柔嫩艾美耳球蟲兩種表面抗原基因的原核表達(dá)與鑒定

陳會(huì)亞，費(fèi)陳忠，楊帆帆，王霄旸，薛飛群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與獸藥殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 /農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241)

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柔嫩艾美耳球蟲兩種表面抗原基因的原核表達(dá)與鑒定

陳會(huì)亞，費(fèi)陳忠*，楊帆帆，王霄旸，薛飛群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與獸藥殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 /農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241)

為進(jìn)一步研究柔嫩艾美耳球蟲表面抗原蛋白，應(yīng)用RT-PCR從柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子總RNA擴(kuò)增表面抗原基因SAG19(Q70CD0)和SAGfm(U6L233),與pGEM-T easy載體連接，擴(kuò)增目的片段后分別雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-28a(+)，連接轉(zhuǎn)化至BL21后，誘導(dǎo)表達(dá)，分別獲得兩種重組蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明，兩種重組蛋白的分子質(zhì)量均為32 ku,為包涵體蛋白形式。分別以感染柔嫩艾美耳球蟲的雞血清和重組蛋白免疫新西蘭大白兔獲得的多克隆抗體作為一抗，經(jīng)Western blot分析，結(jié)果表明重組蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。通過對(duì)這兩種表面抗原基因的研究，為基因工程疫苗的研究提供一定的理論依據(jù)。

柔嫩艾美耳球蟲；表面抗原；原核表達(dá)

雞球蟲病是由艾美耳球蟲(E.tenella)引起的腸道性寄生蟲病，通常伴有吸收障礙、腹瀉及出血等特點(diǎn)[1]。其中，柔嫩艾美耳球蟲寄生于雞盲腸及其附近的腸道組織，多數(shù)情況下，盲腸球蟲病的出現(xiàn)常呈暴發(fā)性的，數(shù)天之內(nèi)病死率可達(dá)50%～80%[2]，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，臨床上雞球蟲病的防治主要依賴化學(xué)合成藥物及聚醚類離子抗生素，但是抗球蟲藥耐藥性的快速形成使得必須尋找新的治療方法，而數(shù)10年的研究也并沒有較好的疫苗出現(xiàn)[3]。因此，篩選具有保護(hù)性的抗原具有十分重要的意義。

目前，已有大量編碼球蟲保護(hù)性抗原的基因被發(fā)現(xiàn)，藉此研制出的新型疫苗也展示出廣闊的應(yīng)用前景[4]。在球蟲感染的入侵階段，蟲體的表面抗原能夠刺激宿主的先天保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而避免健康雞的腸上皮細(xì)胞受到蟲體的入侵[5]。子孢子和裂殖子是球蟲的主要入侵階段，研究表明，艾美耳球蟲能表達(dá)的表面抗原(surface antigen,SAGs)有80多種[6]。其他的頂復(fù)門寄生蟲中，如瘧原蟲、泰勒蟲及剛地弓形蟲中的表面抗原蛋白，也被證明與蟲體的入侵和宿主的免疫等相關(guān)[7-9]。通過對(duì)28 550個(gè)帶EST標(biāo)簽序列的檢測(cè)，Enrique T等[10]從子孢子和裂殖子總蛋白中鑒定出37個(gè)帶糖基化磷脂酰肌醇錨定序列的表面蛋白。這些蛋白在 N 端均具有一段信號(hào)肽序列，C端含有疏水性結(jié)構(gòu)域，并且大部分表達(dá)在第2代裂殖子階段。由于第2代裂殖子階段比較容易分離，目前關(guān)于該階段的許多表面抗原已經(jīng)被表達(dá)和鑒定。曹利利等[5,11]分別對(duì)SAG2進(jìn)行了克隆與表達(dá)，獲得重組蛋白，證明了重組蛋白SAG2具有很強(qiáng)的抗原性。此外，第2代裂殖子表面抗原SAG21、SAG23、SAG17、SAG18及SAG10等進(jìn)行原核表達(dá)后均制得重組蛋白，并證明其具有良好的抗原活性和免疫原性，能夠?qū)﹄u產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)作用[12-14]。SAG19(Q70CDO)和SAG family member(U6L233，簡(jiǎn)稱SAGfm)同樣屬于表面抗原家族的成員，但目前對(duì)其研究較少。本研究對(duì)這兩種基因進(jìn)行克隆及原核表達(dá)后，并進(jìn)行鑒定，為篩選保護(hù)性抗原提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸埃希菌JM109、BL21，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)，Novagen公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy載體，Promega生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、DNA Marker DL 2 000、IPTG、X-gal，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品; 2×TaqPCR Master Mix、質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；RNeasy?Mini Kit試劑盒，QIAGEN公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；His GraviTrap Ni-NTA蛋白純化試劑盒，濟(jì)南星寶生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、BCIP/NBT Kit，碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 參照GenBank中柔嫩艾美耳球蟲SAG19和 SAGfm基因序列分別設(shè)計(jì)4對(duì)引物。克隆SAG19基因全長(zhǎng)的引物P1-F：5′-CTTTCCCTTCGCTCTAGCAC-3′,P2-R:5′-TCAAGCCCG AATGATCAGAGCG-3′?？寺AGfm基因全長(zhǎng)的引物P 3-F:5′-CTACACTTCTCATCGGCGCTAT-3′,P4-R:5′-TCAAGCCCGAATGATCAGA- G-3′ 。此外，設(shè)計(jì)兩對(duì)帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物，P5-F:5′-TATGGATCCCTTTCCCTTCGCTCTAGC-3′。P6-R:5′-GCGAAGCTT- TCAAGCCCGAATGATCAGAG-3′和P7-F:5′-T- ATGGATCCCTACACTTCTCATCGGCG-3′、P8-R:5′-GTGAAGCTTTCAAGCCCGAATGATCA- G-3′，用于擴(kuò)增SAG19和SAGfm基因(不含N端信號(hào)肽序列)以構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SAG19和 pET-28a(+)-SAGfm。

