藥用植物研究中的分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

陳紅波++余金芮++楊春先++錢剛

摘要：通過對(duì)近年來常用分子標(biāo)記技術(shù)的原理、技術(shù)特點(diǎn)及其在藥用植物研究領(lǐng)域中應(yīng)用現(xiàn)狀的總結(jié)，以期為藥用植物資源開發(fā)與評(píng)價(jià)提供參考，也進(jìn)一步為藥用植物功能基因的篩選和驗(yàn)證提供思路。

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記；藥用植物；簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）；擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）；單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)（SNPs）

中圖分類號(hào)：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）13-2401-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.001

Progress and Application of Molecular Marker Technology in Medicinal Plants

CHEN Hong-boa， YU Jin-ruib， YANG Chun-xianb， QIAN Ganga

（a.Department of Cell Biology and Genetics； b.School of Dentistry， Zunyi Medical College， Zunyi 563003， Guizhou， China）

Abstract： By summarizing the principle and technical characteristics of the commonly used molecular marker technology in recent years and its application in the field of medicinal plant research，this paper provides a reference for the development and evaluation of medicinal plant resources， and further provides ideas for the screening and verification of functional gene of medicinal plants.

Key words： molecular marker； medicinal plants； simple sequence repeat（SSR）； amplified fragment length polymorphisms（AFLP）； single nucleotide polymorphisms（SNPs）

中國是野生中藥材資源最為豐富的國家，目前已識(shí)別有11 000多種，無論其種類或數(shù)量均列世界之首[1]，為中國中藥文化產(chǎn)業(yè)的國際化創(chuàng)造了豐富的資源條件。但近年來，隨著人們對(duì)養(yǎng)生、保健等意識(shí)的不斷提高，導(dǎo)致中藥材的市場(chǎng)需求極度擴(kuò)增，一些以野生種質(zhì)消耗為主的名貴中藥材正面臨瀕危甚至滅絕。傳統(tǒng)的研究利用方法在藥用植物識(shí)別、開發(fā)、利用以及保護(hù)等方面都相對(duì)落后。然而近些年，以RFLP[2]為代表的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的興起，為實(shí)現(xiàn)當(dāng)代藥用植物研究的現(xiàn)代化提供了現(xiàn)實(shí)手段與條件。分子標(biāo)記技術(shù)（亦或分子鑒別技術(shù)或DNA分子標(biāo)記技術(shù)）[3，4]，是一種基于遺傳物質(zhì)的研究方式，這使其具備了不受生長環(huán)境的影響、檢驗(yàn)精度高及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷運(yùn)用與革新，以分子雜交為基礎(chǔ)的第一代標(biāo)記技術(shù)，由于操作過程復(fù)雜、周期長等原因，正逐漸退出分子研究領(lǐng)域。而圍繞PCR技術(shù)為核心的新型分子標(biāo)記技術(shù)正廣為使用，并日臻成熟。

1 常用分子標(biāo)記技術(shù)的原理及特點(diǎn)

1.1 簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）

SSR亦稱為微衛(wèi)星DNA，它由2-5個(gè)堿基組成，如（GA）n、（TG）n、（GAC）n等，其中最常見為二核苷酸重復(fù)形式。SSR序列的長度在不同基因組間由于重復(fù)次數(shù)以及程度的不同具有高度的變異性，而展現(xiàn)出較高的多態(tài)性。SSR標(biāo)記原理是根據(jù)其兩端的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，再利用變性或者非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，繼而體現(xiàn)不同樣本基因組DNA的多態(tài)性。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列具有較多優(yōu)點(diǎn)，其共顯性可區(qū)分純合型與雜合型，以及還有靈敏度高、穩(wěn)定性好以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。但目前SSR獲得的方式參差不齊，前提都是要提前知道目的基因的序列信息。

