腸出血性大腸埃希菌O157：H7多重PCR檢測(cè)方法的建立

紀(jì) 雪，張 雪，孫 洋，孫詩(shī)雯，祝令偉，劉 軍，姜海艷，周 偉，梁 冰，郭學(xué)軍，劉彥晶*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春 130021)

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腸出血性大腸埃希菌O157：H7多重PCR檢測(cè)方法的建立

紀(jì) 雪1，張 雪1，孫 洋1，孫詩(shī)雯1，祝令偉1，劉 軍1，姜海艷2，周 偉1，梁 冰1，郭學(xué)軍1，劉彥晶2*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130122；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春 130021)

為建立腸出血性大腸埃希菌O157：H7的多重PCR檢測(cè)方法，針對(duì)O157菌特異性eaeA基因、fliC基因、志賀毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因設(shè)計(jì)5對(duì)引物，構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系，優(yōu)化反應(yīng)的引物濃度和溫度檢測(cè)其特異性和敏感性，并對(duì)牛、豬、雞及犬等不同動(dòng)物來源的樣品進(jìn)行了大腸埃希菌O157檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法具有良好的特異性和敏感性，敏感性達(dá)到5×103CFU。從檢測(cè)陽(yáng)性樣本中均分離到目的菌。應(yīng)用建立的方法在確定樣品中是否含有大腸埃希菌O157的同時(shí)，還能對(duì)菌株毒力進(jìn)行初步判定。成功建立了腸出血性大腸埃希菌O157：H7多重PCR檢測(cè)方法，為該病原菌感染的預(yù)防和監(jiān)測(cè)提供了簡(jiǎn)便、快速的技術(shù)手段，具有良好的應(yīng)用前景。

腸出血性大腸埃希菌O157：H7；多重PCR；檢測(cè)；rfbE基因

腸出血性大腸埃希菌O157：H7(EnterohaemorrhagicEscherichiacoliO157：H7,EHEC O157：H7)是一種重要的人獸共患病原菌，首次報(bào)道于1982年，由美國(guó)Riley L W等[1]發(fā)現(xiàn)。隨后一些國(guó)家也相繼發(fā)生了散發(fā)或暴發(fā)性流行，腸出血性大腸埃希菌 O157：H7 對(duì)人類健康的危害逐漸引起了各國(guó)的普遍關(guān)注[2-3]。該菌一般經(jīng)過動(dòng)物源性食品傳播，感染癥狀可表現(xiàn)為輕度腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少性紫癜等[4]，人感染的劑量很低。因此，建立一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便、高效的方法來檢測(cè)該病原菌極其重要。目前的檢測(cè)方法主要有免疫學(xué)方法(免疫磁珠法、蛋白芯片、蛋白印跡法、膠體金免疫層析試紙)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法(PCR法、基因芯片及生物傳感技術(shù))等[5-6]，這些方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。其中PCR方法較為成熟，技術(shù)上更為先進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法也得到廣泛的研究，但實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要昂貴的儀器設(shè)備，目前還達(dá)不到5通道同時(shí)檢測(cè)。而目前已研發(fā)的多重PCR檢測(cè)方法，還不足以對(duì)樣品中大腸埃希菌O157的毒力和血清型進(jìn)行同時(shí)鑒別。針對(duì)這些問題，本研究建立一種快速準(zhǔn)確的多重PCR檢測(cè)方法，該方法針對(duì)大腸埃希菌O157的eaeA、fliC、stx1、stx2及rfbE 5種特異性基因設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，并進(jìn)行實(shí)際樣品的初步檢測(cè)。對(duì)目的菌有效檢出的同時(shí)，還能對(duì)其毒力進(jìn)行鑒定，為保證食品安全提供了有效的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基 O157：H7 EDL933(NalR)為具有萘啶酮酸抗性的EHEC O157：H7突變株；大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌ATCC700323、腸炎沙門菌ATCC14028、銅綠假單胞菌ATCC27853、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌CMCC52204、痢疾志賀菌CMCC51252、糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄球菌ATCC29213、枯草芽胞桿菌CGMCC1.504、嗜水氣單胞菌ATCC7966、蠟樣芽胞桿菌ATCC11778、醋酸鈣不動(dòng)桿菌1228c、弗氏檸檬酸桿菌D48、屎腸球菌CO1F7c、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌5-92、奇異變形桿菌Q1，軍事獸醫(yī)研究所細(xì)菌學(xué)研究室保存；LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、改良EC新生霉素增菌肉湯(mECn)、山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島海博公司產(chǎn)品；CHROMagar大腸埃希菌O157顯色培養(yǎng)基，法國(guó)科瑪嘉公司產(chǎn)品；EHEC O157 O抗原因子血清，天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器和試劑 T1 PCR儀，德國(guó)BioRid公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱為天津歐諾儀器廠生產(chǎn)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×TaqMasterMix試劑，包康世紀(jì)公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物合成 參照文獻(xiàn)[7-8]，針對(duì)EHEC O157：H7 EDL933株的eaeA、fliC、stx1、stx2、rfbE基因序列合成5對(duì)引物。引物由Invitrogen公司合成純化，序列見表1。

