銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量分析

吳 竹，王秋萍，田漫漫，王黔陽，何 珺*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

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銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量分析

吳 竹1，2，王秋萍1，2，田漫漫1，2，王黔陽2，何 珺2*

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省生化工程中心，貴州 貴陽 550025)

為分析銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量，采用高效液相色譜法測(cè)定其含量，研究其分布規(guī)律。結(jié)果表明：雌樹不同部位中，葉的黃酮和內(nèi)酯含量高于其他部位，外種皮中銀杏酸含量高于其他部位；雄樹不同部位中，葉的黃酮和內(nèi)酯含量高于樹枝，樹枝的銀杏酸含量高于葉。綜上所述，雌雄銀杏的不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸的含量有一定的差異，應(yīng)對(duì)其不同部位進(jìn)行合理利用從而加快銀杏產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展。

銀杏；黃酮；內(nèi)酯；銀杏酸；含量分析

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科、銀杏屬多年落葉喬木。銀杏起源于中國(guó)，它集果用、樹用、防護(hù)、觀賞于一體，是我國(guó)特有的多用途樹種。銀杏中所含的成分復(fù)雜多樣，在不同部位其種類及生物活性也各有不同。銀杏的葉、果仁、外種皮均有藥理作用，其中藥用價(jià)值最高的部位是銀杏葉。以銀杏葉提取物為原料制成的各種產(chǎn)品，應(yīng)用于藥物、保健食品、功能性飲料等領(lǐng)域[1]。在全球的天然藥物中，銀杏制劑是用量較大的品種之一，在國(guó)內(nèi)銀杏制劑的年銷售額約為60億元，在心腦血管疾病中應(yīng)用廣泛[2，3]。銀杏主要的活性成分為黃酮類、內(nèi)酯類化合物和銀杏酸[4]，但雌雄植株的不同部位在活性成分含量上有很大區(qū)別。黃酮類化合物主要以黃酮苷形式存在，可有效清除自由基[5]；內(nèi)酯類化合物為強(qiáng)效血小板活化因子(PAF)拮抗劑[6，7]；而銀杏酚酸類成分具有致敏性、細(xì)胞毒性和免疫毒性，為銀杏及白果的主要毒性成分，也是銀杏提取物及其制劑中的主要毒性物質(zhì)[8]。2015版藥典要求銀杏葉中總黃酮大于0.40%，總內(nèi)酯大于0.25%，同時(shí)要求銀杏葉提取物中總黃酮大于24%，總內(nèi)酯大于6%，而總銀杏酸含量不得超過10 mg/kg。我國(guó)的銀杏資源豐富，銀杏渾身是寶，具有極高的藥用價(jià)值。因此探索銀杏不同部位黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量，并進(jìn)行比較分析，為提高銀杏的綜合利用價(jià)值，同時(shí)為加快銀杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展及提高利用效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

對(duì)照品：槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081-201408)；山柰素對(duì)照品(批號(hào)：110861-201310)；異鼠李素對(duì)照品(批號(hào)：110860-201410)；白果內(nèi)酯(批號(hào)：110863-201505)；銀杏內(nèi)酯A(批號(hào)：110862-201511)；銀杏內(nèi)酯B(批號(hào)：110863-201410)；銀杏內(nèi)酯C(批號(hào)：110864-201505)；白果新酸(批號(hào)：111690-201403)；銀杏總酸(批號(hào)：111594-201503)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所，供含量測(cè)定用。

樣品：銀杏葉、銀杏樹枝、白果、外種皮，于2015年10月下旬在江蘇邳州市鐵富鎮(zhèn)銀杏種植基地隨機(jī)采集5棵8～10年樹齡銀杏樹的鮮樣，統(tǒng)一置于60℃烘箱中烘干，粉碎，密封袋包裝保存于干燥器中備用。

試劑：甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(分析純，貴陽高新技術(shù)開發(fā)區(qū)華通化學(xué)試劑廠)；四氫呋喃(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；三氟乙酸(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；酸性氧化鋁(200-300目，柱層析用，桂林貴成科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

