基于UPLC—Q—TOF—MS/MS技術分析利拉萘酯中主要雜質(zhì)

陳丹紅??顧勇??陳文明??龍紅萍

[摘要] 目的 采用液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（ HPLC-Q-TOF-MS） 分析利拉萘酯原料中主要雜質(zhì)并對其結構進行鑒定。方法 色譜柱為Agilent Extend C18（2.1×100 mm，1.8μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，體積流量為0.4m L/min；離子源：ESI 離子源；掃描模式：正離子掃描。結果 根據(jù)各降解雜質(zhì)的二級質(zhì)譜圖以及高分辨數(shù)據(jù)，利拉萘酯原料中主要存在6 個有關物質(zhì)，主要來源于原料中間體和降解產(chǎn)物。結論 建立的方法能有效地分離主成分利拉萘酯與有關物質(zhì)，為利拉萘酯原料藥的質(zhì)量控制、工藝優(yōu)化及貯存提供參考。

[關鍵詞] 利拉萘酯；有關物質(zhì)；雜質(zhì)結構鑒定；超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）11-36-04

Analysis on major impuritiy in liranaftate based on UPLC-Q-TOF-MS/MS

CHEN Danhong1 GU Yong1 CHEN Wenming2 LONG Hongping2

1.The Fifth Hospital of Jiangyin，Jiangyin 214415，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China

[Abstract] Objective To analyze major impuritiy in liranaftate by ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS）. Methods Chromatographic column was Agilent Extend C18 （2.1×100 mm，1.8μm） and mobile phase was 0.1% formic acid-water（A）-acetonitrile（B） with gradient elution. Volume flow was 0.4m L/min.Ion source was electrospray ionization （ESI） ion source.Scanning mode was positive ion scanning. Results According to secondary mass spectrum of degradation impurity and high resolution data，liranaftate mainly had 6 related substances which are mainly from raw material intermediate and degradation product.Conclusion The established method can effectively separate principal component liranaftate and related substances， which can provide reference for quality control，technology optimization and storage of liranaftate raw medicine.

[Key words] Liranaftate； Related substances；Structure identification of impuritiy；Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry

利拉萘酯（Liranaftate）是是用于皮膚局部感染的新一代抗真菌藥，與目前臨床上治療皮膚真菌感染的藥物。抗真菌譜廣，對包括須發(fā)癬菌在內(nèi)的皮真菌有強大的抗菌活性，對一些致病酵母菌也有很好的活性[1-5]。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術集液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的強結構解析能力于一體，已成為藥物雜質(zhì)分析的有力工具[6-12]。由于利拉萘酯的結構不穩(wěn)定，本文對利拉萘酯原料中的主要雜質(zhì)進行了研究，以HPLC-MS 技術為分析手段，對其中6個有關物質(zhì)進行了UPLC-Q-TOF測定，根據(jù)其裂解規(guī)律推測其可能的結構，為利拉萘酯的質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供了參考。

1 材料

儀器Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；MassHunter質(zhì)譜工作站（美國Agilent公司）；BiofugeprimoR臺式離心機（美國Thermo公司）；Milli-Q 超純水制備儀（美國Millipore公司）；x S105 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

藥品與試劑乙腈（質(zhì)譜純，德國Omni公司）；實驗室自制超純水；甲酸（質(zhì)譜純，美國Sigma公司）；利拉萘酯原料（湖南中醫(yī)藥大學藥化研究實驗室合成，批號為20161103）。

2 實驗方法

2.1 拉萘酯樣品溶液的制備

精密稱取約20mg利拉萘酯原料，精密加入5.00mL 50%甲醇，超聲提取10min，8000rpm離心10min，取上清液，再用甲醇稀釋5倍，0.22μm微孔濾膜濾過，即制得利拉萘酯樣品溶液。

2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱Agilent Extend C18（2.1×50mm，1.8μm），流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序：0～8 min，15%～25%B；8～12min，25%～35%B，流速：0.4mL/min，進樣量：2μL。

質(zhì)譜檢測條件：離子化方式為電噴霧離子化（ESI），準確質(zhì)量數(shù)用ESI-L Low Concentration Tuning Mix（G1969-85000）校正，正離子分析模式，MRE掃描方式。掃描檢測，m/z 100～1500，除溶劑氣體為氮氣，干燥氣溫度為325℃；干燥氣流速：6.8L/min；鞘氣溫度：350℃；毛細管電壓：4.0kV；Fragment電壓110V，掃描范圍為100 ～ 1000。

3 實驗結果

3.1 UPLC-Q-TOF 法分析利拉萘酯原料的主要雜質(zhì)

采用Q-TOF/MS技術對利拉萘酯中的主要雜質(zhì)進行分析。在總離子流圖中，利拉萘酯原料藥中主要檢測出6個雜質(zhì)，結果見圖1。根據(jù)LC-MS/MS對利拉萘酯進行分析，得到各有關物質(zhì)的一級、二級質(zhì)譜信息（表1）數(shù)據(jù)，對6個雜質(zhì)的結構進行解析。

