普氏蹄蝠胃腸道細菌的分離與鑒定

苑志敏，王艷梅，鄭劉夢，吳 杰，李俊樓，胡麗莉，牛紅星

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

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普氏蹄蝠胃腸道細菌的分離與鑒定

苑志敏，王艷梅，鄭劉夢，吳 杰，李俊樓，胡麗莉，牛紅星*

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

國內(nèi)外關(guān)于蝙蝠消化道細菌的研究極少，為研究普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)胃腸道細菌的種類及數(shù)量，對普氏蹄蝠胃腸道內(nèi)的細菌進行分離，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗、16 S rRNA基因序列及序列同源性分析等方法，鑒定細菌的種類。結(jié)果表明，普氏蹄蝠胃腸道中存在的菌群隸屬于腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、摩根菌屬(Morganella)、哈夫尼菌屬(Hafinia)、Gibbsibela、Lysinibacillus、乳球菌屬(Lactococcus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、Raoultella、普羅威登斯菌屬(Providencia)及腸球菌屬(Enterococcus)共11個屬。其中革蘭陰性菌占據(jù)了絕對優(yōu)勢，普氏蹄蝠胃內(nèi)可培養(yǎng)的細菌數(shù)量大約為3.8×108CFU/mL～7.2×108CFU/mL，腸道可培養(yǎng)的細菌數(shù)量約8.6×108CFU/mL～1.3×1010CFU/mL。普氏蹄蝠胃腸道中的細菌大多為人類致病菌或條件致病菌。其結(jié)果為普氏蹄蝠胃腸道細菌的深入研究奠定了基礎(chǔ)，并為人與蝙蝠共患疾病的預防提供基礎(chǔ)資料。

普氏蹄蝠；胃腸道細菌；16 S rRNA基因；致病菌

蝙蝠是生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分，對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著至關(guān)重要的作用，它們不僅在傳播種子、花粉及害蟲控制等方面有重要作用，也是多種人畜共患病病原體的攜帶者[1]。蝙蝠物種豐富，分布廣泛，與人類關(guān)系密切，目前已從蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)130多種病毒，大多是重大人獸共患病的病原[2]，如嚴重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome virus，SARSV)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndromes virus，MERS V)、埃博拉病毒(Ebola virus，EV)、狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)、尼帕病毒(Nipah virus，NIV)及亨德拉病毒(Hendra virus，HEV)等，但迄今為止，從蝙蝠體內(nèi)分離出的人類致病菌很少，僅有沙門菌屬(Salmonella)、腸桿菌屬(Escherichia)、彎曲菌屬(Campylobacter)等幾種常見菌屬。隨著傳染性疾病的不斷增加，人們?nèi)找骊P(guān)注蝙蝠與人類健康的關(guān)系，關(guān)于蝙蝠作為細菌宿主的研究也越來越多[3]。動物胃腸道內(nèi)存在大量的微生物，而細菌是動物胃腸道中最主要的微生物[4]，可見，蝙蝠的胃腸道是研究蝙蝠體內(nèi)細菌種類的最佳部位。目前國內(nèi)外關(guān)于蝙蝠胃腸道菌群的研究較少[5-7]，而這樣的研究對于人類健康是很有必要的。

