參草通脈顆粒對慢性心衰大鼠MMP—3與TIMP—3的影響的實驗研究

張宇

[摘要] 目的 探討參草通脈顆粒對慢性心衰大鼠MMP-3與TIMP-3的影響。方法 隨機選取10只大鼠作為正常對照組，10只作為假手術(shù)組，40只構(gòu)建慢性心衰模型，建模成功后隨即選取30只，分為模型組、西藥組及中藥組，各10只；對照組、假手術(shù)組及模型組采用蒸餾水灌胃，西藥組給予賴諾普利處理，中藥組給予參草通脈顆粒處理；Western blot法檢測心肌組織中MMP-3、TIMP-3蛋白表達量。結(jié)果 與正常對照組相比，假手術(shù)組MMP-3表達有所增加，TIMP-3表達有所下降，但組間比較差異不顯著（P>0.05）；與假手術(shù)組相比，模型組MMP-3表達顯著增加，TIMP-3表達顯著下降（P<0.05）；中藥組及西藥組與模型組相比，MMP-3表達顯著下調(diào)且TIMP-3表達顯著上調(diào)（P<0.05），但并未恢復到假手術(shù)組水平；中藥組與西藥組組間比較MMP-3及TIMP-3表達差異不顯著（P>0.05）。此外，中藥組、西藥組與模型組相比，LVIDs、LVIDd下降，EF 值上升（P<0.05）。結(jié)論 參草通脈顆?？梢韵抡{(diào)MMP-3的表達，增加TIMP-3的表達，從而阻止MMP-3對心肌細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞作用，阻止CHF的發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]參草通脈顆粒；心力衰竭；MMP-3；TIMP-3

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）11-33-04

Experimental study on effects of Shencao Tongmai granule on MMP-3 and TIMP-3 in chronic heart failure rats

ZHANG Yu

Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning 110032， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Shencao Tongmai granule on MMP-3 and TIMP3 expressions in chronic heart failure rats. Methods 10 rats were randomly selected as control group， other 10 as sham-operated group， and 40 rats were chosen underwent chronic heart failure model building， within which 30 were chosen as model group（10 cases）， western medicine group（10 cases）， and traditional Chinese medicine group（10 cases）， randomly. The control group， sham-operated group and model group were given gastric perfusion of distilled water. Western medicine group was taken lisinopril and the traditional Chinese medicine group was taken Shencao Tongmai granule. The expressing quantities of MMP-3 and TIMP3 in myocardial tissue were detected by Western blot. Results Compared with control group， the expression of MMP-3 in sham-operated group was increased and TIMP-3 decreased（P>0.05）. Compared with sham-operated group， the expression of MMP-3 in model group was increased and TIMP-3 decreased（P<0.05）. Compared with western medicine group and traditional Chinese medicine group， the expression of MMP-3 was decreased and TIMP-3 increased（P<0.05）. There was no significant difference of MMP-3 and TIMP-3 between western medicine group and traditional Chinese medicine group（P>0.05）. In addition， compared with model group， LVIDs and LVIDd decreased and EF values increasedin the traditional Chinese medicine group and western medicine group（P<0.05）. Conclusion Shencao Tongmai granule can reduce the expression of MMP-3 and promote the expression of TIMP-3， so as to stop the destruction of MMP-3 to myocardial extracellular matrix and to impede the progress of CHF.

[Key words] Shencao Tongmai granule； Cardiac failure； MMP-3； TIMP-3

慢性心力衰竭是指心臟的泵血功能不足，導致各組織灌注不足從而發(fā)生肺循環(huán)或（和）體循環(huán)淤血，是臨床各種心臟疾病的最終發(fā)展[1-2]。細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，EMC）的正常合成與降解是心臟維持正常生理功能的基礎(chǔ)；有研究表明，EMC的重構(gòu)在慢性心力衰竭疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，而EMC的重構(gòu)是體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）及其組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）動態(tài)平衡的結(jié)果[3-4]。參草通脈顆粒是我院自行研制的中藥制劑，臨床用于治療慢性心力衰竭且取得較好療效[5]?；诖说壤碚摶A(chǔ)，本研究探討了經(jīng)參草通脈顆粒處理后，慢性心力衰竭大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制物-3（tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3）表達的變化，旨在了解該病的致病機理并未該病治療提供新的作用靶位點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用12周齡SD大鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK（遼）2010-0001]，60只，體重為（230±10）g，雄性。將納入的60只SD普通級12周齡雄性大鼠，經(jīng)過一周適應(yīng)性喂養(yǎng)，體重達到260～300g。隨機選取10只作為空白對照組，正常飼養(yǎng)即可。另取10只作為假手術(shù)組，僅縫線于左冠狀動脈前降支起源點2～4mm處穿針，但并不結(jié)扎。其余40只大鼠進行慢性心衰造模。在造模成功的心衰大鼠中隨機選取30只作為研究對象并隨機分為模型組、西藥組和中藥組，每組10只。