1.2 方法

1.2.1 兩種基因的RT-PCR擴(kuò)增 使用RNeasy?Mini Kit試劑盒從純化后的裂殖子中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板，分別以P1和P2、P3和P4為引物，擴(kuò)增兩種基因的全長(zhǎng)。擴(kuò)增程序如下：第1階段，94℃ 3 min；第2階段，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 80 s，共30個(gè)循環(huán)；第3階段，72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。

1.2.2 兩種基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 上述膠回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶與pGEM-T Easy克隆載體4℃連接過夜，取連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞，后取轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于加有AMP(100 mg/mL)、X-gal(20 mg/mL)和IPTG(24 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，挑取生長(zhǎng)良好的白色菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)。取5 μL菌液進(jìn)行PCR鑒定后，堿裂解小量回收質(zhì)粒，分別命名為pGEM-SAG19和pGEM-SAGfm，酶切鑒定并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。以測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別為模板用引物P5和P6、P7和P8進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析后膠回收。分別雙酶切目的DNA和表達(dá)載體pET-28a(+)，酶切結(jié)束后分別進(jìn)行電泳回收目的片段進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化好的菌液適量涂布于加有Kana(100 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)15 h后挑取生長(zhǎng)良好的白色菌落接種于5 mL含Kana(100 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)后取5 μL菌液進(jìn)行PCR鑒定，堿裂解小量回收質(zhì)粒，酶切鑒定后同樣送測(cè)序。分別將重組質(zhì)粒命名為pET-28a-SAG19和pET-28a-SAGfm，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank上的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的純化 將兩種鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28a-SAG19和pET-28a-SAGfm轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)至OD值為0.4～0.6，加入0.5 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取20 mL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過夜的含重組質(zhì)粒的BL21菌液，4 000 r/min離心10 min后，經(jīng)PBS多次洗滌，冰浴超聲，直至澄清透亮為止，后12 000 r/min離心10 min，分別取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。收集振蕩培養(yǎng)過夜的菌體，PBS洗滌后用His GraviTrap Ni-NTA蛋白純化試劑盒純化蛋白，并將純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE。然后分別用6、4、2、0 mol/L尿素緩沖液使蛋白復(fù)性，并將復(fù)性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.4 免疫血清的制備及重組蛋白Western blot分析 選用2 kg～2.5 kg的新西蘭清潔級(jí)大白兔，首免前耳緣靜脈采少量血分離血清作為陰性對(duì)照。首免時(shí)將500 μg重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后背部多點(diǎn)免疫。2周后，將300 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合，充分乳化后背部免疫。1周后，同樣用300 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合，充分乳化后背部免疫。1周后，將500 μg重組蛋白溶于弗氏不完全佐劑充分乳化后加強(qiáng)免疫。間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)合格后頸動(dòng)脈放血收集血清。