普氏蹄蝠(Hipposiderospratti)又名黃大蹄蝠，隸屬于翼手目小蝙蝠亞目蹄蝠科 (Hipposideridae)蹄蝠屬(Hipposideros)，為洞棲型蝙蝠，分布于中國南部及越南北部[8]。普氏蹄蝠體型較大，需要較多的食物滿足自身的需求，能飛到幾公里外的地方覓食，在飛行過程中，它們也會排便[9]，這些糞便中含有致病菌，若這些糞便排入溪流中，會對人類健康造成威脅。此外，由于旅游開發(fā)等原因，許多有普氏蹄蝠棲息的洞穴已經(jīng)或正在被開發(fā)成旅游景點[10]，這使得人與蝙蝠的接觸機會增多，也會增加蝙蝠體內(nèi)致病菌向人類傳播的可能性。本研究通過對普氏蹄蝠胃腸道細菌分離、生理生化試驗、16 S rRNA基因序列的測定及同源性分析，初步鑒定出普氏蹄蝠胃腸道細菌的數(shù)量和種類，以期為人與蝙蝠共患疾病的預防提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2015年9月，于河南省南陽市南召縣喬端鎮(zhèn)仙人洞(N33°34′，E112°06′)，通過洞內(nèi)架設(shè)霧網(wǎng)捕捉蝙蝠，采集到5只蝙蝠，物種鑒定依據(jù)《中國獸類野外手冊》[8]，經(jīng)鑒定為普氏蹄蝠(H.pratti)。將5只蝙蝠帶回實驗室，饑餓處理24 h備用。將經(jīng)過饑餓處理的5只普氏蹄蝠用過量氯仿麻醉處死，用700 mL/L的酒精浸泡進行體表消毒，無菌水漂洗后，在無菌條件下取出胃和腸(包括小腸和大腸)內(nèi)容物，分別放入無菌的5 mL離心管，將每只蝙蝠胃和腸的內(nèi)容物分別混合均勻備用，編號為PW(胃內(nèi)容物)和PC(腸道內(nèi)容物)。

1.2 方法

1.2.1 胃腸道細菌的計數(shù)、分離、純化及保存

1.2.1.1 計數(shù) 無菌條件下，用無菌生理鹽水對上述10管胃腸道內(nèi)容物進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-810倍梯度稀釋，取不同稀釋梯度的內(nèi)容物稀釋液200 μL均勻涂布于已滅菌的LB固體培養(yǎng)基中，每個梯度設(shè)3個平行和1個空白對照。將已涂布好的平板放于37℃培養(yǎng)箱和厭氧培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)12 h，計數(shù)。

1.2.1.2 分離 將上步中經(jīng)過梯度稀釋的胃腸道內(nèi)容物均勻涂布于SS瓊脂培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基和厭氧瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基設(shè)3個平行和1個空白對照，將已涂布的平板放于恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)12 h～24 h。

1.2.1.3 純化與保存 仔細觀察平板上菌落形態(tài)，挑取表征各異的菌落在相對應的平板上劃線分離、純化、培養(yǎng)。挑選具有代表性的細菌進行顯微照相。將純化后的單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中，放入搖床37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，得到細菌懸液。一部分細菌懸液用300 mL/L甘油與菌液1∶1混合，保存于-80℃冰箱；一部分保存于4℃冰箱，備用。

1.2.2 生化試驗 選取具有代表性的18株分離菌的純培養(yǎng)液按常規(guī)方法接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、果糖及麥芽糖等13種糖發(fā)酵培養(yǎng)基上及VP、MR、吲哚等8種生理生化培養(yǎng)基上進行生化試驗，在指定時間內(nèi)觀察結(jié)果。

1.2.3 DNA提取和16 S rRNA基因的PCR擴增 以提取的純度較高的基因組DNA為模板，應用細菌通用引物27-F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 60 s，57℃ 45 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，將檢測合格的樣品送往公司，進行基因測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性分析，運用DNA Star、BioEdit進行多重序列比較，采用MEGA5．0鄰近相接法 (Neighbor-Joining methods)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(bootstrap為1 000)。

2 結(jié)果

2.1 普氏蹄蝠胃腸道內(nèi)分離菌菌落的培養(yǎng)特性和活菌數(shù)量

普氏蹄蝠不同個體胃腸道中分離的細菌在不同種培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)各異, 在MRS瓊脂平板上形成表面光滑、濕潤、邊緣整齊，中間隆起乳白色不透明的圓形菌落；LB瓊脂平板上形成表面光滑、濕潤、邊緣整齊，中間隆起的乳白色不透明的或淺黃色圓形菌落；厭氧瓊脂平板上形成表面光滑、邊緣整齊，中間隆起乳白色圓形菌落；SS瓊脂平板和LBS 瓊脂平板上未見菌落生長。估算了試驗所用的5只普氏蹄蝠樣本胃腸道內(nèi)活菌數(shù)量，普氏蹄蝠胃內(nèi)可培養(yǎng)的細菌數(shù)量大約為3.8×108CFU/mL～7.2×108CFU/mL，腸道細菌數(shù)量約為8.6×108CFU/mL～1.3×1010CFU/mL(表1)。

