乳酸菌凍干工藝的設(shè)計(jì)

李玲　趙耀　曹珂珂

摘 要：目的：以乳酸菌為研究對(duì)象，研究設(shè)計(jì)其凍干工藝。方法：采用響應(yīng)面法優(yōu)化篩選出真空冷凍干燥的保護(hù)劑配方。結(jié)果：?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)結(jié)果表明脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖3種保護(hù)劑保護(hù)效果較好，以細(xì)胞存活率為響應(yīng)值，篩選出最佳復(fù)合保護(hù)劑為脫脂乳9.51%，麥芽糊精7.77%，葡萄糖7.56%。結(jié)論：通過(guò)試驗(yàn)測(cè)得凍干后的存活率可達(dá)到90.08%，與預(yù)測(cè)值90.8303%接近。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；真空冷凍干燥；保護(hù)劑；存活率

中圖分類(lèi)號(hào) Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）14-0043-03

Abstract：Objective：The research aimed to study the freeze-drying process of lactic acid bacteria. Method：The response surface method was used to optimize the protective agent for vacuum freeze - drying.Result：The results of single factor experiments showed that the protective effect of defatted milk， maltodextrin and glucose was better， and the best survival rate was 9.51%，maltodextrin was 7.77%，7.56% glucose.Conclusion：The survival rate of the freeze-dried method was 90.08%， which was close to the predicted value of 90.8303%.

Key words：Lactic Acid Bacteria；Freeze-drying；Protectant；Survival rate

近年來(lái)，由于微生物學(xué)的迅速發(fā)展，乳酸菌得到了廣泛的研究和開(kāi)發(fā)，它對(duì)機(jī)體多方面的保健功能逐漸得到了人們的重視[1]。目前，乳酸菌在乳制品的生產(chǎn)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，它可作為發(fā)酵劑用于酸奶、大豆酸奶、乳飲料等乳制品的生產(chǎn)。乳酸菌凍干粉的制備通常采用真空冷凍干燥技術(shù)，而在冷凍干燥過(guò)程中，對(duì)菌體的損傷是不可避免的，所以添加適宜的保護(hù)劑提高菌種的存活率對(duì)乳制品工藝生產(chǎn)具有十分重要的意義[2]。為此，本研究選取5種保護(hù)效果較好的凍干保護(hù)劑作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)選擇3種效果較好的凍干保護(hù)劑，然后采用 Design-Expert8.0.6軟件的中響應(yīng)面試驗(yàn)建立數(shù)學(xué)模型確定最佳凍干保護(hù)劑配方[3-6]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 菌種 乳球菌屬（Lactococcus）C1菌株，由同組實(shí)驗(yàn)同學(xué)從酸奶、泡菜中分離而得，并保存在實(shí)驗(yàn)室冰箱供使用。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基（用于菌種的傳代、擴(kuò)培和種子液制備）、MRS固體培養(yǎng)基（用于菌落計(jì)數(shù)），均由上海星科生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要藥品 葡萄糖、谷氨酸鈉、維生素C、麥芽糊精、脫脂乳。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 BHC-1300IIA/B2-生物潔凈安全柜、DY04-12-44-00-立式壓力蒸汽滅菌器筒、YPB1003-電子天平、JW-3021H-High Speed Centrifuge、CVC FD8-5-冷凍干燥機(jī)、BC-50S-冰箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程 菌種活化→制備菌液→離心收集菌體（稱(chēng)重）→加入保護(hù)劑溶液→計(jì)活菌數(shù)（cfu/mL）→分裝→冰箱預(yù)凍（24h）→真空冷凍干燥→復(fù)水→計(jì)活菌數(shù)（cfu/mL）→計(jì)算存活率[7]。

1.2.2 菌種活化 取出冰箱里面冷藏的乳酸球菌，以3%的接種量接到100mLMRS液體培養(yǎng)基（滅菌）做第一次活化，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24h后，吸取300μL涂平板檢測(cè)菌種的純度并記錄下活菌數(shù)，然后進(jìn)行第二次活化。

1.2.3 活菌測(cè)定 以MRS固體培養(yǎng)基為計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，采用梯度稀釋平板法計(jì)數(shù)[8]測(cè)活菌數(shù)。

1.2.4 菌體制備 通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)確定最佳離心條件（4℃，6000r/min，15min）[9]。取8個(gè)50mL的無(wú)菌離心管，等量移入40mL菌液，在最佳離心條件下進(jìn)行平衡離心。離心完畢后，取沉淀，用與上述菌液等體積的無(wú)菌生理鹽水（用于洗滌菌體）溶解沉淀菌體，進(jìn)行第二次離心，最終得到乳酸菌泥。

