肝細(xì)胞癌患者血清miR—155的表達(dá)及臨床意義

李土華?官成濃?李躍

[摘要] 目的 研究肝細(xì)胞癌（HCC）患者血清中microRNA-155（miR-155）的表達(dá)水平及其臨床意義。 方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)50例HCC患者的術(shù)前血清及50例健康人血清的miR-155相對(duì)表達(dá)量，分析血清miR-155表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及術(shù)后1年無(wú)復(fù)發(fā)生存（RFS）率的關(guān)系。 結(jié)果 31例（62%）HCC患者血清miR-155相對(duì)表達(dá)量高于健康人血清（P=0.03），血清miR-155表達(dá)與HCC癌組織的Edmonson分級(jí)（P=0.01）及脈管侵犯（P=0.02）相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、肝硬化、分期、HBV DNA拷貝數(shù)及AFP均無(wú)關(guān)（P>0.05）。單因素分析顯示脈管侵犯及肝硬化與術(shù)后1年RFS率低正相關(guān)。血清miR-155高表達(dá)者比低表達(dá)者1年RFS率低（45.9% vs76.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）。多因素分析顯示脈管侵犯（P=0.15）及miR-155（P=0.05）是影響HCC患者術(shù)后1年RFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 結(jié)論 血清miR-155是一個(gè)對(duì)HCC惡性程度的判斷、侵襲性生物學(xué)行為的預(yù)測(cè)和術(shù)后預(yù)后評(píng)估都很有價(jià)值的生物指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] miR-155；肝細(xì)胞癌；血清；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）11-09-06

Expression of serum miR-155 of patients with hepatocellular carcinoma and its clinical significance

LI Tuhua1 GUAN Chengnong2 LI Yue3

1.Center of Oncology，The Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China；2.The Second Clinical Medical College，Guangdong Medical University，Dongguan 523808，China；3.Graduate School，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，China

[Abstract] Objective To research the expression level of serum microRNA-155 （miR-155） of patients with hepatocellular carcinoma （HCC） and its clinical significance. Methods Preoperative serum of 50 patients with HCC and relative expression of serum miR-155 of 50 healthy cases were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Relationships between expression level of serum miR-155 and clinical pathological parameters and rate of recurrence-free survival （RFS） of one year after operation were analyzed. Results Relative expression of serum miR-155 of 31 patients （62%） with HCC was higher than that of healthy cases（P=0.03）. Expression of serum miR-155 was related to Edmonson grading of HCC（P=0.01） and vessel invasion（P=0.02）.But it had no relation with age，sex，size of tumors，number of tumors，cirrhosis，staging，HBV DNA copy number and AFP （P>0.05）.Univariate analysis showed that vascular invasion and liver cirrhosis was positively correlated with RFS rate of one year after operation.RFS rate of one year after operation of patients with high expression of serum miR-155 was lower than that of patients with low expression of serum miR-155（45.9% vs76.6%）.The differences was statistically significant （P=0.02）.Multivariate analysis showed that vascular invasion（P=0.15） and miR-155（P=0.05） were independent risk factors for RFS rate of one year after operation of patients with HCC. Conclusion Serum miR-155 is a biological index of great value to evaluate malignant degree， predict invasive biological behavior and evaluate postoperative prognosis.

[Key words] MiR-155；Hepatocellular carcinoma；Serum；Prognosis

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上惡性程度最高的惡性腫瘤之一，每年全球新發(fā)病例數(shù)有50%在中國(guó)[1]。中國(guó)癌癥死因順位HCC位列第三位[2]。探討HCC早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)有重要意義。自從miRNA

在2008年在血液中被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，循環(huán)miRNAs就被認(rèn)為可能是惡性腫瘤輔助診斷和判斷預(yù)后的重要生物標(biāo)記物。MiR-155是miRNA的一種，位于人類 21 號(hào)染色體上BIC（b-cell integration cluster）基因的第三個(gè)外顯子內(nèi)[3]。研究表明，miR-155對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)揮癌基因的作用[4]。循環(huán)miR-155的研究是目前的熱點(diǎn)之一。循環(huán)miR-155在乳腺癌[5]、肺癌[6]及結(jié)直腸癌[7]等惡性腫瘤的早期診斷、良惡性鑒別、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或生存等預(yù)后預(yù)測(cè)方面均有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。但是目前有關(guān)循環(huán)miR-155在HCC患者中的表達(dá)情況及臨床意義的研究，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)HCC患者及健康人血清中miR-155的表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比研究，并進(jìn)一步探討循環(huán)miR-155與HCC患者術(shù)后1年無(wú)復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）率的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

