丹瓜方的急性毒性試驗(yàn)

劉永進(jìn)，杜博，黃蘇萍，衡先培

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004）

丹瓜方的急性毒性試驗(yàn)

劉永進(jìn)1，杜博1，黃蘇萍1，衡先培2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建福州350004）

丹瓜方；急性毒性試驗(yàn)；最大耐受量；小鼠

丹瓜方由新四物湯和瓜蔞薤白半夏湯化裁而來，主要由丹參、瓜蔞、郁金、赤芍、川芎、法半夏、薤白、僵蠶等組成。丹瓜方為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院衡先培教授基于“痰瘀同治法”思路探索治療2型糖尿病的心血結(jié)晶［1］。既往研究證實(shí)，痰瘀同治的丹瓜方在降糖調(diào)脂、抗氧化、抗炎等方面療效顯著［2-4］。根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［5］對(duì)丹瓜方進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察其對(duì)肝腎功能和臟器指數(shù)的影響，評(píng)估其臨床用藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～5周齡昆明小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［SYXK（閩）2009-0001］提供。喂養(yǎng)條件：清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)室，恒溫（22±2）℃，12 h光照明暗交替，分籠飼養(yǎng)，自由攝食進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器①實(shí)驗(yàn)藥物：丹瓜方由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科制備，濃稠混懸液最大濃度為3 g／mL。②實(shí)驗(yàn)試劑：谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（酶標(biāo)儀法）（批號(hào)：20170420）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（酶標(biāo)儀法）（批號(hào)：20170422）、尿素氮（BUN）試劑盒（脲酶法）（批號(hào)：20170411）、肌酐（Cr）試劑盒（肌氨酸氧化酶法）（批號(hào)：201704 18），上述試劑盒均購(gòu)自南京建成生物有限公司。③實(shí)驗(yàn)儀器：infinite M200 PRO全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司），TDZ4A-WS低速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 分組與給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，將40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為鹽水對(duì)照組、丹瓜方1組、丹瓜方2組、丹瓜方3組各10只。參照文獻(xiàn)［6］，將劑量組間比定為1∶0.7，各組用藥情況見表1。給藥當(dāng)天稱重后，以一次性灌胃最大容積0.4 mL／10 g體重分別在當(dāng)日8時(shí)、17時(shí)連續(xù)灌胃2次。

1.4 觀察指標(biāo)

表1 分組與丹瓜方給藥情況

1.4.1 一般情況及體質(zhì)量變化灌胃當(dāng)天對(duì)小鼠呼吸、運(yùn)動(dòng)、進(jìn)食、排便等行為和是否有中毒反應(yīng)及死亡情況進(jìn)行詳細(xì)觀察和記錄，對(duì)可能出現(xiàn)的死亡動(dòng)物及時(shí)進(jìn)行解剖。連續(xù)觀察14 d，每天稱重，記錄體重變化。

1.4.2 肝腎功能灌胃后第14 d眼眶取血，靜置4 h，經(jīng)3000 r／min離心15 min后取血清，放置于-20℃冰箱備用。

1.4.3 臟器指數(shù)眼眶取血后以頸椎脫臼法處死，進(jìn)行解剖，觀察其主要臟器的顏色、質(zhì)地、大小等，并計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)＝臟器濕重（mg）／體質(zhì)量（g）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后一般情況觀察鹽水對(duì)照組給藥后10 min內(nèi)行動(dòng)遲緩，隨后恢復(fù)正常；丹瓜方1～3組給藥后15～30 min內(nèi)行動(dòng)遲緩，以丹瓜方3組為甚，且均較鹽水對(duì)照組明顯，但多在1 h內(nèi)恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d，小鼠狀態(tài)良好，未出現(xiàn)中毒反應(yīng)、死亡等明顯異常情況。

2.2 體質(zhì)量變化給藥后每日上午8時(shí)稱重，連續(xù)稱重14 d。丹瓜方2組和丹瓜方3組在灌胃后出現(xiàn)輕微體重減輕或體重增加不明顯，但隨后多在1～2 d內(nèi)恢復(fù)正常，可能與灌胃后應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，各組體重變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

2.3 肝腎功能4組小鼠生化指標(biāo)AST、ALT、BUN、Cr無明顯差異（P＞0.05），見表3。

2.4 病理解剖及臟器指數(shù)解剖后肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、胸腺等主要臟器，發(fā)現(xiàn)各組主要臟器