儀器：分析型HPLC(1100 series)Agilent Technology， U.S；C18高效液相色譜柱(大連依利特分析儀器有限公司)；BSA124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；FW80高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；XMTD-3302數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州華奧儀器制造有限公司)；GZX-9140電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠)；其他為一般常規(guī)儀器。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

1.2.1.1 測(cè)定黃酮色譜條件：大連依力特Hypersil ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液(50：50)；流速：0.80 mL/min；柱溫：(45±0.1)℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。

1.2.1.2 測(cè)定內(nèi)酯色譜條件：大連依力特Hypersil ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-四氫呋喃-水(25：10：65)；流速：0.80 mL/min；柱溫：(40±0.1)℃；蒸發(fā)光檢測(cè)器。

1.2.1.3 測(cè)定銀杏酸色譜條件：大連依力特Hypersil ODS2色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸的乙腈為流動(dòng)相A，0.1%三氟乙酸的水為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：310 nm[9]。

表1 洗脫梯度

1.2.2 對(duì)照品溶液制備

1.2.2.1 黃酮對(duì)照品溶液的制備：參照《中國(guó)藥典》2015版第一部銀杏葉總黃酮醇苷含量測(cè)定中對(duì)照品溶液制備方法，配制每1 mL含槲皮素30 μg、山奈素30 μg、異鼠李素20 μg的混合溶液。

1.2.2.2 內(nèi)酯對(duì)照品溶液的制備：參照《中國(guó)藥典》2015版第一部銀杏葉萜類內(nèi)酯含量測(cè)定中對(duì)照品溶液制備方法，配制每1 mL含銀杏內(nèi)酯A 0.18 mg、銀杏內(nèi)酯B 0.08 mg、銀杏內(nèi)酯C 0.10 mg、白果內(nèi)酯0.20 mg的混合溶液。

1.2.2.3 銀杏酸對(duì)照品溶液的制備：取白果新酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取總銀杏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含20 μg的溶液，作為定位用對(duì)照溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

1.2.3.1 黃酮供試品溶液的制備：精密稱取樣品粉末約1 g，參照《中國(guó)藥典》2015版第一部銀杏葉總黃酮醇苷含量測(cè)定中供試品溶液制備方法，制備供試品。

1.2.3.2 內(nèi)酯供試品溶液的制備：取樣品粉末約1.5 g，參照《中國(guó)藥典》2015版第一部銀杏葉萜類內(nèi)酯含量測(cè)定中供試品溶液制備方法，制備供試品。

1.2.3.3 銀杏酸供試品溶液的制備：取樣品粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，超聲45 min，取出，冷卻，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，先用濾紙過濾，然后用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[10]。

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 黃酮測(cè)定方法：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，按公式：總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山奈素含量+異鼠李素含量)×2.51計(jì)算含量。

1.2.4.2 內(nèi)酯測(cè)定方法：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，按公式：總內(nèi)酯含量=白果內(nèi)酯含量+銀杏內(nèi)酯A含量+銀杏內(nèi)酯B含量+銀杏內(nèi)酯C含量計(jì)算。

1.2.4.3 銀杏酸測(cè)定方法：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各50 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以白果新酸對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算總銀杏酸含量。

2 結(jié)果與分析

將采集于5棵不同銀杏樹的銀杏葉、銀杏樹枝、白果及外種皮樣品分別按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備3份，按“1.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定其總黃酮、總內(nèi)酯和銀杏酸含量，計(jì)算平均值，結(jié)果見表2、表3、表4。

由表2可知，在雌、雄銀杏樹的不同部位黃酮含量有一定的差異，呈顯樹葉>樹枝、外種皮>果仁，其中雌樹樹葉的總黃酮含量最高，而黃酮含量最高的銀杏葉中，雌樹葉>雄樹葉，而在雌雄銀杏樹枝中黃酮含量差別不大。

表2 銀杏不同部位的黃酮含量(%)

表3 銀杏不同部位的內(nèi)酯含量(%)

