受體因素對(duì)薩?？搜蝓r胚及杜泊羊凍胚移植效果的影響

肖 婷，王旭光，宋玉坤，，吐爾洪·阿木提，阿爾曼·海熱，圖爾迪艾合麥提·阿卜來(lái)提，劉國(guó)世，阿布力孜·吾斯曼

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100391；3.新疆阿克蘇市畜牧獸醫(yī)局，阿克蘇 843000）

受體因素對(duì)薩?？搜蝓r胚及杜泊羊凍胚移植效果的影響

肖 婷1，王旭光1，宋玉坤1，2，吐爾洪·阿木提3，阿爾曼·海熱1，圖爾迪艾合麥提·阿卜來(lái)提1，劉國(guó)世2，阿布力孜·吾斯曼1

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100391；3.新疆阿克蘇市畜牧獸醫(yī)局，阿克蘇 843000）

文章分析了新疆地區(qū)一次薩福克羊鮮胚及杜泊羊凍胚的移植實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，旨在討論受體因素對(duì)胚胎移植效果的影響。結(jié)果表明：受體羊在發(fā)情后7 d時(shí)移植胚胎，杜泊羊凍胚桑椹胚移植后產(chǎn)羔率顯著高于囊胚（P＜0.05）。薩?？搜蝓r胚移植時(shí)胚胎發(fā)育階段及移植數(shù)量對(duì)移植后產(chǎn)羔率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。受體母羊先前手術(shù)次數(shù)對(duì)薩?？搜蝓r胚移植后產(chǎn)羔率有顯著影響（P＜0.05），手術(shù)2次及以上次數(shù)的母羊產(chǎn)羔率極顯著低于初次胚胎移植的母羊（P＜0.01）。受體母羊卵巢黃體數(shù)超過1個(gè)后，黃體數(shù)對(duì)產(chǎn)羔率無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

受體；綿羊；胚胎移植；產(chǎn)羔率

鑒于國(guó)家取消棉花收購(gòu)價(jià)格補(bǔ)貼，新疆大面積的棉花種植轉(zhuǎn)向飼料及其他作物種植，很大程度上解決了新疆尤其是南疆優(yōu)質(zhì)飼草料來(lái)源問題，為集約化養(yǎng)羊提供了平臺(tái)。在這種大環(huán)境下，新疆的規(guī)?；B(yǎng)羊業(yè)再次升溫?，F(xiàn)在南疆地區(qū)，以家庭為主的小規(guī)模養(yǎng)羊正逐步推開，成為南疆農(nóng)民脫貧致富的重要抓手。舍飼養(yǎng)羊首先需要解決的是品種問題，和田羊、巴音布魯克羊、多浪羊等新疆地方品種有良好的環(huán)境耐受性，但產(chǎn)肉效率和繁殖效率相對(duì)不高、養(yǎng)殖利潤(rùn)空間不大，難以應(yīng)對(duì)目前規(guī)?；B(yǎng)殖的成本控制問題［1］。由此，發(fā)展繁殖力相對(duì)較高、產(chǎn)肉性能好、生長(zhǎng)發(fā)育快的肉羊品種是當(dāng)前比較理想的選擇。黑頭薩?？搜蚴窃a(chǎn)于英國(guó)、國(guó)際上公認(rèn)的優(yōu)秀肉羊品種［2］。上世紀(jì)70年代引入我國(guó)，新疆從90年代逐步開始增加養(yǎng)殖規(guī)模，目前在南北疆均有養(yǎng)殖，具有良好的地方適應(yīng)性，其產(chǎn)肉性能和良好的繁殖性能已經(jīng)被養(yǎng)殖人員所認(rèn)可［3］。黑頭杜泊羊［4］是原產(chǎn)于南非的優(yōu)秀肉羊品種，其毛短，抗熱，對(duì)新疆的干熱氣候有良好的適應(yīng)性，且產(chǎn)肉性能優(yōu)異，目前正逐步成為新疆養(yǎng)羊業(yè)的明星品種。本次胚胎移植工作，主要為阿克蘇當(dāng)?shù)佚堫^企業(yè)增加純種黑頭薩?？搜蚣昂陬^杜泊羊的數(shù)量，為進(jìn)一步擴(kuò)大純繁規(guī)模打下基礎(chǔ)。在此，采用回顧性分析方法，比較受體母羊體況等因素對(duì)胚胎移植效果的影響，為同行開展相關(guān)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 時(shí)間和地點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)于2016年9月在新疆阿克蘇地區(qū)某羊場(chǎng)進(jìn)行。