表1 多重 PCR反應(yīng)引物

1.2 方法

1.2.1 模板制備 將大腸埃希菌O157：H7 EDL933等18種菌株于LB瓊脂平板上劃線，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1 mL新鮮培養(yǎng)菌液，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 多重PCR引物濃度的優(yōu)化 采用正交法對(duì)多重PCR中5對(duì)引物的添加量進(jìn)行優(yōu)化，將5對(duì)引物作為5個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平(引物終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 μmoL/L)，然后進(jìn)行L16(54)正交試驗(yàn)(表2)。

1.2.3 多重PCR退火溫度優(yōu)化 根據(jù)引物退火溫度，設(shè)計(jì)梯度溫度PCR擴(kuò)增程序：94℃ 2 min；94℃ 30 s，退火溫度(58、58.5、59、59.7、60.6、61.5、62.5、63.5、64.3、65.1、65.7、66℃)30 s，72℃ 70 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

1.2.4 多重PCR的特異性檢測(cè) 分別以O(shè)157：H7 EDL933(NalR)、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、痢疾志賀菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、嗜水氣單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、屎腸球菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及奇異變形桿菌共計(jì)18種細(xì)菌的基因組DNA為模板，利用最佳多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證引物的特異性。

表2 L16(54) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平

1.2.5 多重PCR的敏感性檢測(cè) 將大腸埃希菌O157：H7 EDL933(NalR)過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后進(jìn)行LB平板菌落計(jì)數(shù)。用無菌生理鹽水將菌液按10倍梯度稀釋至108，每個(gè)梯度吸取1 mL菌液制備PCR模板。按最佳多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.6 樣品檢測(cè)

1.2.6.1 樣品采集 從黑龍江采集犬肛拭子樣品61份，吉林德惠某雞場(chǎng)雞糞便樣品53份，長(zhǎng)春周邊采集豬肛拭子樣品95份、豬糞樣品50份及市場(chǎng)采集新鮮豬肉樣品46份、雞肉樣品45份和牛肉樣品7份，長(zhǎng)春某養(yǎng)豬場(chǎng)采集腹瀉豬肛拭子樣品90份，吉林某種豬場(chǎng)腹瀉豬糞便樣品44份。

1.2.6.2 樣品檢測(cè) 糞便和鮮肉樣品:參考國(guó)標(biāo)(GB/T4789.36-2008)，無菌操作取5 g樣品加入到45 mL改良EC新生霉素增菌肉湯(mECn)培養(yǎng)基中，36℃±1℃振蕩培養(yǎng)18 h～24 h。

肛拭子樣品：在肛拭子試管中加入2.5 mL無菌生理鹽水渦旋振蕩混勻，取500 μL加入4.5 mL mECn培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h～24 h。

取上述增菌液100 μL于無菌離心管中，12 000 r/min離心2 min；加入滅菌水100 μL重懸沉淀，沸水浴10 min，冷卻后12 000 r/min離心2 min，上清作為PCR模板。按優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