表1 普氏蹄蝠胃腸道菌落數(shù)量統(tǒng)計

2.2 普氏蹄蝠胃腸道純化菌株的鏡檢結(jié)果

普氏蹄蝠胃中分離出8株細菌，均為需氧或兼性厭氧菌，編號PWX1～PWX8。PWX1～PWX6均為革蘭陰性菌，桿狀；PWX7為革蘭陽性菌，桿狀；PWX8為革蘭陽性菌，球形或卵圓形，細菌外形特征見圖1。

普氏蹄蝠腸道中分離出10株細菌，均為需氧或兼性厭氧菌，編號PCX1～PCX10。PCX1～PCX8均為革蘭陰性菌，桿狀；PCX9為革蘭陽性菌，桿狀；PCX10為革蘭陽性菌，球形或卵圓形，細菌外形特征見圖2。

2.3 普氏蹄蝠胃腸道分離菌的生化鑒定

選取具有代表性的18株分離菌的純培養(yǎng)液進行各種糖發(fā)酵試驗、VP試驗、MR試驗、吲哚試驗等各項生化試驗，結(jié)果見表2和表3。

由表2可知，分離菌中PWX1和PWX2，利用糖的特性和各種生化特征相似，表明它們可能屬于同一菌屬。由表3可知，PCX1、PCX2和PCX3，PCX4和PCX8利用糖的特性和各種生化特征相似，分別表明它們可能屬于同一菌屬。其他分離菌利用糖和生化特征上存在較大差異，可能屬于不同的菌屬。

a-h.PWX1-PWX8

a-j. PCX1-PCX10

項目ItemPWX1PWX2PWX3PWX4PWX5PWX6PWX7PWX8葡萄糖Glucose++++++±+蔗糖Sucrose+++-++-+乳糖Lactose+++-++-+甘露醇Mannose++±-++-±果糖Fructose++±±+±-+麥芽糖Maltose+++-++-+山梨醇Sorbitol++--++-+阿拉伯糖Arabinose+++-±±-±棉籽糖Raffinose±±--±±-±木糖Xylose++±-±±-+鼠李糖Rhamnose+++-±±-±衛(wèi)矛醇Dulcit++±-±±±±肌醇Inositol-+±-±±±+VP試驗VPtest+++--+--MR試驗MRtest---++--+硫化氫Hydrogensulfide---------接觸酶Catalase++++-++-吲哚試驗Indole----+----硝酸鹽還原Deoxidizenitrate++++++++-檸檬酸鹽Citrate+++-++++脲酶Urease--++-++-

注：“+”表示陽性反應；“-”表示陰性反應；“±”表示弱陽性反應。

Note： "+"means positive reaction ； "-"means negative reaction； "±"means weak positive reaction.

表3 腸道分離菌的糖發(fā)酵和生化試驗結(jié)果

注：“+”表示陽性反應；“-”表示陰性反應；“±”表示弱陽性反應。

Note：“+”means positive reaction；“-”means negative reaction；“±”means weak positive reaction．

2.4 分離細菌16 S rRNA基因的PCR擴增

提取菌株的基因組DNA，經(jīng)PCR擴增其16 S rDNA序列，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴增序列條帶大小約1 500 bp，與目的片段大小一致，結(jié)果見圖3和圖4。

M.DNA標準DL 2 000；1～8.PWX1～PWX8；C.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-8.PWX1-PWX8；C.Negative control