1.1.2 供體、受體情況 本實(shí)驗(yàn)所用的供體為該羊場(chǎng)之前由新西蘭進(jìn)口凍胚移植后所產(chǎn)的黑頭薩福克羊的純繁母羊，受體為新疆本地購(gòu)買的巴音布魯克母羊?yàn)橹鞯牡胤狡贩N羊。供體母羊嚴(yán)格按照種羊免疫程序進(jìn)行免疫接種、定期驅(qū)蟲，飼養(yǎng)管理得當(dāng)，膘情良好，發(fā)情周期正常。受體在購(gòu)入后進(jìn)行了驅(qū)蟲、布魯氏桿菌病檢疫、補(bǔ)飼等，在移植處理前膘情良好。

1.1.3 主要的藥品、試劑及設(shè)備 本實(shí)驗(yàn)所使用的藥品主要有：促卵泡素（FSH）、促黃體激素釋放激素（A3）和孕馬血清促性腺激素（PMSG）購(gòu)自三生藥業(yè)有限公司；羊用陰道栓（CIDR）、Holding培養(yǎng)液購(gòu)自新西蘭；0.5mol/L蔗糖液購(gòu)自美國(guó)ICP公司；沖胚液購(gòu)自卡蘇公司；生理鹽水、消毒劑、抗生素等自購(gòu)。設(shè)備主要有體視顯微鏡（OLYM PUSSZ-61日本）、羊用腹腔鏡（KARL STORZ德國(guó)）、恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 供體羊超數(shù)排卵及受體羊同期發(fā)情 供體羊超數(shù)排卵處理：供體母羊陰道埋置CIDR 9 d后，每只羊注射FSH 3mg，間隔12 h，分6次按注射量遞減方式肌肉注射，最后一次FSH注射時(shí)撤栓，撤栓后48h，參照張效生等［5］的方法進(jìn)行腹腔鏡輸精。輸精5.5 d后進(jìn)行沖胚操作。

受體同期發(fā)情處理：受體母羊陰道埋置CIDR 13 d后撤栓，每只羊PMSG 330 IU，撤栓后24 h試情，在發(fā)情7 d后進(jìn)行胚胎移植操作。

1.2.2 鮮胚的沖胚及凍胚的解凍方法 鮮胚沖胚操作：參照柴孟龍等［6］方法，供體母羊在授精后5.5 d進(jìn)行常規(guī)手術(shù)法沖胚。沖胚結(jié)束后，在體視顯微鏡下將胚胎撿出，鑒定發(fā)育階段并進(jìn)行質(zhì)量定級(jí)后，置于holding培養(yǎng)液中短暫保存后用于受體移植。

凍胚解凍操作：參考徐小波等［7］報(bào)道的方法進(jìn)行操作，室溫下，將存有胚胎的細(xì)管從液氮中取出，迅速置于25℃生理鹽水中水浴10 s，取出細(xì)管，剪掉封口，將細(xì)管內(nèi)的液體緩緩?fù)迫胙b有0.5mol/L蔗糖液的表面皿中，置于體視顯微鏡下?lián)斐雠咛?，胚胎?jīng)過兩次0.5mol/L蔗糖液平衡，脫去抗凍劑后，移入Holding液中用于受體移植。

