的成長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，對(duì)腫瘤的成長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移沒有明顯影響。例如，Pang P等[5]報(bào)道MSCs具有向腫瘤歸巢的能力，抑制腫瘤生長(zhǎng)；Paholak H J等[7]報(bào)道干細(xì)胞可以抑制胸部腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移；另有研究卻表明MSCs能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，有研究認(rèn)為MSCs促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展主要作用機(jī)制是參與腫瘤間質(zhì)形成及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活性有關(guān)。Zhang C等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細(xì)胞向腫塊定向趨化后，可以分化成具有內(nèi)皮細(xì)胞特征的新細(xì)胞；大鼠骨髓來源的MSCs移植后可促進(jìn)病灶周圍VEGF表達(dá)[9]。本試驗(yàn)顯示,MSCs移植10 d腫瘤體積較移植前減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抑瘤率為正值，說明MSCs對(duì)腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜，它一方面可以通過促進(jìn)VEGF表達(dá)、血管生成增多，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)甚至轉(zhuǎn)移，另一方面又可以通過定向趨化、分化及等抑制腫瘤生長(zhǎng)，最終產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

表2 MSCs組與NS組腫瘤體積變化比較

表3 抑瘤率

3.2 MR活體示蹤技術(shù)在觀察移植磁標(biāo)記干細(xì)胞轉(zhuǎn)歸、分化中的作用

3.2.1 干細(xì)胞移植后示蹤現(xiàn)狀 干細(xì)胞移植后，如何有效安全觀察其在受體中的生存狀況，遷移，轉(zhuǎn)化，歸巢等，一直是亟待解決的關(guān)鍵性技術(shù)。自1999年分子影像學(xué)概念提出，隨著不斷深入研究，分子影像成為解決這一難題的有效手段。目前為止，眾多研究顯示MRI成為干細(xì)胞活體示蹤的最佳選擇[3-4,6,10-11]。本研究用多聚賴氨酸轉(zhuǎn)染，包裹氧化鐵納米顆粒，使帶負(fù)電荷的細(xì)胞易于攝取Feridex-PLL結(jié)合物，并與間充質(zhì)干細(xì)胞組成靶向遷移的分子探針，進(jìn)行肺癌與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)研究。應(yīng)用3.0TMR活體觀察移植干細(xì)胞在小鼠LLC移植瘤模型轉(zhuǎn)歸情況，目前為止相關(guān)研究不多[11-13]，本試驗(yàn)采用多種序列對(duì)LLC移植瘤模型移植干細(xì)胞前后進(jìn)行掃描，成功篩選出合適的掃描參數(shù)，為MSCs 移植腫瘤后的3.0T MR觀察進(jìn)一步提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3.2.2 MRI顯示腫瘤區(qū)信號(hào)變化 腫瘤T1WI序列呈等或稍低信號(hào)，T2WI、T2FLAIR序列呈稍高信號(hào)，移植后1 d和10 d MR FSE T2WI掃描序列圖像上于腫瘤區(qū)周圍可見呈現(xiàn)點(diǎn)狀、短線狀低信號(hào)，即標(biāo)記的HUMSCs MR信號(hào)，1 d MR低信號(hào)位于腫瘤邊緣；10 d時(shí)病灶區(qū)低信號(hào)明顯多于1 d，且有向病灶中心遷移趨勢(shì)，證明MSCs能夠向小鼠腫瘤區(qū)定向趨化，且10 d到達(dá)病灶MSCs數(shù)目較1 d增多并向中心遷移，進(jìn)行增殖、分化。NS對(duì)照組于 FSE T2WI 加權(quán)像上未見明顯信號(hào)減低區(qū)。

3.2.3 腫瘤體積比較及抑瘤率 移植10 d，HUMSCs組較NS組小鼠腫塊體積減少；較移植前體積也有所減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本試驗(yàn)HUMSCs移植后1 d和10 d抑瘤率均為正值，說明其對(duì)LLC移植瘤有抑制作用。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,HUMSCs對(duì)腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜多樣[14-15]，移植HUMSCs既有腫瘤定向趨化、分化特性，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)；又可刺激VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管形成而一定程度上促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)；抑腫瘤生長(zhǎng)在本試驗(yàn)占優(yōu)勢(shì)。后續(xù)研究將會(huì)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間，從而得到更確切的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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Experimental Study on LLC Implanted Tumor Targeting USPIO Labeled Mesenchymal Stem Cells by MRIinVivo

WANG Xue-qin1,ZHANG Yong-feng2,ZHAO Rong-rong1,WANG Xi-zhen1,WANG Hai-yu1

(1.ImageCenterofWeifangMedicalSchoolAffiliatedHospital,Weifang,Shandong,261031,China; 2.PediatricsofWeifangMedicalSchoolAffiliatedHospital,Weifang,Shandong,261031,China)

In this study,human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUMSCs) labeled with ultra-superparamagnetic iron oxide microparticle-polylysine (PLL) were transplanted into lung cancer LLC mice,and the HUMSCs were expressed by 3.0TMR.MRI signal and tumor size in transplanted mice were observed to investigate the directional migration and transformation of HUMSCs transplanted lung cancer and the effect of HUMSCs on the tumor.HUMSCs-PLL was magnetically labeled with USPIO.Magnetic marker HUMSCs through rat caudal vein transplantation into the LLC growing tumor mice.MRI was observed before transplantation,1d and 10d after transplantation.Results: HUUSPIO-PLL could safely and effectively label umbilical cord mesenchymal stem cells with a labeling rate more than 96% and cell viability reaching the standard; 1 day after transplantation,the mesenchymal stem cells reached the tumor area,There were more MSCs reached the tumor area at 10 days after transplantation,the difference was statistically significant (P<0.05).There was no significant difference in the tumor volume between the experimental group and the 10 days after transplantation (P>0.05).The tumor inhibition rate was positive at 1 day and 10 days after transplantation.So,3.0T MRI can be used for stem cell transplantationinvivo; HUMSCs on LLC implantation have a directional chemotactic effect,can be gathered to the tumor area,and play an anti-tumor effect; but also promote tumor angiogenesis; multiple effects cross each other to ultimately inhibit the tumor growth.

human umbilical cord mesenchymal stem cells; lung cancer; uhrasmall superparamagntiec iron oxide; 3.0 T magnetic resonance imaging

2016-12-18

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展項(xiàng)目(2013WS0294);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014HP008)

王雪芹(1976-)，女，山東煙臺(tái)人，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤影像診斷工作。

R363

A

1007-5038(2017)07-0052-05