1.2.5 真空冷凍干燥 將平皿先放入4℃冰箱平衡30min，然后放置-40℃冰箱中進(jìn)行預(yù)冷凍20h。冷凍完成后放入真空冷凍干燥機(jī)中，設(shè)置溫度-50℃，抽真空（20～40Pa），干燥24h。

1.2.6 存活率的測(cè)定 將充分干燥成粉末的菌體取出后自然解凍，加入13.3mL滅菌的生理鹽水復(fù)水30min，用微量移液器吸取與凍干前等量的1mL菌液進(jìn)行稀釋涂板計(jì)數(shù)。測(cè)定凍干前后的活菌數(shù)目，得出3組平行實(shí)驗(yàn)的平均值，最終計(jì)算求得保護(hù)劑的冷凍存活率[10]。計(jì)算公式為：存活率（%）=復(fù)水凍干后的活菌數(shù)/樣品凍干后的活菌數(shù)×100

1.2.7 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)確定3種對(duì)乳酸菌保護(hù)效果較好的保護(hù)劑，然后采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，最終確定最佳復(fù)合保護(hù)劑，并進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素保護(hù)劑的結(jié)果與分析 根據(jù)保護(hù)劑對(duì)菌體冷凍干燥的保護(hù)機(jī)理，結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11-13]，選取脫脂乳、麥芽糊精、葡萄糖、維生素C、谷氨酸鈉作為單因素保護(hù)劑，以存活率為目標(biāo)，研究它們對(duì)乳酸菌的凍干保護(hù)效果，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選取最優(yōu)的保護(hù)劑濃度列表，結(jié)果如表1所示。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖這3種保護(hù)劑對(duì)菌體保護(hù)效果較好，其中脫脂乳作為保護(hù)劑的影響最顯著，其次是麥芽糊精與葡萄糖，其他保護(hù)劑保護(hù)效果并不是很理想。因此選取脫脂乳、麥芽糊精和葡萄糖為優(yōu)化因子，然后根據(jù)結(jié)果確定它們各自的添加量，進(jìn)行復(fù)合保護(hù)劑的優(yōu)化。

2.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因子與水平 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，表2為試驗(yàn)因素與水平編碼表。

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 詳見(jiàn)表3。

2.2.3 回歸模型與方差分析 對(duì)表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，編碼值A(chǔ)、B、C分別代表葡萄糖、脫脂乳和麥芽糊精，方差分析數(shù)據(jù)如表4所示。

2.00AB-2.70AC+1.82BC-1.38A2-3.71B2-4.86C2。

由表4可知，回歸方程失擬項(xiàng)顯示不顯著（P=0.0881）且大于0.05，無(wú)失擬數(shù)據(jù)存在，實(shí)驗(yàn)與模型擬合效果較好，說(shuō)明此次的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值誤差小。模型中F=28.12、P<0.0001、R2=0.9731、R2adj=0.9385，表明模型是較顯著的，有很好的實(shí)驗(yàn)意義。從表4可知，只有C2的P值小于0.001，表示C2影響最為顯著，A2、B2的P值均小于0.05說(shuō)明A2、B2對(duì)存活率也有顯著影響。一次項(xiàng)B的P值=0.001小于0.05，而A、C項(xiàng)的P值均大于0.05，所以葡萄糖和麥芽糊精對(duì)存活率沒(méi)有顯著影響。交互項(xiàng)的P值均小于0.05，所以葡萄糖與脫脂乳、葡萄糖與麥芽糊精、脫脂乳與麥芽糊精對(duì)響應(yīng)值的交互影響都顯[14]。

2.2.4 響應(yīng)曲面圖及等高線圖的分析 圖1～3為Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)得出等高線圖和其對(duì)應(yīng)的3D圖，從圖中能夠直觀地看出葡萄糖、脫脂乳、麥芽糊精對(duì)存活率的影響程度和它們兩兩之間的交互作用。在等高線圖中，橢圓型或馬鞍型的高線表示顯著，而圓型的等高線表示較不顯著[15]。

由圖1可見(jiàn)，等高線呈橢圓形，表明葡萄糖和脫脂乳交互影響顯著。當(dāng)麥芽糊精濃度為7.5%時(shí)，脫脂乳濃度范圍在7.5%～9.51%，葡萄糖濃度范圍在6%～7.56%時(shí)，凍干粉的存活率一直在增長(zhǎng)，達(dá)到峰值后，增長(zhǎng)趨勢(shì)越來(lái)越緩慢。當(dāng)脫脂乳濃度為9.51%時(shí)，葡萄糖濃度為7.56%時(shí)，響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)。