將重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過電轉(zhuǎn)移將凝膠中的融合蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用100 g/L脫脂奶粉封閉后洗滌，分別用雞球蟲抗血清和2種多克隆抗體為一抗來檢測(cè)重組蛋白的反應(yīng)原性。4℃過夜洗滌后，用堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)37℃室溫孵育1h，PBS洗滌后，用BCIP/NBT染色工作液染色后拍照。

2 結(jié)果

2.1 柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子總RNA的提取

使用RNeasy?Mini Kit試劑盒從純化后的裂殖子中提取總RNA后，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1，可以觀察到2條明顯的28 S和18 S RNA條帶，表明提取的總RNA質(zhì)量良好，純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

1～4.第2代裂殖子的總RNA1-4.Total RNA of the second generation merozoites

2.2 基因的克隆與序列分析

使用不加酶切位點(diǎn)的引物，以cDNA為模板，分別擴(kuò)增兩種基因的全長(zhǎng)，二者大小分別為741 bp和759 bp，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖2，SAG19和SAGfm均在750 bp附近出現(xiàn)明顯條帶。與pGEM-T Easy克隆載體連接轉(zhuǎn)化后，菌液經(jīng)PCR鑒定，均在750 bp附近出現(xiàn)明顯條帶,兩種重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ單酶切后，在5 000 bp和750 bp附近均出現(xiàn)明顯條帶(圖3)。測(cè)序結(jié)果表明，克隆所得的序列SAG19和SAGfm分別由741個(gè)和759個(gè)核苷酸組成，與GenBank上收錄的序列相似度均超過99%，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性均超過99%。利用上述獲得的兩種重組質(zhì)粒，以加酶切位點(diǎn)的引物P5和P6、P7和P8擴(kuò)增目的DNA，均在750 bp附近出現(xiàn)明顯條帶，膠回收后分別對(duì)pET-28a(+)和目的DNA進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果見圖4。連接轉(zhuǎn)化后，挑取生長(zhǎng)良好的菌落接種于5 mL含Kana(100 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)后取5 μL菌液進(jìn)行PCR鑒定,電泳結(jié)果見圖5。測(cè)序結(jié)果表明，SAG19有4個(gè)堿基發(fā)生突變，分別在第129、140、261、534位，其中第140位的突變導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸變?yōu)樘扉T冬酰胺。SAGfm有2個(gè)堿基發(fā)生突變，分別在第178位和327位，其中第178位的突變導(dǎo)致氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼帷?/p>

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

兩種蛋白均在不同溫度、不同IPTG濃度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDA-PAGE分析，結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白均在沉淀中大量表達(dá)，為包涵體蛋白。由于兩種重組質(zhì)粒均為帶His標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)定的酶切位點(diǎn)，試驗(yàn)中His標(biāo)簽本身分子質(zhì)量約為3.52 ku，E.tenella第2代裂殖子SAG19和SAGfm的分子質(zhì)量分別約為28.58 ku和28.74 ku。因此，重組蛋白SAG19和SAGfm的分子質(zhì)量約為32.10 ku和32.26 ku。利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)兩種包涵體蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)洗脫液洗滌后，均在32 ku附近出現(xiàn)目的條帶，大大提高了融合蛋白的純度，經(jīng)復(fù)性后的蛋白電泳結(jié)果如圖6A所示。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.SAG19 PCR產(chǎn)物；2.SAGfm PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR product of SAG19; 2.PCR product of SAGfm

圖2 兩種基因的PCR擴(kuò)增(以cDNA為模板)

Fig.2 Amplification of two genes by RT-PCR(cDNA as template)

M、M1.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 15 000；1～4.SAG19的菌液PCR鑒定；5～7.SAGfm的菌液PCR鑒定；8、9.pGEM-SAG19的酶切鑒定(EcoRⅠ)；10、11.pGEM-SAGfm的酶切鑒定(EcoRⅠ)

M,M1.DNA Marker DL 2 000; M2.DNA Marker DL15 000; 1-4.Microbial PCR identification of SAG19; 5-7.Microbial PCR identification of SAGfm; 8，9.Products of pGEM-SAG19 with endonuclease digestion ofEcoRⅠ; 10，11.Products of pGEM-SAGfm with endonuclease digestion ofEcoRⅠ