1.1.1 簡(jiǎn)單重復(fù)區(qū)間序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR） ISSR是Zietkiewicz等[5]于1994年發(fā)展起來的一種加錨SSR技術(shù)。它的原理是在SSR引物的5′或3′端錨定2個(gè)或以上的SSR堿基，引起特定位點(diǎn)退火，從而提高擴(kuò)增專一性，得到的特異性片段再通過變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，最后根據(jù)不同的多態(tài)性條帶分析多態(tài)性。

其優(yōu)點(diǎn)在于無需提前知道樣品基因序列，ISSR可為研究者快速高效地提供基因組信息；引物序列相對(duì)較長，通過提高退火溫度進(jìn)而保證了結(jié)果的可靠性；樣本DNA質(zhì)量要求不高，且所需量少；引物的通用性廣，不具種屬特異性。但在實(shí)際應(yīng)用中也存在一定缺陷，如：穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系條件需要探索構(gòu)建，且顯性標(biāo)記亦不能區(qū)分純合型和雜合型。

1.1.2 表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags，ESTs） 表達(dá)序列標(biāo)簽是基于EST數(shù)據(jù)庫或cDNA文庫的一種標(biāo)記技術(shù)，是一種能快速、高效地揭示基因容量的標(biāo)記方法，由1989年Venter首次提出。它能特異地展示出基因某一位點(diǎn)的表達(dá)情況，能夠直接反映出功能基因的生物信息[6]，同時(shí)也為地道藥用植物的鑒別、開發(fā)利用提供了新的候選基因。因此，基于ESTs開發(fā)的SSR技術(shù)（即EST-SSR）是一種穩(wěn)定、可靠的分子標(biāo)記技術(shù)[7]，可直接用于基因作圖[8]，從而指導(dǎo)功能基因的預(yù)測(cè)。

EST-SSR與傳統(tǒng)SSR技術(shù)相比較，無需構(gòu)建DNA文庫而節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。而且，在功能基因研究方面，EST-SSR更接近功能基因組；表達(dá)序列標(biāo)簽直接來源于編碼序列，從而為基因組比較學(xué)以及同源基因的研究提供更可靠的途徑。但也有不足之處：與SSR相比，多態(tài)性較低；同時(shí)，ESTs只代表了基因組DNA的一部分，所包含的信息不夠全面，且現(xiàn)行的一些序列拼接軟件也存在一定的局限性，分析過程中也可能丟失一些重要的基因組信息。

1.2 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphisms，AFLP）

AFLP是1992年荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)明的一項(xiàng)新專利[9]。其原理是植物基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切后（通常采用雙酶切），與特定的接頭相結(jié)合而得到帶有特定接頭的特異性片段，這些片段再與PCR引物的3′端識(shí)別后進(jìn)行特異性擴(kuò)增，最后再將擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰氨凝膠電泳篩選，進(jìn)而分析其多態(tài)性。

AFLP是RFLP技術(shù)與PCR技術(shù)的結(jié)合，其具備了高多態(tài)性、操作簡(jiǎn)易、可以同時(shí)處理大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。近年來，AFLP已廣泛應(yīng)用于藥用植物遺傳圖譜的繪制、物種遺傳多樣性分析及分類研究、輔助育種、功能基因定位等多方向的研究[10，11]，且AFLP目前已被公認(rèn)為構(gòu)建DNA指紋圖譜最可靠的分子標(biāo)記。其缺點(diǎn)主要是對(duì)樣品DNA的質(zhì)量要求較高，實(shí)驗(yàn)成本也較昂貴，擴(kuò)增所得結(jié)果的分析也相對(duì)困難。