由表3可知，在雌銀杏樹的不同部位，總內(nèi)酯含量樹葉>樹枝>外種皮>果仁；在雄樹的不同部位，樹葉內(nèi)酯含量高于樹枝。

由表4可知，在銀杏的不同部位都含銀杏酸，但含量差異較大。在雌樹的不同部位中，外種皮>>樹葉>樹枝>>果仁，外種皮的含量最高，達(dá)4.4%，果仁含量最低至0.0008%。在雄樹樹葉、樹枝銀杏酸含量均高于雌樹。

表4 銀杏不同部位銀杏酸含量(%)

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)銀杏不同部位的黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸含量進(jìn)行了分析和探討，結(jié)果表明葉中總黃酮和總內(nèi)酯含量均高于其他部位，是提取黃酮及內(nèi)酯活性成分的最佳藥用原料，同時(shí)對(duì)雌、雄樹銀杏葉進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，雌樹葉中黃酮含量高于雄樹葉，且銀杏酸含量低于雄樹葉；雌樹中不同部位的銀杏酸含量：外種皮>樹枝>樹葉>果仁，銀杏外種皮中銀杏酸含量高達(dá)4.4%，因此在采收季節(jié)應(yīng)做好防范措施，避免外種皮混入葉中從而使原料銀杏酸含量偏高，導(dǎo)致產(chǎn)品的銀杏酸含量超標(biāo)。有研究表明銀杏酸具有良好的殺蟲殺菌效果[11-13]，因此，白果外種皮是銀杏酸農(nóng)藥用提取最佳原料；果仁中三種成分含量都很低，但其含粗脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的食用價(jià)值[14]，但食用時(shí)應(yīng)高溫處理好，避免有毒成分銀杏酸食入而引起過敏等不良反應(yīng)；銀杏樹枝三種成分含量都較低，在實(shí)際生產(chǎn)中不宜作為原料。

高麗雅[15]等研究了銀杏不同部位黃酮類化合物含量的分布，李轉(zhuǎn)梅等[16]測(cè)定白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸，但對(duì)銀杏不同部位的黃酮、內(nèi)酯和銀杏酸三種成分含量都進(jìn)行了分析和探討的相關(guān)文獻(xiàn)極少，且本研究結(jié)果與吳爭(zhēng)榮[17]等采用高效液相法測(cè)定了雌雄銀杏不同部位黃酮含量結(jié)果中雄性銀杏均高于雌性銀杏的結(jié)果有差異。因此，本文研究了銀杏樹不同部位中黃酮、內(nèi)酯及銀杏酸含量的分布情況，為銀杏不同部位綜合開發(fā)利用提供更有效、更全面、有價(jià)值的參考。

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Analysis on the Content of Flavonoids, Terpene Lactones and Ginkgo Acid in Different Parts inGinkgoBiloba.

WUZhu1，2，WANGQiu-ping1，2，TIANMan-man1，2，WANGQian-yang2，HEJun2*

(1.CollegeofPharmacy,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China;2.ResearchCenterofBiochemistryEngineeringofGuizhouProvince,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

In order to analyse the content of flavonoids, terpene lactones and ginkgo acids in different parts of Ginkgo biloba, the content of these components were determined by the high performance liquid chromatography (HPLC). For female, the content of flavonoids and terpene lactones was higher in leaves than in other parts; and the content of ginkgo acid was higher in episperm than in other parts. For male, the content of flavonoids and terpene lactones was higher in leaves than in branches; and the content of ginkgo acid was higher in branches than in leaves. It is clear that different parts of female and those of male have different contents of flavonoids, terpene lactones and ginkgo acid. Therefore, different parts of Ginkgo biloba should be used rationally in order to accelerate the development of ginkgo industry.

Ginkgobiloba；flavonoids；terpene lactones；ginkgo acid；content analysis

2017-03-08；

2017-05-16

貴州省科技廳2008年省重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2007065)。

R284.1

A

1008-0457(2017)04-0072-04 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.013

*通訊作者：何珺(1974-)，女，副教授，主要研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取及檢測(cè)技術(shù)；E-mail：hejun1016@163.com。