50例HCC患者均為廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科2014年1月～ 2015年12月的住院患者。其中男45例，女5例；年齡29～75歲，年齡中位數(shù) 48歲；腫瘤最大徑≥5cm的14例，<5cm的36例；腫瘤分化程度：高、中分化26例，低、未分化24例；腫瘤單發(fā)29例，多發(fā)11例；有脈管侵犯9例，無(wú)脈管侵犯41例；血清AFP≥400ng/mL 17例，AFP<400ng/mL 33例；HbsAg≥500copies/mL 19例，<500 copies/mL 31例；按國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）臨床TNM分期，I期30例，II期20例。有肝硬化23例，無(wú)肝硬化27例。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)化療、放療、介入、靶向、及非甾體類抗炎藥等治療。對(duì)照組為50例同期健康體檢人群，其中男45例，女5例，年齡中位數(shù)47歲，無(wú)心、肝、腦、肺、腎等重要器官疾病史及消化道和婦科疾病史。

1.2 主要試劑

MiRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒由北京天根公司提供；miR-155引物及內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 在患者入院后第1天空腹抽取靜脈血3mL，離體2h內(nèi)在4℃、12000r/min×10min條件下進(jìn)行血清分離。然后把血清保存在-80℃冰箱，直至RNA提取。同樣的方法采集、分離和保存健康體檢人員血清。

1.3.2 RNA提取 實(shí)驗(yàn)組及健康對(duì)照組血清均使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的miRcute miRNA提取分離試劑盒進(jìn)行miRNA的提取，將提取出的miRNA保存與-80℃冰箱以備下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 miRNA的cDNA合成 選用天根生化科技（北京）有限公司miRcute miRNA第一鏈的合成試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書操作，合成后的cDNA保存與-20℃冰箱已備下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.4 miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的miRcute-miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量?jī)xLightCycler480上進(jìn)行。血清以U6為內(nèi)參基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測(cè)miR-155在血清中的表達(dá)情況。HCC患者血清及健康人血清miR-155表達(dá)量比較采用2-ΔCt法，待測(cè)miR-155相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為RQ=2-ΔΔCt。每個(gè)樣品配置3個(gè)復(fù)孔，且連續(xù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)以校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)做空白對(duì)照組以提高實(shí)驗(yàn)可靠性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料結(jié)果用中位數(shù)及四分位數(shù)間距（25%，75%）表示。HCC患者及健康者血清miR-155的表達(dá)量比較應(yīng)用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。不同臨床病理學(xué)特征分組的miR-155表達(dá)比較應(yīng)用Mann-Whitney檢驗(yàn)。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，并進(jìn)行Log-Rank檢驗(yàn)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-155在HCC患者血清及健康人血清中的表達(dá)

50例HCC患者血清及50例健康人血清的miR-155的平均表達(dá)量數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以中位數(shù)及四分位數(shù)間距（25%，75%）表示分別為0.06（0.03，0.14）、0.02（0.01，0.06）。HCC患者血清miR-155的平均表達(dá)量高于健康人血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）。有68%（34/50）的HCC患者血清miR-155相對(duì)于健康對(duì)照組血清表達(dá)上調(diào)，表達(dá)水平平均上調(diào)3.24倍，95%CI（2.67，3.98）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 nmiR-155在HCC患者血清及健康人血清中的表達(dá)結(jié)果分析

組別 n miR-155的相對(duì)表達(dá)量

HCC患者 50 0.06（0.03，0.14）

健康人對(duì)照組 50 0.02（0.01，0.06）

P 0.03

圖1 miR-155在HCC患者及健康人血清中的表達(dá)

2.2 HCC患者血清miR-155表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

血清miR-155表達(dá)水平與HCC Edmonson分級(jí)、脈管侵犯相關(guān)。在Edmonson分級(jí)III/IV級(jí)、有脈管侵犯的患者血清中的表達(dá)水平明顯高于Edmonson分級(jí)I/II級(jí)、無(wú)脈管侵犯者患者（P<0.05）；血清miR-155的表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、肝硬化、分期、HBV DNA拷貝數(shù)及AFP均無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)圖2、3，表2。

圖2 血清miR-155表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系

圖3 血清miR-155表達(dá)與脈管侵犯的關(guān)系

2.3 肝細(xì)胞癌術(shù)后1年無(wú)復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）率的影響因素