1.2.3 受體胚胎移植 鮮胚、凍胚均采用腹腔鏡手術(shù)法移植。具體操作如下：受體母羊于術(shù)前12 h空腹；術(shù)前準(zhǔn)備將母羊仰臥位保定于手術(shù)架上，乳房基部剃毛、消毒，記錄受體母羊之前的手術(shù)次數(shù)。術(shù)時(shí)母羊采取后高前低仰臥術(shù)式，鋪好創(chuàng)巾后，用22號(hào)手術(shù)刀片在左右乳房基部，避開血管各做一個(gè)0.5～1.0 cm長(zhǎng)的切口，分別置入腹腔鏡和子宮鉗。術(shù)者通過腹腔鏡判斷左右兩側(cè)卵巢上黃體、卵泡情況、子宮等生殖器官黏連情況，確定黃體良好，可以移植時(shí)，用子宮鉗將待移植側(cè)子宮角牽拉至體外，在子宮角基部用穿刺針扎透子宮壁，用裝有胚胎的移植針將胚胎推入子宮角，將子宮角納入腹腔，并對(duì)腹壁創(chuàng)口縫合消毒，然后對(duì)母羊進(jìn)行長(zhǎng)效抗生素注射，預(yù)防術(shù)后感染。在手術(shù)過程中，同步做好移植記錄，用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 受體孕檢及接產(chǎn) 受體母羊于術(shù)后2個(gè)月使用B型超聲波儀進(jìn)行妊娠檢查，孕檢陽(yáng)性的單獨(dú)飼養(yǎng)管理至分娩。于產(chǎn)前10 d左右將待產(chǎn)母羊接入產(chǎn)房，并準(zhǔn)備助產(chǎn)藥品、器械等便于接產(chǎn)。接產(chǎn)后記錄母羊號(hào)、羔羊性別、品種等信息，用于系譜登記及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel2007軟件進(jìn)行整理，結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的胚胎發(fā)育階段及移植胚胎數(shù)對(duì)胚胎移植效果的影響

本次超排共計(jì)處理薩?？斯w母羊99只，由于母羊體況及排卵情況個(gè)體差異，沖胚后，胚胎主要以桑椹胚和早期囊胚為主，但其他發(fā)育階段的胚胎也有出現(xiàn)，移植時(shí)遵循A級(jí)胚胎移植單枚，B級(jí)胚胎移植雙枚的原則。移植受體母羊產(chǎn)羔情況如表1所示。結(jié)果顯示，移植兩枚囊胚的產(chǎn)羔率相對(duì)較高，達(dá)到56.5%，但與其他組相比，差異均不顯著（P＞0.05）。

表1 鮮胚的發(fā)育階段及移植枚數(shù)對(duì)產(chǎn)羔率的影響

本次實(shí)驗(yàn)也進(jìn)行了凍胚移植，移植原則同上，胚胎解凍后用于移植。鑒于凍胚在受體母羊體內(nèi)需要一個(gè)恢復(fù)的過程，實(shí)驗(yàn)中將凍胚移植給發(fā)情后6.5 d的受體母羊。移植及產(chǎn)羔情況如表2所示，結(jié)果顯示，移植2枚凍胚囊胚的產(chǎn)羔率顯著高于移植1枚凍胚囊胚的產(chǎn)羔率（P＜0.05）。移植2枚桑椹胚的產(chǎn)羔率極顯著高于其他各組（P＜0.01）。受到各組受體母羊數(shù)變化較大的影響，移植1枚擴(kuò)張囊胚組的產(chǎn)羔率與移植2枚囊胚組的產(chǎn)羔率差異顯著（P＜0.05）。

表2 凍胚的發(fā)育階段及移植枚數(shù)對(duì)產(chǎn)羔率的影響

2.2 受體母羊卵巢情況對(duì)胚胎移植效果的影響

由表3可以看出，在有1個(gè)黃體，對(duì)側(cè)有小卵泡的情況下，產(chǎn)羔率最好，但3組間差異均不顯著（P＞0.05）。從表4可以看出，雖然2個(gè)黃體的受體母羊產(chǎn)羔率高于1個(gè)黃體的母羊，但整體差異也不顯著（P＞0.05）。

表3 受體母羊卵巢情況對(duì)薩福克羊鮮胚移植的影響

表4 受體母羊卵巢情況對(duì)杜泊羊凍胚移植的影響

2.3 不同的術(shù)者對(duì)胚胎移植效果的影響

移植團(tuán)隊(duì)有兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的移植術(shù)者，從事移植工作10年以上，但來(lái)自不同的單位，在本次移植過程中，其他環(huán)節(jié)均條件一致，胚胎也是隨機(jī)配給，通過移植記錄統(tǒng)計(jì)兩位術(shù)者的移植產(chǎn)羔率發(fā)現(xiàn)，在黑薩?？搜蝓r胚移植的產(chǎn)羔率上，術(shù)者A移植的母羊產(chǎn)羔率高于術(shù)者B，而在杜泊羊凍胚移植的產(chǎn)羔率上，術(shù)者B移植的母羊產(chǎn)羔率高于術(shù)者A，但差異均不顯著（P＞0.05），說明兩人移植技術(shù)相當(dāng)，無(wú)明顯差別。