圖3 胃內(nèi)分離菌16 S rRNA基因擴增結(jié)果

Fig.3 PCR amplified products of 16 S rRNA genes of bacteria in the stomach

2.5 分離細菌16 S rRNA基因序列分析

把胃內(nèi)分離菌株P(guān)WX1～PWX8和腸道分離菌株P(guān)CX1～PCX10的16 S rRNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST同源性檢索，并分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5和圖6)。結(jié)果顯示,分離菌PWX1和PWX2 分為一簇，與腸桿菌屬(Enterobacter)的同源性為98%，PWX3～PWX8分別與克雷伯菌屬(Klebsiella)、摩根氏菌屬(Morganella)、哈夫尼菌屬(Hafinia)、Gibbsiella、Lysinibacillus、乳球菌屬(Lactococcus)聚在一起，同源性都在97%～100%之間。其中PWX1和PWX2同屬(腸桿菌屬)序列之間顯示了較高的一致性，可能來源于相距較近的類群；PWX4(摩根氏菌屬)和PWX5(哈夫尼菌屬)不同屬序列之間也顯示了較高的一致性，可能也來源于相距較近的類群。

M.DNA標準DL 2 000；1～10.PCX1～PCX10；C.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000；1-10.PCX1-PCX10；C.Negative control

圖4 腸道分離菌16 S rRNA基因擴增結(jié)果

Fig.4 PCR amplified products of 16 S rRNA genes of bacteria in the intestine

分離菌PCX1、PCX2及PCX3親緣關(guān)系較近，與腸桿菌屬(Enterobacter)同源性高達98%；PCX4和PCX8與檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)的同源性高達99%；PCX5、PCX6、PCX7、PCX9、PCX10分別與Raoultella、摩根菌屬(Morganella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、Lysinibacillus、腸球菌屬(Enterococcus)聚在一起，同源性都在98%以上。其中PCX1、PCX2及PCX3這3株同屬(腸桿菌屬)序列之間顯示了較高的一致性，可能來源于相距較近的類群；PCX6(摩根菌屬)和PCX7(普羅威登斯菌屬)不同屬序列之間也顯示了較高的一致性，可能也來源于相距較近的類群；PCX4和PCX8同為檸檬酸桿菌屬，并沒有分為一支，同源性較小，可能是來源于相距較遠的類群。

圖5 基于胃內(nèi)分離菌16 S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

3 討論

我國蝙蝠物種豐富，多達155種[11]。其中普氏蹄蝠是典型的洞穴居住者，其居住的洞穴多被開發(fā)為旅游景點，這增加了人與普氏蹄蝠接觸的機會，旅游者有被傳染疾病的可能，此外，洞穴中常有溪流流出，這些水中必然有蝙蝠的排泄物，而這或許成為部分居民的直接飲用水，給他們的健康造成直接威脅。因此，研究蝙蝠胃腸中細菌及致病菌的種類是非常必要的。

已有的研究表明，采用單一方法很難鑒定胃腸道細菌的具體菌屬[7]，本試驗中，普氏蹄蝠胃腸道分離菌的糖發(fā)酵和生化試驗結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[12]對照后，發(fā)現(xiàn)存在較大差異，不能準確鑒定出分離菌的具體菌屬。現(xiàn)代細菌學傾向于細菌的基因型結(jié)合表型特征進行分類，基于細菌16 S rRNA序列進行分類的標準是：99%～100%全序列同源性的細菌可判定為同一種，97%～100%全序列同源性的定義為同一個屬[13]。迄今，國內(nèi)外關(guān)于蝙蝠胃腸道菌群的研究極少[5-7]。本研究應用生化試驗和16 S rRNA基因序列分析相結(jié)合的方法，首次報道了普氏蹄蝠胃腸道細菌種類及數(shù)量，結(jié)果更加準確可靠。