1.3 DNA條形碼技術(shù)

2003年Guelph大學(xué)的Hebert等首次提出DNA條形碼的概念。它是以足夠變異且相對(duì)較短的DNA序列為標(biāo)準(zhǔn)，建立的一種新的生物身份鑒別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種快速、精準(zhǔn)地識(shí)別和鑒定，其類似于超市使用條形碼鑒別不同商品。通過特異DNA的比對(duì)，對(duì)于新種和隱種的發(fā)現(xiàn)也具有現(xiàn)實(shí)性的幫助[12]。Lahaye等[13]通過單獨(dú)使用matK基因?qū)? 000多種蘭科植物進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果證明單獨(dú)使用matK基因能夠發(fā)現(xiàn)蘭科隱種并證明了DNA條形碼分析的可行性；Newmaster等[14]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了感應(yīng)草屬的3個(gè)隱種以及草沙蠶屬的1個(gè)新種。在2008年召開的植物無國界會(huì)議上提出了“超級(jí)條形碼”技術(shù)[15]，決定將葉綠體全基因組序列作為條形碼序列應(yīng)用在植物物種的鑒別上。Shinozaki等[16]第一次完成了單一物種葉綠體全基因組的測(cè)序；2008年Diekmann等[17]又提出了一套較為標(biāo)準(zhǔn)的葉綠體DNA提取方法。Parks等[18]通過對(duì)松屬37個(gè)樣本進(jìn)行葉綠體全基因組測(cè)序分析，驗(yàn)證了葉綠體基因組可以作為植物物種水平上的條形碼。近年來，DNA條形碼技術(shù)在藥用植物研究中的報(bào)道也逐漸增多，對(duì)于加快中國生物進(jìn)化研究的步伐具有重要意義[19，20]。

1.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱DNA芯片或寡核苷酸陣列，它是將大量已知的探針固定在支持物上[21，22]，通過核酸雜交，再利用激光掃描及分析，來實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因表達(dá)水平或多態(tài)性的分析。其高通量、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)使其廣泛用于基因的定位、藥物的靶向分析及新藥研發(fā)中。Schena于1995年第一次在論文中發(fā)表了DNA chip相關(guān)研究，F(xiàn)odor又于第二年年底研制出了第一塊DNA芯片[23]。

基因芯片技術(shù)目前主要應(yīng)用于一些新藥的研發(fā)[24，25]、藥物靶向研究以及疾病的診斷等方面。Watanabe等[26]采用高密度基因芯片技術(shù)，對(duì)經(jīng) Egb761處理的小鼠的皮層和海馬細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了研究，分析得出其具有拮抗神經(jīng)病變的藥理作用。李美德[27]應(yīng)用全基因組表達(dá)芯片來檢測(cè)從黃芩根中分離出的漢黃芩素作用于肝癌細(xì)胞后的基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)406個(gè)差異明顯的表達(dá)基因，通過差異基因的篩選和分析，從而確定了漢黃芩素抗肝癌的分子機(jī)制，對(duì)藥物靶向基因的確定，以及抗癌藥物的開發(fā)提供了新的依據(jù)。郭旭東[28]通過基因芯片技術(shù)對(duì)急性心肌梗死（AMI）患者和健康者外周血的RNA進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)其中的差異基因CYP4F3和USP25可能為AMI診斷的基因標(biāo)記。張玉金等[29]通過利用從中國2010年版藥典中篩選出的基原植物以及從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的相應(yīng)序列進(jìn)行分析，得到13 814條特異性探針，為中國藥典中基原植物檢測(cè)芯片的建立做出了重要貢獻(xiàn)。近年來，不同領(lǐng)域的實(shí)用芯片陸續(xù)都有報(bào)道，且基因芯片技術(shù)目前已是高通量藥物篩選的主要途徑，同時(shí)也是中藥活性成分篩選的重要手段。

1.5 單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）

SNPs是等位基因之間的單個(gè)核苷酸差異，如單個(gè)核苷酸的缺失、插入或者是突變等[30]。SNPs標(biāo)記技術(shù)相比微衛(wèi)星技術(shù)而言，SNPs描述的是一種雙等位基因的多態(tài)性，而SSR則是多位點(diǎn)等位基因之間的多態(tài)性，故SNPs在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SSR，因此具有更高的多態(tài)性。在人的基因組中，大概1 000 bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SNP，因此可以其作為DNA的一種特異性標(biāo)記[31]。Xu等[32]通過對(duì)水稻親本9 311的SNP檢測(cè)，得到了768萬個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，從而繪制了1張高密度的Bin圖譜并成功定位了1個(gè)QTL。目前，由于SNP技術(shù)主要依靠于基因組DNA的大量測(cè)序或者是基因芯片技術(shù)，且技術(shù)要求高以及實(shí)驗(yàn)成本大等原因，導(dǎo)致在藥用植物方面的研究也相對(duì)匱乏。