表5 不同的術(shù)者鮮胚、凍胚移植效果對(duì)比

2.4 受體母羊先前手術(shù)次數(shù)對(duì)胚胎移植效果的影響

受體母羊先前接受過手術(shù)，可能會(huì)造成器官黏連或生殖道炎癥等問題，影響受孕。本次移植過程中近一半受體羊先前接受過手術(shù)，作者等將先前的手術(shù)次數(shù)也作為一個(gè)指標(biāo)加以分析，結(jié)果如表6、表7所示。表6數(shù)據(jù)顯示，在薩?？搜蝓r胚移植上，受體母羊先前接受的手術(shù)次數(shù)越多，移植后產(chǎn)羔率越低。之前未接受過手術(shù)的母羊移植產(chǎn)羔率極顯著高于之前接受過2次及以上手術(shù)母羊的產(chǎn)羔率（P＜0.01），提示重復(fù)移植的受體母羊使用2次就應(yīng)更換他用，不宜再作為受體進(jìn)行移植。對(duì)于凍胚移植結(jié)果而言，之前手術(shù)過1次的母羊移植產(chǎn)羔率反而高于未手術(shù)過的母羊，但差異不顯著（P＞0.05）；手術(shù)過2次以上的母羊移植產(chǎn)羔率低于其他兩組，但差異也不顯著（P＞0.05）。

表6 受體母羊先前手術(shù)次數(shù)對(duì)薩?？搜蝓r胚移植效果的影響

表7 受體母羊先前手術(shù)次數(shù)對(duì)杜泊羊凍胚移植效果的影響

3 討論

3.1 胚胎發(fā)育階段和移植胚胎枚數(shù)對(duì)胚胎移植效果的影響

從薩?？搜蝓r胚移植的產(chǎn)羔率來(lái)看，移植囊胚的產(chǎn)羔率比移植桑椹胚高，移植2枚的比移植1枚的高。羅生金等［8］研究表明，供體、受體同時(shí)處理，移植6 d的薩?？搜蝓r胚后，移植桑椹胚的受體羊受孕率高于移植囊胚的受體羊。本實(shí)驗(yàn)使用的是6.5 d的薩?？搜蝓r胚，體內(nèi)胚胎的正常發(fā)育階段應(yīng)該在致密桑椹胚到早期囊胚之間，由此出現(xiàn)了移植囊胚的受體羊產(chǎn)羔率高于移植桑椹胚的情況，但差異不顯著（P＞0.05）。陳永昌等［9］研究也表明，胚胎發(fā)育階段及級(jí)別會(huì)直接影響杜泊羊冷凍胚胎的移植效率。從杜泊羊凍胚移植的產(chǎn)羔率來(lái)看，不論是桑椹胚還是囊胚，移植2枚的受體羊產(chǎn)羔率都高于移植1枚的。由于實(shí)際移植受體羊只數(shù)的限制，其他各組之間差異均不顯著（P＞0.05）。張國(guó)平等［10］的研究結(jié)果也表明，移植胚胎枚數(shù)越多，妊娠率越高。

