新疆蕪菁小孢子培養(yǎng)成胚影響因素研究

軒正英++馬國財(cái)

摘要：以8個(gè)新疆蕪菁（Brassica rapa L.）品種為試材，對影響小孢子培養(yǎng)中胚胎發(fā)育的影響因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，不同基因型間小孢子胚胎發(fā)生能力差異很大，在接種的8個(gè)基因型中，有4個(gè)誘導(dǎo)出胚，誘導(dǎo)成功率50%，其中W4出胚率最高，達(dá)到73胚/30蕾。NLN-13培養(yǎng)基中添加激素能明顯促進(jìn)胚狀體的發(fā)生；低溫預(yù)處理也能提高小孢子產(chǎn)胚率，最適宜的時(shí)間為24 h。

關(guān)鍵詞：新疆蕪菁（Brassica rapa L.）；小孢子培養(yǎng)；出胚率

中圖分類號：S631.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）13-2540-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.036

Studies on Factors Influencing Embryogenesis of Isolated Microspores of

Xinjiang Turnips

XUAN Zheng-ying1， MA Guo-cai2

（1. Colldge of Plant Science，Tarim Univercity，Alar 843300，Xinjiang，China；

2. Analytic & Test Center， Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China）

Abstract： In order to optimize microspore culture techniques of Brassica rapa L. and improve the embryo induction rate， the influence factors to microspore embryogenesis of Brassica rapa L. were studied through eight genotypes. Results showed that there was significant difference in embryogenesis ability among different genotypes. Among them， four genotypes yielded embryos successfully， which the rate reached 50%. Genotype W4 was an ideal material for embryoid induction， and the frequency reached 73 embryos per 30 buds. NAdding phytohormone 6-BA and NAA in NLN-13 medium can improve the embryoid induction，4 ℃ pretreatment of bud for 24 h can significantly improve the production rate of microspore embryogenesis.

Key words： Xinjiang turnip（Brassica rapa L.）；culture of pollen；rate of embryo formation

蕓薹屬蔬菜屬于異花授粉作物，其雜種優(yōu)勢明顯。近年來，常規(guī)育種的不足在實(shí)際工作中日漸明顯，目前小孢子培養(yǎng)技術(shù)由于培養(yǎng)方法日趨完善，培養(yǎng)效率逐年提高，使其開始被廣泛應(yīng)用于常規(guī)雜交育種，逐漸成為作物改良和新品種培育工作的一個(gè)重要手段。蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)始于1982年，Lichter[1]首次報(bào)道在甘藍(lán)型油菜上成功地用游離小孢子培養(yǎng)方法得到了胚狀體，目前小孢子培養(yǎng)已在大部分蕓薹屬作物中獲得成功[2-7]。關(guān)于新疆蕪菁游離小孢子培養(yǎng)方面鮮見報(bào)道，喬麗桃[7]對新疆本土栽培蕪菁品種進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，并誘導(dǎo)形成小孢子胚和再生植株。

蕪菁（Brassica rapa L.，2n=20）含有蕓薹屬中最難進(jìn)行離體再生的AA基因組，離體條件下小孢子發(fā)育具有不同步性和多種發(fā)育途徑并存，又是再生困難的根部膨大類作物，游離小孢子培養(yǎng)離體再生尤為困難，這嚴(yán)重影響了小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕪菁育種上的應(yīng)用。本試驗(yàn)針對新疆蕪菁花粉游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系中幾個(gè)有利于誘導(dǎo)出胚的因素，探討新疆蕪菁游離小孢子培養(yǎng)形成胚狀體以及有利于提高出胚率的方法，旨在建立高效、穩(wěn)定的新疆蕪菁游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，也為新疆蕪菁新種質(zhì)資源的發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料詳情見表1、圖1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試材準(zhǔn)備 材料于2016年1月9日播種于日光溫室進(jìn)行自然春化處理，3月9日蕪著小苗在溫室外繼續(xù)低溫春化，3月27日定植于塔里木大學(xué)園藝試驗(yàn)站試驗(yàn)田，4月中旬開花。采用常規(guī)田間管理措施培養(yǎng)母株。