2.3.1 隨訪結(jié)果 對(duì)50例HCC患者術(shù)后進(jìn)行住院、門診或者電話隨訪，隨訪頻率每3～4個(gè)月一次。通過(guò)患者癥狀體征、AFP和影像學(xué)檢查等資料，監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)情況，隨訪截止時(shí)間2016年12月31日。術(shù)后生存時(shí)間按月計(jì)算，以手術(shù)當(dāng)天開(kāi)始計(jì)算時(shí)間。本研究中，50例行肝癌根治性切除術(shù)的患者術(shù)后隨訪期間共有3例患者失訪，失訪率6%。隨訪時(shí)間12個(gè)月時(shí)，有18例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，1年RFS率64%。

2.3.2 患者臨床病理參數(shù)與HCC術(shù)后1年RFS率的關(guān)系 把50例患者的臨床病理參數(shù)用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，結(jié)果顯示有脈管侵犯（HR3.89，95%CI 1.29 ～ 11.91，P=0.01）和肝硬化（HR2.68，95%CI 1.03 ～ 7.01，P=0.03）的患者與術(shù)后1年RFS率低正相關(guān)，見(jiàn)表2、圖4、5。

2.3.3 血清miR-155水平與HCC術(shù)后1年RFS率的關(guān)系 把血清miR-155在HCC患者相對(duì)健康對(duì)照組的表達(dá)水平≥3.24倍定義為高表達(dá)，小于3.24倍為低表達(dá)。把50例患者分為高表達(dá)組（31例）和低表達(dá)組（19例）。用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析。結(jié)果顯示miR-155高表達(dá)組1年RFS率（45.9%）明顯低于低表達(dá)組（76.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR2.77，95%CI 1.02 ～ 7.51，P=0.02）。見(jiàn)表2、圖6。

圖4 脈管侵犯與術(shù)后1年RFS率的關(guān)系

圖5 肝硬化與術(shù)后1年RFS率的關(guān)系

表2 單因素分析影響術(shù)后1年RFS率的因素

因素 n 術(shù)后1年RFS率（%） HR及95%CI Log-Rank test

χ2 P

性別 2.24 0.13

男 45 65.2 0.41（0.07 ～ 2.34）

女 5 40 2.47（0.43 ～ 14.26）

年齡 0.01 0.92

≥50歲 22 62.2 1.0500（0.4133 ～ 2.6680）

<50歲 28 63.2 0.9524（0.3748 ～ 2.4198）

Edmonson分級(jí) 2.11 0.15

Ⅰ/Ⅱ級(jí) 26 71.1 0.51（0.20 ～ 1.29）

Ⅲ/Ⅳ 24 53.8 1.97（0.78 ～ 4.99）

腫瘤大小 2.84 0.09

≥5cm 14 49 2.19（0.72 ～ 6.62）

<5㎝ 36 67.8 0.46（0.15 ～ 1.38）

腫瘤個(gè)數(shù) 0.44 0.51

1個(gè) 29 65.8 0.71（0.23 ～ 2.19）

≥2個(gè) 11 51.1 1.41（0.46 ～ 4.34）

脈管侵犯 5.64 0.01*

有 9 38.9 3.89（1.29 ～ 11.91）

無(wú) 41 67.6 0.35（0.08 ～ 1.45）

肝硬化 4.69 0.03*

有 9 45.6 2.68（1.03 ～ 7.01）

無(wú) 27 75 0.37（0.14 ～ 0.97）

AJCC TNM分期 1.92 0.16

Ⅰ期 30 73.2 0.49（0.19 ～ 1.26）

Ⅱ期 20 55.8 2.02（0.79 ～ 5.13）

HBv DNA 0.84 0.35

≥500copies/mL 19 56.4 1.60（0.62 ～ 4.15）

<500copies/mL 31 72.7 0.62（0.24 ～ 1.62）

AFP 0.03 0.87

≥400ng/mL 17 61.4 1.08（0.40 ～ 2.92）

<400ng/mL 33 63.2 0.92（0.34 ～ 2.49）

miR-155 5.18 0.02*

高表達(dá) 31 45.9 2.77（1.02 ～ 7.51）

低表達(dá) 19 76.6 0.36（0.13 ～ 0.98）

圖6 miR-155與術(shù)后1年RFS率的關(guān)系

2.3.4 影響HCC患者術(shù)后1年RFS率的多因素分析 將上述單因素分析差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的3個(gè)變量，即脈管侵犯、肝硬化及miR-155帶入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果顯示脈管侵犯（P=0.15）及miR-155（P=0.05）是影響HCC患者術(shù)后1年RFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。1年RFS率預(yù)測(cè)方程總的χ2=11.88，P=0.01，方程建立合理。見(jiàn)表3。