1.2.6.3 EHEC O157的分離和鑒定 多重PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣本mECn增菌液于CHROMagar大腸埃希菌O157顯色培養(yǎng)基平板劃線，37℃培養(yǎng)16 h，挑取典型單菌落于山梨醇麥康凱培養(yǎng)基平板二次純化，分離獲得的疑似大腸埃希菌O157純培養(yǎng)菌株，用大腸埃希菌O抗原因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)以確定其血清型，再進(jìn)行rfbE基因擴(kuò)增、測(cè)序及BLAST分析。

2 結(jié)果

2.1 最適PCR引物濃度

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的16種引物濃度組合均能擴(kuò)增出目的條帶，但擴(kuò)增效果存在差異；其中以組合5的擴(kuò)增效果最佳(圖1)。因此選用組合5為引物最佳使用濃度，即引物E157-F/R、H7-F/R、Stx2-F/R、Stx1-F/R及rfb-EF/R終濃度分別為0.2、0.1、0.2、0.3、0.4 μmoL/L。

優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系50 μL，包含2×TaqMasterMix 25 μL，E157-F/R引物(10 μmol/L)各1 μL，H7-F/R引物(10 μmol/L)各0.5 μL，Stx2-F/R引物(10 μmol/L)各1 μL，Stx1-F/R引物(10 μmol/L)各1.5 μL，rfbE-F/R引物(10 μmol/L)各2 μL，DNA模板2 μL，滅菌水補(bǔ)足至50 μL。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～16.正交試驗(yàn)號(hào)1～16 M.DNA Marker DL 2 000;1-16.Orthogonal test No.1-16

2.2 最適PCR退火溫度

12種退火溫度的PCR結(jié)果顯示，溫度對(duì)多重PCR的影響比較大。當(dāng)溫度升高至62.5℃時(shí)，rfbE基因的目的帶顯現(xiàn)模糊。最后確定 PCR最佳反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 70 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min(圖2)。

2.3 多重PCR特異性檢測(cè)

針對(duì)多個(gè)不同種屬的18種菌株進(jìn)行了多重PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門菌、銅綠假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、痢疾志賀菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、嗜水氣單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、屎腸球菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、奇異變形桿菌及大腸埃希菌ATCC25922均無特異性擴(kuò)增。證明了本試驗(yàn)建立的5對(duì)引物多重PCR擴(kuò)增體系，具有高度的特異性(圖3)。

2.4 多重PCR敏感性檢測(cè)

大腸埃希菌O157：H7 EDL933原始菌液濃度為2.5×108CFU/mL，將2.5×107CFU/mL～2.5 CFU/mL梯度濃度的菌懸液提取DNA后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，當(dāng)模板含量≥5×103CFU時(shí)，大腸埃希菌O157：H7均能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的目的條帶(圖4)，多重PCR的敏感性為5×103CFU。

2.5 樣品檢測(cè)

對(duì)246份肛拭子樣品、147份糞便樣品和98份新鮮豬肉樣品進(jìn)行的EHEC O157：H7特異性多重PCR檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)到2份樣品為rfbE基因陽(yáng)性，其余均為陰性。并且有21份樣品檢測(cè)到fliC基因，6份樣品檢測(cè)到stx1基因，5份樣品檢測(cè)到stx2基因，3份樣品檢測(cè)到eaeA基因，但5個(gè)目的基因全部檢測(cè)到的樣品沒有檢出。

針對(duì)rfbE基因陽(yáng)性的2份樣品進(jìn)行大腸埃希菌的分離，均獲得rfbE基因陽(yáng)性大腸埃希菌分離株(G58和G108)。利用多重PCR對(duì)大腸埃希菌G58和G108進(jìn)行鑒定，均獲得rfbE基因目的條帶(圖5)，但無其他條帶?；厥漳康臈l帶進(jìn)行測(cè)序分析，確認(rèn)為EHEC O157特異性rfbE基因。經(jīng)血清學(xué)鑒定，大腸埃希菌G58和G108為O157血清型，但屬于無志賀毒素和LEE致病島的弱毒株。血清型鑒定結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～12.Tm=58、58.5、59、59.7、60.6、61.5、62.5、63.4、64.3、65.1、65.7、66℃;NC.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1-12.Tm=58,58.5,59,59.7,60.6,61.5,62.5,63.4,64.3,65.1,65.7,66℃; NC.Negative control