1.2.2 游離小孢子培養(yǎng) 蕪菁植株現(xiàn)蕾后，于每天9：00～11：00摘取健壯植株的花序，參考徐艷輝等[8]方法進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

1.2.3 基因型對小孢子胚胎發(fā)生的影響 8種試材嚴(yán)格挑選長2.00～2.49 mm處于單核靠邊期的花蕾，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)[9]。

1.2.4 培養(yǎng)基激素成分對小孢子胚誘導(dǎo)的影響 以W4和W8為試驗(yàn)材料，在NLN-13液體培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA、NAA 2種激素進(jìn)行比較試驗(yàn)（表2），共7組處理，觀察誘導(dǎo)其成胚的情況，計(jì)算出胚率。

出胚率=出胚數(shù)/花蕾總數(shù)

1.2.5 低溫預(yù)處理對胚狀體誘導(dǎo)率的影響 選用新疆蕪菁品種W4、W8為試材，將采集的花蕾置于0～4 ℃冰箱中低溫處理0（CK）、24、48、72 h后，按上述游離小孢子培養(yǎng)方法培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，并置于33 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)1 d后，再轉(zhuǎn)放在25 ℃下靜置黑暗培養(yǎng)，研究4 ℃低溫預(yù)處理時(shí)間對小孢子出胚率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆蕪菁小孢子胚狀體類型

供試材料分離的小孢子在NLN-13培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)高溫?zé)峒まD(zhuǎn)入25 ℃暗培養(yǎng)，7 d左右有肉眼可見的白色細(xì)小顆粒，后逐漸形成球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉形胚及畸形胚，如圖2所示。觀察發(fā)現(xiàn)，蕪菁胚狀體發(fā)育存在極大的不同步現(xiàn)象，且畸形胚比例偏高，子葉型胚比例偏低，萌發(fā)胚極少出現(xiàn)。

2.2 基因型對蕪菁游離小孢子出胚率的影響

不同基因型的蕪菁小孢子胚胎發(fā)生能力差異很大。供試材料包含白皮、綠白皮和紅皮多種類型， 由表3可以看出，8個(gè)蕪菁品種有4個(gè)得到了胚狀體，成功率達(dá)50%。蕪菁W4出胚數(shù)最高為73胚/30蕾，其次為W8和W1， 出胚數(shù)分別為58胚/30蕾和41胚/30蕾，最低為W5，出胚數(shù)為24胚/30蕾，其余4個(gè)基因型則無胚狀體產(chǎn)生。

2.3 低溫預(yù)處理對蕪菁游離小孢子出胚率的影響

以胚產(chǎn)量高的W4和W8為試材，對采集到的花蕾進(jìn)行0～4 ℃的低溫處理，結(jié)果（表4）表明，低溫預(yù)處理后小孢子出胚率差異很大，低溫處理24 h的小孢子出胚率最高，平均出胚率為2.18 胚/蕾，高出對照2.05，而經(jīng)48、72 h低溫處理的出胚效果較差，平均出胚率分別為1.18胚/蕾和0.20胚/蕾，出胚率均高于對照。由此表明，花蕾低溫處理能使其小孢子培養(yǎng)胚產(chǎn)量增加；也說明適宜的低溫預(yù)處理，即24 h可以大大提高蕪菁小孢子培養(yǎng)的出胚率，但隨著低溫處理時(shí)間的延長，反而會降低其出胚率。

2.4 外源激素對蕪菁游離小孢子出胚率的影響

通過對供試W4、W8材料在NLN-13液體培養(yǎng)基中添加不同濃度外源激素6-BA與NAA，進(jìn)行小孢子誘導(dǎo)胚狀體培養(yǎng)。結(jié)果（表5）表明，培養(yǎng)基中添加外源激素能顯著提高胚狀體的產(chǎn)量，7種激素濃度配比中2個(gè)試材的平均出胚率分別為0、0.30、1.62、1.72、0.52、0.53、0.08胚/蕾。處理1和7、處理3和4、處理5和6的平均出胚率在P<0.05和P<0.01水平上沒有顯著差異。就供試材料而言，不同材料對激素的需求也有差異，W4以單獨(dú)添加0.05 mg/L NAA的出胚率最高為2.43胚/蕾；W8以添加0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA最高，為1.93胚/蕾。