3.2 受體母羊卵巢狀況及先前手術(shù)次數(shù)對(duì)胚胎移植效果的影響

卵巢上黃體和卵泡的交替發(fā)育維持著母羊的發(fā)情周期，卵泡產(chǎn)生雌二醇，誘導(dǎo)母羊發(fā)情并排卵；功能性黃體產(chǎn)生孕酮，是母羊維持妊娠的首要條件［11］。在功能性黃體分泌的孕酮處于較高水平時(shí)，對(duì)側(cè)卵巢可能會(huì)出現(xiàn)第一次卵泡波，產(chǎn)生小卵泡。通常，這些卵泡在高水平孕酮存在的條件下，很難形成優(yōu)勢(shì)卵泡，并迅速閉鎖，但在此過程中小卵泡分泌的少量雌激素可以進(jìn)一步增強(qiáng)孕酮的作用，進(jìn)而增強(qiáng)黃體維持妊娠的作用［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，卵巢上1個(gè)黃體1個(gè)卵泡的受體羊其移植產(chǎn)羔率高于1黃體或2黃體無(wú)卵泡的受體羊，可能的機(jī)制正是基于此。但因羊只數(shù)較少，無(wú)法形成顯著性差異。且本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，1個(gè)黃體和2個(gè)黃體受體母羊在產(chǎn)羔率上差異不顯著（P＞0.05），說明受體羊只要能保證卵巢上有1個(gè)功能性黃體就能維持妊娠，這與張金龍等［13］的研究結(jié)果一致。王素梅等［14］也研究證實(shí)，受體羊的卵巢上的黃體并非越大、越多，妊娠率就越高。盡管丁建平等［15］的研究結(jié)果也表明，在山羊胚胎移植時(shí)，手術(shù)次數(shù)和受體羊重復(fù)使用對(duì)胚胎移植效果影響不顯著（P＞0.05），但是該實(shí)驗(yàn)中符合移植條件的受體母羊數(shù)逐年減少，由此判斷，其受體羊的利用率應(yīng)該下降了，手術(shù)次數(shù)還是會(huì)影響受體母羊的使用率。

3.3 移植技術(shù)對(duì)比

羊的胚胎移植技術(shù)是一個(gè)協(xié)作性很強(qiáng)的技術(shù)工作，需要兩人以上的團(tuán)隊(duì)才能完成，移植術(shù)者是一個(gè)必需的崗位。術(shù)者移植技術(shù)熟練程度對(duì)妊娠率也有顯著影響［7］。本次移植實(shí)驗(yàn)因?yàn)橐浦惨?guī)模的需要，團(tuán)隊(duì)兩位移植者均有10年以上的移植經(jīng)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，兩人在移植后受體產(chǎn)羔率上沒有差異。這也說明，系統(tǒng)訓(xùn)練可以提高移植水平。盡管本實(shí)驗(yàn)采取了類似的超排方案，但是與張璐等［16］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，產(chǎn)羔率還是相差較大，有待于進(jìn)一步改進(jìn)母羊的飼養(yǎng)管理及胚胎移植技術(shù)措施。近年來(lái)，對(duì)羊早期胚胎妊娠規(guī)律的進(jìn)一步明確，精確使用超排藥物、降低母羊應(yīng)激水平［17］，可能會(huì)進(jìn)一步提高胚胎移植效率，增加移植后代數(shù)量。

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Effectsof Recipient Factorson Fresh Suffo lk Em bryosand Frozen-thaw ed Dorper Em bryos Transfer

Xiao Ting，Wang Xuguang，Abulizi·Wusiman，etal
（CollegeofAnimalScience，Xinjiang AgriculturalUniversity，Urumqi830052，China）

In this paper，the data ofan experimenton fresh Suffolk and frozen Dorper embryos transfer in Xinjiangwere analyzed retrospectively，and theeffectof recipient factorson embryos transferwas discussed.The results demonstrated thatwhen embryos were transferred to the recipienteweson the7 th day afterestrus，the lambing rate of frozen Dorperembryoswhichwere inmorula stage was significantly higher than those in blastocyst stage after transfer.Under this experimental condition，there was no significanteffecton the lambing ratebetween thedifferentgroupsdivided by thedevelopmentalstageor thequantityof fresh Suffolk embryo transferred.Thenumberofprevioussurgicaloperationsof the recipientsheep had significanteffectson the lambing rateof fresh Suffolk embryos transferred，and the lambing rate of the recipients which had surgical operations more than once was significantly lower than thosewhich had nooperation experience.When the corpus luteum in theovariesof the recipientswasabove one，thenumberofovarian corpus luteahad nosignificanteffectson the lambing rate.

recipient；sheep；embryo transfer；lambing rate

S826.3

A

2095-3887（2017）04-0012-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.04.004

2017-04-17

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)-新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目（2015TC050）；新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目（2016E02037）

肖婷（1986-），女，碩士研究生。

阿布力孜·吾斯曼(1968-)，男，教授，博士，主要從事動(dòng)物繁殖與胚胎生物技術(shù)的研究。