圖2 退火溫度對(duì)多重PCR擴(kuò)增的影響

Fig.2 Effect of annealing temperature on multiplex PCR amplification

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;NC.陰性對(duì)照；1.大腸埃希菌O157:H7 EDL933;2.肺炎克雷伯菌;3.陰溝腸桿菌;4.腸炎沙門菌;5.銅綠假單胞菌;6.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌;7.糞腸球菌;8.金黃色葡萄球菌;9.枯草芽胞桿菌;10.蠟樣芽胞桿菌;11.醋酸鈣不動(dòng)桿菌;12.屎腸球菌;13.嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌;14.奇異變形桿菌;15.大腸埃希菌;16.痢疾志賀菌;17.嗜水氣單胞菌;18.弗氏檸檬酸桿菌

M.DNA Marker DL 2 000; NC.Negative control；1.EscherichiacoliO157:H7 EDL933;2.Klebsiellapneumoniae;3.Enterobactercloacae;4.Salmonellaenteritidis;5.Pseudomonasaeruginosa;6.Yersiniaenterocolitica;7.Enterococcusfaecalis;8.Staphylococcusaureus;9.Bacillussubtilis;10.Bacilluscereus;11.Acinetobactercalcoaceticus;12.Enterococcusfaecium;13.Stenotrophomonasmaltophilia;14.Proteusmirabilis;15.Escherichiacoli;16.Shigelladysenteriae;17.Aeromonashydrophila;18.Citrobacterfreundii

圖3 多重PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 The results of multiplex PCR specificity test

3 討論

腸出血性大腸埃希菌O157：H7是一種重要的人畜共患病原菌，流行范圍廣，致病性強(qiáng)[9-10]，且無疫苗可用。因此，對(duì)該病原菌建立完備的檢測(cè)方法意義重大。

目前，檢測(cè)腸出血性大腸埃希菌O157：H7的多重PCR方法也有報(bào)道[11-12]，但所包含的特異性基因少，不能完全準(zhǔn)確地檢測(cè)到腸出血性大腸埃希菌O157：H7，這給臨床檢測(cè)帶來了一定的局限性。本研究為了彌補(bǔ)這一缺陷，建立完善了一種多重PCR檢測(cè)方法，該方法能夠檢測(cè)EHEC O157：H7 的O抗原血清型特異性基因rfbE和H抗原基因fliC，通過這兩個(gè)基因確定其血清型，同時(shí)還能夠檢測(cè)EHEC O157：H7主要毒力基因eaeA、志賀毒素基因stx1和stx2。這樣，在確定受檢樣品中是否存在EHEC O157：H7 的同時(shí),還能夠確定菌株的毒力基因型，從而對(duì)其致病性有一個(gè)初步判斷。