由圖2可見(jiàn)，等高線也呈橢圓形，說(shuō)明麥芽糊精與葡萄糖交互作用也顯著，當(dāng)脫脂乳濃度為11.5%時(shí)，麥芽糊精濃度范圍5.5%～7.77%，葡萄糖濃度范圍在6%～7.56%時(shí)，凍干粉的存活率一直在增長(zhǎng)，達(dá)到峰值后，增長(zhǎng)趨勢(shì)越來(lái)越緩慢。當(dāng)麥芽糊精濃度為7.77%時(shí)，葡萄糖濃度為7.56%時(shí)，此時(shí)的存活率達(dá)到最大。

由圖3顯示，等高線呈橢圓形并不明顯，說(shuō)明脫脂乳與麥芽糊精交互作用相比上述因素之間較不顯著，當(dāng)葡萄糖濃度為9%時(shí)，脫脂乳濃度范圍在7.5%～9.51%時(shí)，麥芽糊精濃度范圍在5.5%～7.77%，響應(yīng)值一直在提高，達(dá)到峰值后，增長(zhǎng)趨勢(shì)越來(lái)越緩慢。當(dāng)麥芽糊精濃度為7.77%時(shí)，葡萄糖濃度為7.56%時(shí)，此時(shí)的存活率達(dá)到最大。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件計(jì)算得到，當(dāng)葡萄糖濃度為7.56%、脫脂乳濃度為9.51%、麥芽糊精濃度為7.77%時(shí)，存活率達(dá)到預(yù)測(cè)最大值為90.8303% 在此條件下平行實(shí)驗(yàn)3次，求得平均值為90.08%，相對(duì)誤差為0.83%，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值有稍許差異，表明響應(yīng)面法得到的數(shù)學(xué)模型基本可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)找出了脫脂乳、葡萄糖、麥芽糊精3個(gè)單因素作為優(yōu)化因子，然后結(jié)合響應(yīng)面法，找出存活率達(dá)到最高時(shí)的最佳復(fù)配保護(hù)劑為：當(dāng)葡萄糖濃度為7.56%、脫脂乳濃度為9.51%、麥芽糊精濃度為7.77%，在此條件下預(yù)測(cè)值為90.8303%。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，得出的存活率為90.08%。相對(duì)誤差值為0.83%，復(fù)配保護(hù)劑的存活率90.08%與不加保護(hù)劑時(shí)相比有非常明顯提高。

參考文獻(xiàn)

[1]張建友.凍干乳酸菌菌種的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[2]雷欣宇.乳酸菌活性干燥劑制備工藝研究[D].重慶：西南大學(xué)，2013.

[3]韓德權(quán)，楊麗娟，孫慶甲，等.響應(yīng)面優(yōu)化植物乳桿菌凍干保護(hù)劑[J].食品科學(xué)，2010，3（105）：219-223.

[4]王世寬，洪玉程，袁先鈴.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌凍干保護(hù)劑的研究[J].四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，26（5）：23-26.

[5]秦鵬，謝鵬，梁宏基，等.響應(yīng)面優(yōu)化羅伊化乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑的配比[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（5）：6-7.

[6]楊聳月，李燦，王家林，劉全蘭.乳酸菌菌劑中保護(hù)劑的種類(lèi)和其保護(hù)機(jī)制[J].飼料研究，2016（01）：8-10.

[7]張英華，霍貴成，郭鸰.乳酸菌冷凍干燥保護(hù)劑的篩選[J].食品科技，2006（11）：72-75.

[8]朱東升.乳酸菌凍干?；铌P(guān)鍵技術(shù)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[9]陳賀佳.高產(chǎn)胞外多糖嗜熱鏈球菌凍干發(fā)酵劑研究[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2012.

[10]丁春杰，肖更生，陳衛(wèi)東，等.黑曲霉菌絲真空冷凍干燥的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：745-747.

[11]王琳.干酪乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑篩選及作用研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2011.

[12]董英，林澤蓉，周?chē)?guó)磊，等.泡菜乳酸菌凍干保護(hù)劑的研究[J].食品工業(yè)，2007（1）：10-12.

[13]胡榴榴.干酪乳桿菌高密度培養(yǎng)及干燥工藝的研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[14]李家鵬，張學(xué)剛，喬曉玲，等.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌冷凍干燥保護(hù)劑配方的研究[J].食品科學(xué)，2008，（06）：146-150.

[15]許娜，劉青梅，楊性民. 響應(yīng)面法優(yōu)化鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑配方的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，（01）：207-210.

[16]Sergio P.， María Claudia Otero， María Elena Fatima Nader-Macías. Survival and beneficial properties of lactic acid bacteria from raniculture subjected to freeze- drying and storage[J].Journal of Applied Microbiology，2013（116）：157-166.

（責(zé)編：張宏民）