2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物中的研究應(yīng)用

2.1 中藥材種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)及道地性研究

種質(zhì)資源是指親本遺傳給子代的遺傳物質(zhì)，其包括“道地性”種質(zhì)資源、新種及重要培育品系等。徐蕾等[33]通過運(yùn)用SSR標(biāo)記技術(shù)在鐵皮石斛種群遺傳多樣性的研究，證實(shí)了鐵皮石斛具有較高的遺傳多態(tài)性，并順利將36份鐵皮石斛材料分成了3個(gè)類別。Shen等[34]利用篩選出的ISSR引物準(zhǔn)確地鑒別出了8個(gè)野生種石斛藥品。李永清等[35]利用ISSR技術(shù)成功將36份鐵皮石斛材料劃分為6個(gè)類群。趙香妍等[36]通過ISSR標(biāo)記技術(shù)在北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)資源中的研究，得出北京地區(qū)野生柴胡具有一定的地域性分布特征，應(yīng)加以保護(hù)及推廣種植。

2.2 中藥材真?zhèn)蔚蔫b別及品種鑒定

隨著中藥材市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大，中藥材市場(chǎng)魚目混珠的情況時(shí)有發(fā)生，同類藥材由于道地性等導(dǎo)致藥效也相差甚遠(yuǎn)，而常規(guī)的檢測(cè)方式卻很難區(qū)別。但現(xiàn)行的DNA分子鑒別技術(shù)基于高穩(wěn)定性、不受環(huán)境因素及個(gè)體發(fā)育影響等優(yōu)點(diǎn)，可以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。馬曉沖等[37]通過研究證明基于SNP的分子標(biāo)記技術(shù)能夠穩(wěn)定地鑒別中藥材澤瀉。滕艷芬等[38]利用matK基因已成功將正品與混淆產(chǎn)品鑒別開來。

2.3 遺傳多樣性及種屬親緣關(guān)系的研究

藥用植物遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究，對(duì)于認(rèn)識(shí)物種的進(jìn)化歷程、遺傳育種及物種改良等均具有重要意義。傳統(tǒng)的研究方法均是基于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的研究探索，但藥用植物的化學(xué)成分及其含量、外部形態(tài)等均會(huì)由于生長環(huán)境及其他因素影響而有所差別。因此，從傳統(tǒng)研究的角度探索藥用植物的遺傳多樣性就存在很大的局限性，而從分子角度出發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)能有效地揭示物種進(jìn)化演變過程中遺傳物質(zhì)流動(dòng)的真實(shí)本質(zhì)，從而使得分子標(biāo)記技術(shù)能夠闡明物種進(jìn)化、遺傳背景以及種內(nèi)或種間遺傳關(guān)系，為中國珍貴及瀕危中藥材的開發(fā)、利用和資源保護(hù)提供真實(shí)依據(jù)。