3.2 利拉萘酯有關物質(zhì)的結構鑒定推測

將利拉萘酯各有關物質(zhì)與利拉萘酯的一級、二級質(zhì)譜信息進行對比研究，對各有關的物質(zhì)結構進行解析，推測其可能的化學結構如下：

3.2.1 有關物質(zhì)1 時間為4.328min，一級質(zhì)譜中主要加合離子為m/z 199.2133，同時還有m/z 221.1895，推定這兩個離子分別為[M+H]+和[M+Na]+，其分子式為C8H10N2O2S，其二級質(zhì)譜主要碎片181.1688[M+H-CH3]， 167.1455[M+H-S]， 110.0528[M+H-OHCSNCH3]，推斷出雜質(zhì)1的結構見圖3。

3.2.2 有關物質(zhì)2 時間為5.196min，一級質(zhì)譜中主要加合離子為m/z 285.1513，同時還有m/z 307.1657，推定這兩個離子分別為[M+H]+和[M+Na]+，其分子式為C16H16N2O3，其二級質(zhì)譜主要碎片181.2015，131.2144，149.1562，108.1380，93.1042，其二級碎片離子與利拉萘酯的二級碎片離子比較，推斷出雜質(zhì)2可能為利拉萘酯中的S被O取代和N去甲基，雜質(zhì)2的結構見圖3。

3.2.3 有關物質(zhì)3 時間為5.642min，一級質(zhì)譜中主要加合離子為m/z 315.1267，同時還有m/z 337.1955，推定這兩個離子分別為[M+H]+和[M+Na]+，其分子式為C17H18N2O2S，其二級質(zhì)譜主要碎片有183.2133， 167.1988， 131.2144， 150.1562，108.1380，93.1042，其二級碎片離子與利拉萘酯的二級碎片離子比較，推斷出雜質(zhì)3可能為利拉萘酯中的N去甲基，雜質(zhì)3的結構見圖3。

3.2.4 有關物質(zhì)4 時間為8.914min，一級質(zhì)譜中主要加合離子為m/z 313.1474，同時還有m/z 335.1857，推定這兩個離子分別為[M+H]+和[M+Na]+，其分子式為C18H20N2O3，其二級質(zhì)譜主要碎片181.1988，165.2094，149.1730，108.1380，93.1126，其二級碎片離子與利拉萘酯的二級碎片離子比較，推斷出雜質(zhì)4可能為利拉萘酯中的S被O取代，雜質(zhì)4的結構見圖3。

3.2.5 有關物質(zhì)5 時間為9.348min，一級質(zhì)譜中主要加合離子為m/z 283.1987，同時還有m/z 305.2213，推定這兩個離子分別為[M+H]+和[M+Na]+，其分子式為C17H18N2O2，其二級質(zhì)譜主要碎片151.1998，131.2144，119.2001，79.2214，其二級碎片離子與利拉萘酯的二級碎片離子比較，推斷出雜質(zhì)5可能為雜質(zhì)4去一個甲氧基的產(chǎn)物，雜質(zhì)5的結構見圖3。

3.2.6 有關物質(zhì)6 時間為10.482min，一級質(zhì)譜中主要加合離子為m/z 299.1365，同時還有m/z 321.1879，推定這兩個離子分別為[M+H]+和[M+Na]+，其分子式為C17H18N2OS，其二級質(zhì)譜主要碎片167.2102， 151.1998，135.1699， 131.2144，79.2214，其二級碎片離子與利拉萘酯的二級碎片離子比較，推斷出雜質(zhì)5可能為利拉萘酯去一個甲氧基的產(chǎn)物，雜質(zhì)6的結構見圖3。

3.3 利拉萘酯雜質(zhì)來源分析

萘酯原料藥中共檢測到的6個雜質(zhì)，根據(jù)利拉萘酯合成的相關文獻報道，其中雜質(zhì)2～6均為與主成分結構相似的，為利拉萘酯的去甲基，去甲氧基，硫被氧取代的一系類反應和代謝產(chǎn)物[13-15]，雜質(zhì)1為合成原料中間體。

4 討論

文獻報道利拉萘酯的含量有關物質(zhì)檢查均采用高效液相色譜法-紫外檢測器[16]，在沒有對照品的前提下很難對其進行鑒別，本研究參考相關文獻建立了UPLC-Q-TOF/MS 分析方法，并對其色譜的梯度條件進行了優(yōu)化，在該條件下，利拉萘酯及其有關物質(zhì)都能得到有效分離。研究結果表明，在此色譜條件下，利拉萘酯與其他主要有關物質(zhì)均能有效分離和鑒定

UPLC-Q-TOF/MS 、超高效液相-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術，該技術既能對化合物進行分離，提供有關物質(zhì)的二級質(zhì)譜，又能提供該物質(zhì)的精確分子量，相比一般質(zhì)譜技術具有一定優(yōu)勢[17-20]。本研究將UPLC-Q-TOF/MS 技術用于研究利拉萘酯的有關物質(zhì)分析，并基于此進行了有關物質(zhì)的結構推斷，為利拉萘酯的質(zhì)量控制和工藝優(yōu)化提供了參考。

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（收稿日期：2017-04-05）