本研究首先優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)的最佳引物濃度以及退火溫度，確立了最優(yōu)的反應(yīng)條件，并以此反應(yīng)條件對(duì)該方法的特異性和敏感性進(jìn)行了檢測(cè)。特異性試驗(yàn)選取的17種菌，包含革蘭陽(yáng)性菌5種，革蘭陰性菌12種，菌屬覆蓋面廣，非目的菌的陰性結(jié)果表明，多重PCR反應(yīng)的特異性較高。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以檢測(cè)到5×103CFU。為了驗(yàn)證該方法的實(shí)用性，本研究檢測(cè)了491份不同來源的樣品，包括肛拭子、糞便樣品、豬肉樣品及牛肉樣品等。檢測(cè)結(jié)果全部樣品中僅有2份樣品rfbE基因陽(yáng)性，這2份陽(yáng)性樣品均分離得到大腸埃希菌O157。由于攜帶eaeA基因的LEE致病島和stx基因的原噬菌體均由可移動(dòng)遺傳原件攜帶，這一結(jié)果說明本地區(qū)的大腸埃希菌O157主要以弱毒株或無毒株形式存在，但不排除它們有獲得外源毒力基因的可能?？傮w來說大腸埃希菌O157在這些地區(qū)的流行風(fēng)險(xiǎn)并不高。檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，一些樣品中存在攜帶eaeA和stx基因的病原菌，很可能為其他血清型的腸出血性大腸埃希菌或腸致病性大腸埃希菌。由于針對(duì)攜帶這些基因的病原菌沒有合適的篩選標(biāo)記因而沒有分離獲得純培養(yǎng)的菌株。結(jié)果也提示本地區(qū)動(dòng)物性食品有可能受到這類細(xì)菌的污染，需要引起重視。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1. 5×105拷貝;2. 5×104拷貝;3. 5×103拷貝;4. 5×102拷貝;5. 5×101拷貝;6. 5拷貝;7～9.<1拷貝;NC.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1. 5×105copies;2. 5×104copies;3. 5×103copies;4. 5×102copies;5. 5×101copies;6.5copies;7-9.<1copies;NC.Negative control

圖4 多重PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果

Fig.4 The results of multiplex PCR sensitivity test

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.大腸埃希菌O157:H7EDL933;2.大腸埃希菌G58;3.大腸埃希菌G108;NC.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.EscherichiacoliO157:H7EDL933;2.EscherichiacoliG58;3.EscherichiacoliG108;NC.Negative control

圖5 豬糞便樣品多重PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

Fig.5 The positive results of multiplex PCR test for pig fecal samples

多重PCR方法在疾病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查研究中是較常見使用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法[13-15]。本研究所建立的大腸埃希菌O157：H7 的多重PCR方法，彌補(bǔ)了由于特異性基因少而增加了多重PCR檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性的不足，不僅能鑒定出大腸埃希菌O157：H7血清型，還能確定菌株所攜帶的毒力基因，比以往的大腸埃希菌O157：H7多重PCR檢測(cè)方法更精準(zhǔn)，且特異性和敏感性良好。這種方法對(duì)腸出血性大腸埃希菌O157︰H7的疫情防控和流行病學(xué)調(diào)查具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，值得推廣應(yīng)用。

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Establishment of Multiplex PCR for Detecting EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7

JI Xue1,ZHANG Xue1,SUN Yang1,SUN Shi-wen1,ZHU Ling-wei1,LIU Jun1,JIANG Hai-yan2, ZHOU Wei1,LIANG Bing1,GUO Xue-jun1,LIU Yan-jing2

(1.InstituteofMilitaryVeterinaryScience,AMMS,KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun,Jilin,130122,China;2.TheAffiliatedHospital,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun,Jilin,130021,China)

To establish a rapid and specific multiple PCR method for detection of EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157: H7. Five specific genes ofE.coliO157 were selected, such as eaeA gene, fliC gene, the shiga-like toxin gene (stx1, stx2) and rfbE gene.Concentration of primers and annealing temperature were optimized. Specificity and sensitivity of the PCR assay were detected. Practical samples, such as feces, rectal swabs, chicken, beef, pork and rectal swabs of diarrhea pig, were detected. The multiplex PCR assay showed good sensitivity and specificity. Sensitivity of the assay was 5 000 CFU. Strains of EHEC O157 were isolated from the positive samples. The method made an initial estimation of the virulence and whether or not enterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7 was in the samples. The multiplex PCR method for detection of EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157: H7 was estabilished successfully. It provided a rapid and simple detecting method for prevention and monitoring of enterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7 with an excellent prospect of application.

EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157:H7; multiplex PCR; detection; rfbE Gene

2016-12-02

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20150101110JC，20140101032JC)；武漢市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014060101010051)

紀(jì) 雪(1979-)，女，吉林長(zhǎng)春人，實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，主要從事分子細(xì)菌學(xué)研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2017)07-0001-06

研究論文