1.2 實驗儀器

HD-1小動物呼吸機購自浙江醫(yī)科大學醫(yī)療儀器實驗廠，DYY-7C電泳儀購自北京六一公司，DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽購自北京六一公司，SW1022-ProfiBlot 48全自動蛋白印跡分析儀購自美國Bioneer公司，DYCZ-24DN雙垂直蛋白電泳儀購自北京六一公司，MicroChemi 4.2凝膠電泳成像分析系統(tǒng)購自以色列DNR公司，DYY 40B 型轉(zhuǎn)印電泳槽購自北京六一儀器廠。

1.3 實驗藥品與試劑

參草通脈顆粒配方中包含人參、丹參、黃芪、葶藶子、益母草、紅花、茯苓等，由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制備并負責煎煮，湯劑濃縮至相對密度1.06～1.07的液體。賴諾普利片（上海信誼萬象藥業(yè)股份提供，H10960265，規(guī)格：10m/片）。組織總蛋白提取試劑盒、MMP-3、TIMP-3及β-actin單克隆抗體及二抗均購自美國sigma公司。

1.4 動物分組及處理

慢性心衰造模，具體步驟為：采用0.4mL/100g 10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，H37022673）腹腔麻醉，之后背位固定；人工呼吸經(jīng)喉氣管插管術(shù)連接小動物呼吸機進行，參數(shù)為頻率80～100次/min，潮氣量6.0mL/kg，呼吸比例1∶2，剪胸部毛，四肢及胸壁皮處刺入針形電極用于連接心電圖機，記錄心電圖。常規(guī)消毒后在左側(cè)第三、四肋間橫向切開皮膚1.5cm，分離出胸骨及肋軟骨，沿3、4肋間隙打開胸腔，處理心包膜后使心臟暴露，選擇在左冠狀動脈前降支起源點2～4mm處對左冠狀動脈主干進行結(jié)扎，當胸前導聯(lián)ST段及T波出現(xiàn)異常時將心臟放回胸腔，迅速縫合。使用青霉素鈉[石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，H13021984]對傷口進行處理，在大鼠狀態(tài)平穩(wěn)后停人工呼吸。對大鼠口腔內(nèi)痰進行清理；為防止感染，進行5d的青霉素鈉4萬單位/（次·日）注射。之后一周進行常規(guī)喂養(yǎng)，在第二周飼料減半，使大鼠處于饑餓狀態(tài)，同時每天游泳一次至其疲乏，經(jīng)四周處理后對。左室射血分數(shù)采用多普勒超聲心動圖進行檢測，當心臟射血分數(shù)（ejection fraction，EF值）≤55%或心臟指數(shù)（cardiac index，CI值）≤180mL/（min·kg）者為心衰[6-7]，同時大鼠表現(xiàn)為毛色無光澤，精神萎靡。

空白對照組、假手術(shù)組及模型組大鼠均采用常規(guī)等容積蒸餾水灌胃，不進行藥物處理；西藥組給予1.5mg生藥/（kg·d）賴諾普利（麗珠集團麗珠制藥廠，H64200082）處理，中藥組給予9.2g生藥/（kg·d）參草通脈顆粒處理。

1.5 MMP-3和TIMP-3表達量檢測

各組（空白對照組，假手術(shù)組，模型組，中藥組，西藥組）實驗大鼠經(jīng)灌胃給藥處理4周后，采用多普勒超聲心動圖進行左室收縮末期內(nèi)徑（LVID）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）以及左室射血分數(shù)（EF%）的檢測。

隨后，禁食不禁水12h。全部進行麻醉處死。取100mg左右心肌組織進行總蛋白提取并對提取濃度進行測定，樣品-80℃保存。以β-actin作為內(nèi)參，MMP-3和TIMP-3表達量采用Western blog進行測定；所有蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，分別用MMP-3、TIMP-3及β-actin一抗進行孵育，之后使用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，曝光及洗片使用儀器進行定量分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)使用excel進行整理，統(tǒng)計分析采用SPSS20.0軟件，計量資料均采用（）表示，采用單因素方差分析（one-way AONVA）進行比較，組間比較采用t檢驗，具有統(tǒng)計學差異的評判標準為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MMP-3及TIMP-3表達量比較結(jié)果