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血液中miRNA可由腫瘤組織的主動(dòng)分泌及腫瘤細(xì)胞的選擇性分泌進(jìn)入血液產(chǎn)生，或者由腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死釋放產(chǎn)生[8-9]。miRNA在血液中可以抵抗循環(huán)核糖核酸酶的降解，保持長(zhǎng)期穩(wěn)定。體外標(biāo)本在高溫煮沸、多次反復(fù)凍

表3 多因素分析影響術(shù)后1年RFS率的因素

變量 b SE Wald P Exp（b） Exp（b）的95% CI

脈管侵犯 1.38 0.57 5.93 0.015 3.96 1.32～11.94

肝硬化 0.75 0.51 2.17 0.14 2.12 0.78～5.72

miR-155 1.11 0.52 3.83 0.05 2.74 1.00～7.51

融、高或低的PH值、RNA酶等條件下均不會(huì)降解，而且不同疾病有不同的miRNAs表達(dá)譜[10]。表明循環(huán)miRNA可能是潛在的新型腫瘤標(biāo)志物。目前循環(huán)miR-155也是研究熱點(diǎn)之一。

研究表明，miR-155與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。高表達(dá)的miR-155可以上調(diào)癌基因IGF-II和IGF-IR的表達(dá)，并且下調(diào)抑癌基因IGFBP-3的表達(dá)，導(dǎo)致HCC細(xì)胞的癌變[11]。此外，miR-155可以靶向抑制ARID-2基因的表達(dá)，增強(qiáng)Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，從而促進(jìn)HCC癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)在HCC腫瘤組織中miR-155表達(dá)水平較癌旁非癌性組織明顯升高[13]。而對(duì)于HCC患者血清中的miR-155表達(dá)情況，目前尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)在HCC患者血清中miR-155的平均表達(dá)量也明顯高于健康人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）。并且血清miR-155表達(dá)水平與HCC Edmonson分級(jí)、脈管侵犯相關(guān)。在Edmonson分級(jí)III/IV級(jí)、有脈管侵犯的患者血清中的表達(dá)水平明顯高于Edmonson分級(jí)I/II級(jí)、無(wú)脈管侵犯者患者（P<0.05）。提示監(jiān)測(cè)血清miR-155的表達(dá)水平可以用于判斷HCC的惡性程度及預(yù)測(cè)其侵襲性生物學(xué)行為。

手術(shù)切除是原發(fā)性肝癌最主要、最有效的治療方法，但肝癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)率很高。HCC根治術(shù)后1年內(nèi)的復(fù)發(fā)率（大約19%～43%）比1年后的復(fù)發(fā)率更高、預(yù)后更差，并將HCC根治術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)定義為早期復(fù)發(fā)[14-16]。在本研究中，50例患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率36%，1年RFS率64%，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相仿。蔡新然等[17]回顧性分析了110例根治性切除術(shù)后HCC患者的復(fù)發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)門靜脈分支癌栓是早期復(fù)發(fā)相關(guān)的唯一危險(xiǎn)因素。陳星等[15]研究表明脈管侵犯影響直徑≤5cm單發(fā)小肝癌手術(shù)切除后無(wú)進(jìn)展生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在本研究中，多因素分析顯示脈管侵犯（P=0.02）是影響HCC患者術(shù)后1年RFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果也與蔡新然及陳星等學(xué)者的研究結(jié)果一致。表明對(duì)于有脈管侵犯的患者，術(shù)后更應(yīng)該密切隨訪，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期復(fù)發(fā)的情況。

miR-155與HCC預(yù)后也密切相關(guān)。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-155與HCC根治術(shù)后5年無(wú)復(fù)發(fā)生存率相關(guān)，高表達(dá)miR-155的患者5年RFS率比低表達(dá)的患者顯著降低（HR=2.002，95%CI 1.324 ～ 3.027）。Guang等[13]研究檢測(cè)了HCC組織中miR-155的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的患者較低表達(dá)者1年RFS率低（48% vs 73.3%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.105），提示miR-155并不是預(yù)測(cè)肝癌早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)。目前尚無(wú)檢測(cè)循環(huán)miR-155用于預(yù)測(cè)判斷HCC早期復(fù)發(fā)情況的研究報(bào)道。在本研究中，單因素生存分析顯示miR-155高表達(dá)組1年RFS率（45.9%）明顯低于低表達(dá)組（76.6%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR2.77，95%CI 1.02 ～ 7.51，P=0.02）。多因素分析顯示miR-155（P=0.05）是影響HCC患者術(shù)后1年RFS率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，提示術(shù)前血清miR-155也是一個(gè)可用于預(yù)測(cè)評(píng)估HCC患者早期復(fù)發(fā)情況的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

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（收稿日期：2017-04-08）