表2 4組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較（x±s）g

表3 4組小鼠生化指標(biāo)比較（x±s）

在顏色、質(zhì)地、大小等方面未存在明顯差異。各組主要臟器指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），見表4。

表4 4組小鼠臟器指數(shù)比較（x±s）

3 討論

丹瓜方中丹參活血化瘀兼養(yǎng)營(yíng)血，瓜蔞走陽明而降濁之性向下；郁金、赤芍、川芎助血行瘀散而不易生痰，法半夏直走太陰，薤白泄陽明而升太陰，僵蠶走肝以化痰散結(jié)。全方清潤(rùn)活血，化痰通絡(luò)而兼實(shí)脾之功。丹瓜方能顯著改善肝臟脂代謝，減輕肝臟脂肪沉積和纖維化，可能與丹瓜方促進(jìn)肝臟AdipoR2的表達(dá)有關(guān)［7］；其能顯著改變糖尿病模型大鼠胸主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)，對(duì)血管有明顯的保護(hù)作用［8］。此外，丹瓜方可適度促進(jìn)糖尿病鼠腦組織中IGF-1表達(dá)，這為丹瓜方防治糖尿病腦病提供了思路［9］。

急性毒性試驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)臨床用藥安全性的重要方法之一，本實(shí)驗(yàn)旨在客觀評(píng)價(jià)丹瓜方對(duì)小鼠生存狀態(tài)、主要臟器和肝腎功能的影響。本研究提示：丹瓜方對(duì)小鼠體重和主要臟器并未產(chǎn)生明顯影響，且肝腎功能指標(biāo)未見明顯異常。給藥后，小鼠狀態(tài)良好，未出現(xiàn)死亡情況，無法計(jì)算出其半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）。根據(jù)急性毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則，小鼠的最大耐受量大于臨床成人用藥量的100倍以上為安全［10］。丹瓜方3組以最大給藥濃度和最大灌胃容積給藥后小鼠出現(xiàn)輕微體重減輕和（或）增長(zhǎng)緩慢，但未出現(xiàn)死亡和明顯毒副反應(yīng)，即為丹瓜方最大耐受量；該組用藥量相當(dāng)于臨床成人用藥的262倍，提示丹瓜方臨床用藥安全可靠。丹瓜方的基礎(chǔ)研究［2-4，7-9］和本次急性毒性試驗(yàn)分別佐證了其良好的降糖調(diào)脂功效和較好的安全性，值得臨床進(jìn)一步推廣。

［1］衡先培，楊柳清，李亮.基于代謝病肝病傳脾探索早期干預(yù)2型糖尿病的新思路［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，35（6）：746-751.

［2］衡先培，李亮，黃蘇萍，等.丹瓜方對(duì)ApoE-／-糖尿病模型小鼠糖脂代謝及血管細(xì)胞黏附分子-1及mRNA表達(dá)水平的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（9）：1086-1095.

［3］黃蘇萍，陳燕，林妙嫻，等.丹瓜方防治轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠的氧化應(yīng)激肝損傷［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，24（5）：16-18.

［4］藍(lán)元隆，黃蘇萍，衡先培，等.丹瓜方對(duì)GK糖尿病-動(dòng)脈粥樣硬化復(fù)合模型大鼠血糖、食量和體重的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（6）：1296-1299，1453.

［5］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［S］.2005

［6］向明，季暉.藥物毒理學(xué)［M］.3版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：133-135.

［7］藍(lán)元隆，李亮，衡先培，等.丹瓜方對(duì)ApoE-／-糖尿病小鼠肝臟AdipoR2表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36（9）：1097-1102.

［8］黃蘇萍，林如輝，陳文列，等.丹瓜方對(duì)糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)影響的初步觀察［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，21（2）：19-22.

［9］顏群芳，陳依楚，黃蘇萍，等.丹瓜方干預(yù)ApoE-／-糖尿病模型小鼠腦組織IGF-1表達(dá)研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2015，35（4）：404-406.

［10］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：110-113.

R285.5

B

1000-338X（2017）03-0058-03

2017-05-12

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2014Y0063）

劉永進(jìn)（1991—），男，2015級(jí)中西醫(yī)結(jié)合臨床專業(yè)碩士研究生。

黃蘇萍（1963—），女，教授，主要從事內(nèi)分泌疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail：hsp@fjtcm.edu.cn