3 討論

供體材料的基因型是小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，不同基因型、不同作物的變種以及同一變種之間不同基因型的供體植株，在統(tǒng)一的試驗(yàn)條件下，游離小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)率有很大差異。軒正英等[10]對7個(gè)大白菜材料進(jìn)行試驗(yàn)，有6個(gè)獲得了胚狀體，成功率達(dá)85.71%。喬麗桃[7]通過4份蕪菁材料對游離小孢子培養(yǎng)進(jìn)行了初步研究，僅有1份材料得到胚狀體。本試驗(yàn)以8個(gè)新疆蕪菁特異品種為試材進(jìn)行花粉游離小孢子培養(yǎng)，只有4個(gè)供試材料誘導(dǎo)出胚。材料W4出胚率最高為2.43胚/蕾；W5最低，出胚率僅為0.80胚/蕾。相對于白菜、甘藍(lán)型油菜等作物，蕪菁的胚誘導(dǎo)率很低，這也說明蕪菁是十字花科作物中難誘導(dǎo)的種類。筆者研究發(fā)現(xiàn)，挑選單核靠邊期花蕾，不同材料之間合適的花蕾大小差異較大，且受環(huán)境條件影響變動也較大，因此單純通過花蕾大小來判斷單核靠邊期花蕾誤差較大。

前人對游離小孢子培養(yǎng)中低溫預(yù)處理的研究有不同觀點(diǎn)，有研究者認(rèn)為0～4 ℃低溫預(yù)處理使花藥不對稱的有絲分裂進(jìn)行對稱分裂[11]，也有研究者認(rèn)為低溫處理只是對材料進(jìn)行短暫保存，對胚狀體的發(fā)生無明顯作用[12]。本研究結(jié)果表明，對新疆蕪菁花蕾進(jìn)行0～4 ℃低溫預(yù)處理能有效提高花粉小孢子胚狀體發(fā)生頻率，但低溫處理時(shí)間不可過長，處理24 h為最佳時(shí)間，有效提高了出胚率，這一結(jié)果與Sato等[13]關(guān)于冷擊預(yù)處理花蕾能提高小孢子胚發(fā)生頻率的結(jié)果相符。

培養(yǎng)基中添加的激素成分、激素用量以及激素的配比等，對誘發(fā)小孢子啟動以及細(xì)胞生長分裂起到重要作用。徐艷輝等[8]通過對大白菜小孢子培養(yǎng)胚狀體發(fā)生的研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mg/L 6-BA對小孢子胚狀體的發(fā)生有一定的促進(jìn)作用。李巖等[14]研究表明在小白菜培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中添加少量激素（NAA 0.5 mg/L、BA 0.05 mg/L）有利于小白菜游離小孢子的胚胎發(fā)生，其胚產(chǎn)量明顯高于不加外源生長物質(zhì)的對照。桑玉芳[15]在對甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，外源激素對小孢子成胚具有重要作用，但不同基因型材料對激素作用的表現(xiàn)不同。本試驗(yàn)通過不添加外源激素的培養(yǎng)基與添加了不同濃度配比的6-BA與NAA的NLN-13培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果表明，添加激素可以顯著提高蕪菁小孢子培養(yǎng)的出胚率，且不同材料對激素的需求也有差異，W4以單獨(dú)添加0.05 mg/L NAA的出胚率最高，為2.43胚/蕾；W8以添加0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA最高，為1.93胚/蕾。這一結(jié)果與前人研究結(jié)果不盡相同，究其原因可能與新疆蕪菁品種資源的遺傳多樣性和變異有關(guān)。

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