圖3 兩種重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定和酶切鑒定

Fig.3 Microbial PCR identification and enzyme digestion identification oftwo recombiant plasmids

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; M2.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 15 000; 1.SAG19的擴(kuò)增；2.SAGfm的擴(kuò)增；3、4.pET-28a(+)雙酶切產(chǎn)物(BamHⅠ和HindⅢ)；5、6.SAG19雙酶切產(chǎn)物(BamHⅠ和HindⅢ)；7、8.SAGfm雙酶切產(chǎn)物(BamHⅠ和HindⅢ)

M1.DNA Marker DL 2 000; M2.DNA Marker DL15 000; 1.Amplification of SAG19; 2.Amplification of SAGfm; 3,4.Product sof pET-28a(+) digested byBamHⅠ andHindⅢ; 5,6.Products of SAG19 digested byBamHⅠ andHindⅢ; 7,8.Products of SAGfm digested byBamHⅠ andHindⅢ

圖4 兩種基因的擴(kuò)增及兩種基因和pET-28a(+)的雙酶切產(chǎn)物
Fig.4 Amplification of two genes and PCR products of two genes and pET-28a(+) digested byBamHⅠ andHindⅢ

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～6.SAG19的菌液PCR鑒定; 7～12.SAGfm的菌液PCR鑒定

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.Microbial PCR identification of SAG19; 7-12. Microbial PCR identification of SAGfm

圖5 兩種重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定

Fig.5 Microbial PCR identification of two recombinant plasmids

2.4 重組蛋白的免疫原性和抗原性的檢測(cè)

以患雞球蟲病的血清為一抗與純化后的重組蛋白進(jìn)行雜交檢測(cè)，鑒定結(jié)果如圖6B所示。雜交顯色反應(yīng)后，在32 ku附近有兩條明顯的特異性雜交條帶，與兩種重組蛋白的位置一一對(duì)應(yīng)，證明兩種重組蛋白能與感染雞球蟲血清抗體特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。以兩種蛋白免疫后制得的兔多克隆抗體為一抗與純化后的重組蛋白進(jìn)行雜交檢測(cè)，鑒定結(jié)果如圖7，分別在32 ku附近出現(xiàn)明顯條帶,表明重組蛋白具有良好的抗原性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后的重組蛋白SAGfm；2.純化后的重組蛋白SAG19；3.重組蛋白SAGfm的Western blot分析；4.重組蛋白SAG19的Western blot分析

M.Protein molecular weight Marker; 1.The purified recombinant protein of SAGfm; 2.The purified recombinant protein of SAG19; 3.Western blot analysis of purified recombinant protein SAGfm; 4.Western blot analysis of purified recombinant protein SAG19

圖6 純化后重組蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot分析

Fig.6 SDS-PAGE and Western blot analyses of purified recombinant proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. SAGfm和SAG19的Western blot分析(多克隆抗體為一抗);3、4. SAGfm和SAG19的Western blot分析(陰性血清為一抗)

M.Protein molecular weight Marker; 1，2.Western blot analysis of SAGfm and SAG19(rabbit polyclonal antibodies served as the first antibody);3，4.Western blot analysis of SAGfm and SAG19(negative serum served as the first antibody)

圖7 兩種重組蛋白的Western blot分析

Fig.7 Western blot analysis of two recombinant proteins

3 討論

本試驗(yàn)采用pET-28a(+)作為表達(dá)載體，在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中，分別采用了降低轉(zhuǎn)速、降低IPTG濃度、降低溫度的措施，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，表達(dá)的蛋白均為包涵體蛋白。在SAGs家族的蛋白表達(dá)中，麥博等[14]分別用pET-32a(+)和pMAL-c2X作為表達(dá)載體表達(dá)SAG10，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pET-32a(+)作為表達(dá)載體時(shí)得到的重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，而以pMAL-c2X作為表達(dá)載體時(shí)得到的為可溶性蛋白。此外，用pET-32a(+)表達(dá)SAG2[11]和SAG7時(shí)均以包涵體的形式表達(dá)，而用pMAL-c2X作為表達(dá)載體表達(dá)SAG21和SAG23時(shí)均以可溶性蛋白的形式表達(dá)[12]。Yock-Ping C等[15]用pET-32b(+)表達(dá)SAG2、SAG3、SGA4、SAG5、SAG12、SAG15、SAG16、SAG18、SAG19和SAG23時(shí)，在低溫條件下重組蛋白均以可溶性蛋白表達(dá)。由于表面抗原大小及結(jié)構(gòu)等方面存在相似地方，由此推測(cè)，在表達(dá)SAGs家族蛋白時(shí)，表達(dá)載體pET-28a(+)和pET-32a(+)容易形成包涵體蛋白，而pMAL-c2X和pET-32b(+)較容易以可溶性形式表達(dá)。