圖6 基于腸道分離菌16 S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

從普氏蹄蝠胃腸道中共分離出18株細菌，屬于11個屬，革蘭陰性菌占有絕對優(yōu)勢。腸桿菌屬、摩根菌屬及Lysinibacillus在胃腸道中均有分布，而克雷伯菌屬、哈夫尼菌屬、Gibbsiella、乳球菌屬僅分布在胃中，檸檬酸桿菌屬、Raoultella、普羅威登斯菌屬及腸球菌屬只分布在腸道中，普氏蹄蝠胃腸道菌群的組成不同可能與胃腸道環(huán)境的差異有關(guān)，也可能與胃腸道功能差異有關(guān)。普氏蹄蝠胃內(nèi)可培養(yǎng)的細菌數(shù)量約3.8×108CFU/mL～7.2×108CFU/mL，腸道細菌數(shù)量約8.6×108CFU/mL～1.3×1010CFU/mL，這可能是由于胃內(nèi)菌群豐富度和多樣性低于腸道菌群造成的。

普氏蹄蝠胃腸道中分離出的細菌，一些為可引起人類患病的致病菌或條件致病菌，如腸桿菌屬細菌為條件致病菌，常引起包括皮膚軟組織、泌尿道、呼吸道感染及敗血癥等在內(nèi)的細菌感染性疾病[14]?？死撞暇鷮偌毦梢鹂┭⑿赝?、呼吸困難等癥狀。檸檬酸桿菌屬細菌可引起菌血癥、尿路感染、性腹膜炎、膽囊炎等[15]；腸球菌屬是條件致病菌，可引起尿路感染、化膿性腹部感染、腹瀉發(fā)燒等多種疾病[16]。大多數(shù)這些致病菌對蝙蝠本身是無害的(屬于蝙蝠體內(nèi)的正常菌群)，除非蝙蝠的免疫系統(tǒng)受損或之前受過外傷，才會導致蝙蝠患病[17]。

本研究以河南省南陽市南召縣喬端鎮(zhèn)仙人洞的普氏蹄蝠為對象，對普氏蹄蝠所攜帶胃腸道細菌進行分離鑒定，結(jié)果表明，普氏蹄蝠胃腸道細菌種群具有多樣性，且存在人類致病菌和條件致病菌，這為研究野生動物是否攜帶致病菌提供了參考。同時也為旅游環(huán)境的保護，提出了警示和建議，為合理開發(fā)旅游提供了一定的參考。

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Isolation and Identification of Gastrointestinal Bacteria fromHipposiderospratti

YUAN Zhi-min，WANG Yan-mei，ZHENG Liu-meng，WU Jie， LI Jun-lou，HU Li-li，NIU Hong-xing

(CollegeofLifeScience，HenanNormalUniversity，Xinxiang，Henan，453007，China)

Studies on the bacteria composition of gut microbiota in bats are scarce．In order to study the bacteria variety and count of gastrointestinal tract inHipposiderospratti， the bacteria of gastrointestinal tract were isolated fromH.pratti．Based on morphologic observation，physiological and biochemical properties，homology and phylogenetic analysis of 16 S rRNA gene sequence，eleven isolates were identified as the generaEnterobacter，Klebsiella，Morganella，Hafinia，Gibbsibela，Lysinibacillus，Lactococcus，Citrobacter，Raoultella，Providencia，Enterococcus．The most bacteria were the Gram-negative bacteria and the estimation of variable bacteria ranged from 3.8×108CFU/mL-7.2×108CFU/mL of the stomach fluid and 8．6×108CFU/mL-1．3×1010CFU/mL of the intestinal fluid，respectively．Most isolates fromH.prattihave been reported as pathogens or opportunistic pathogens to humans．This study would lay a foundation for further studies on bacteria of gastrointestinal tract fromH.prattiand for preventing transmission of diseases from the bats to humans.

Hipposiderospratti; gastrointestinal bacteria; 16 S rRNA gene; pathogen

2016-12-13

國家自然科學基金項目(30970331，31172056)；河南省科技攻關(guān)項目(082102360004)

苑志敏(1991-)，女，河南周口人，碩士研究生，主要從事動物微生物分類研究。*通訊作者

Q959.833

B

1007-5038(2017)07-0105-07

獸醫(yī)臨床