SAG19和SAGfm均為柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子的表面抗原，本試驗(yàn)成功的擴(kuò)增了兩種不含N端信號(hào)肽的基因全長(zhǎng)，并將其克隆至pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化BL21菌后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到N端含有His標(biāo)簽的重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析，得到的重組蛋白約為32 ku,除去標(biāo)簽蛋白后約為28 ku,與推測(cè)的結(jié)果一致。目的蛋白以包涵體形式表達(dá)于胞內(nèi)，重組蛋白變性后用Ni柱純化后復(fù)性，復(fù)性后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，均在32 ku附近出現(xiàn)明顯條帶，雜蛋白較少。用純化后的重組蛋白與雞抗球蟲血清進(jìn)行雜交檢測(cè)，結(jié)果表明能與雞抗球蟲血清特異性結(jié)合，具有良好的反應(yīng)原性。同時(shí)，用重組蛋白免疫新西蘭大白兔制得多克隆抗體，與重組蛋白經(jīng)Western blot檢測(cè)，制得的多克隆抗體具有良好的抗原性，可以進(jìn)行后續(xù)多種試驗(yàn)。

目前，免疫基因工程苗是防治雞球蟲病的主要措施之一，篩選出具有保護(hù)性的抗原就顯得尤為關(guān)鍵。通過基因克隆和基因重組技術(shù)，利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)是目前較為常用的蛋白表達(dá)技術(shù)。研究表明，SAGs在蟲體侵入最初階段能夠非特異性黏附宿主細(xì)胞，有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，具有阻止子孢子侵入細(xì)胞的作用[16]。SAGs家族表面抗原蛋白為入侵相關(guān)蛋白，作為疫苗候選因子理論上有助于抑制蟲體的入侵。雖然大部分試驗(yàn)證明用重組抗原免疫雞可以獲得部分免疫效果，但由于雞柔嫩艾美耳球蟲生活史較為復(fù)雜，基因組龐大，不同發(fā)育階段的免疫原性和抗原構(gòu)成均有差異。因此，篩選出保護(hù)性強(qiáng)，可以抑制各個(gè)階段球蟲生活，具有種間交叉保護(hù)的抗原及研制可以作用于各個(gè)生活階段的多價(jià)苗具有重要意義。

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Prokaryotic Expression and Identification of Two Surface Antigen Genes ofEimeriatenella

CHEN Hui-ya,FEI Chen-zhong,YANG Fan-fan,WANG Xiao-yang,XUE Fei-qun
(ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience

(CAAS),KeyLaboratoryofVeterinaryDrugSafetyEvaluationandResiduesResearchofCAAS,KeyLaboratoryofAnimalParasitology,MinistryofAgriculture,Shanghai,200241,China)

In order to further study the surface antigen proteins ofE.tenella,the SAG19(U6L233) and SAGfm(Q70CD0) genes in the second generation merozoites were amplified from total RNA by RT-PCR and ligated to the pGEM-T easy vector.After the target gene fragments amplified,the two genes and pET-28a(+) were digested by two restriction endonucleases and then connected.The two connection products were transformed intoE.coliBL21.After induction,two recombinant proteins were obtained.The expressed proteins were all inclusion bodies and the molecular mass of two recombinant proteins were all about 32 ku as revealed by analysis using SDS-PAGE.The serum of chickens infected withE.tenellaand polyclonal antibodies which were produced in rabbits were served as the first antibody,and the results of Western blot indicated that the two recombinant proteins had good immunogenicity and antigenicity.The research of these two genes could provide theoretical basis for the development of genetic enginering vaccines.

E.tenella; surface antigen; prokaryotic expression

2016-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272607)

陳會(huì)亞(1992-)，女，河南平頂山人，碩士研究生，主要從事獸用藥劑學(xué)及獸藥安全評(píng)價(jià)研究。*通訊作者

S852.723

A

1007-5038(2017)07-0017-06