近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷應(yīng)用與發(fā)展，已有多種DNA標(biāo)記技術(shù)成功運(yùn)用于中藥材遺傳多樣性研究及親緣性分析中。YANG等[39]運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)吉林省5個(gè)不同產(chǎn)地的人參材料進(jìn)行分析，得出不同產(chǎn)地的人參在遺傳物質(zhì)上呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性。Li等[40]于2013年利用SSR標(biāo)記法對(duì)洋玉蘭葉綠體全基因組進(jìn)行近緣物種比對(duì)分析，結(jié)果顯示洋玉蘭葉綠體基因組的重復(fù)序列保守性相對(duì)較高。2014年，Galina等[41]又運(yùn)用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)俄羅斯瀕臨滅絕的人參進(jìn)行了種群遺傳性狀的分析。朱田田等[42]利用ISSR對(duì)甘肅不同產(chǎn)地中麻黃的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，得出中麻黃遺傳距離跟地理距離有一定的關(guān)系。黃穎楨等[43]通過使用ISS標(biāo)記技術(shù)對(duì)金線蓮遺傳多樣性進(jìn)行分析，得出在野生種質(zhì)資源間金線蓮具有豐富的遺傳多樣性。葉煒等[44]通過利用ISSR對(duì)金線蘭及其近緣物種的遺傳多樣性進(jìn)行研究，得出種群間可能存在基因的交流。唐曉清等[45]利用AFLP技術(shù)對(duì)不同農(nóng)家栽培類型的丹參進(jìn)行分析，結(jié)果表明AFLP技術(shù)可以作為識(shí)別丹參不同栽培類型間遺傳差異的手段。李勇等[46]利用AFLP技術(shù)通過對(duì)金蓮花遺傳多樣性的研究，得出地理位置較近的種質(zhì)遺傳相似度較高。唐美瓊等[47]利用AFLP技術(shù)對(duì)廣西草珊瑚遺傳性狀進(jìn)行研究分析，結(jié)果顯示廣西草珊瑚遺傳多樣性偏低，須盡快采取相應(yīng)措施。沈亮等[48]通過AFLP技術(shù)分析梭梭遺傳多態(tài)性得知該物種種內(nèi)豐度較高，各地區(qū)之間的分化較小。李永清等[49]通過ISSR在37份藥用石斛親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用，得出ISSR分子標(biāo)記技術(shù)完全可以應(yīng)用于石斛物種親緣關(guān)系的分析。朱田田等[50]通過對(duì)不同黃芪和黨參栽培品種遺傳關(guān)系的ISSR分析，得出不同品種的黃芪和黨參擁有較高的遺傳多樣性，而且種間差異較大。蔣雨晗等[51]利用ISSR分子技術(shù)對(duì)14份不同來源的白芍進(jìn)行研究分析，證明了4個(gè)栽培種跟野生種之間有一定的遺傳差異性，而且可以從基因水平把外型相似的白芍栽培品種區(qū)別開來。

2.4 DNA遺傳圖譜的構(gòu)建及數(shù)量控制基因定位

DNA遺傳圖譜也稱基因遺傳圖譜或連鎖圖譜，系指基因在染色體上相對(duì)應(yīng)的位置。自從第一張遺傳圖譜的構(gòu)建以來，越來越多關(guān)于藥用植物DNA圖譜的構(gòu)建也相繼報(bào)道。周志勇等[52]首次用AFLP技術(shù)構(gòu)建了人參和西洋參的DNA指紋圖譜，這對(duì)人參的鑒別提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用AFLP對(duì)石斛4個(gè)內(nèi)種和1個(gè)外群種進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，用篩選得到的引物構(gòu)建了5個(gè)種的DNA圖譜，并應(yīng)用bootstrap進(jìn)行了檢驗(yàn)，該研究證明了AFLP標(biāo)記技術(shù)可用于構(gòu)建石斛基因組指紋圖譜。趙紅燕[54]則利用EST-SSR、ISSR、RAPD、SRAP等4種分子標(biāo)記技術(shù)成功構(gòu)建了浙江鐵皮石斛563個(gè)遺傳連鎖。鄭偉耀等[55]運(yùn)用SSR標(biāo)記天麻基因組DNA，分析得出擴(kuò)增位點(diǎn)與天麻素含量有關(guān)。巫桂芬等[56]通過黃麻基因DNA分子指紋圖譜的構(gòu)建，得出每一種被識(shí)別出的物種均有其特有的分子“身份證”。

3 展望

中國藥用植物種質(zhì)資源非常豐富，但是近年來由于氣候的變化以及過度的開采，使得一些稀少的野生藥材資源更是急劇減少，市場(chǎng)也相對(duì)混亂，因此從生物本質(zhì)出發(fā)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)于中國藥用植物的鑒定、保護(hù)、開采、利用及改造就顯得格外重要。目前，分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物中的研究主要體現(xiàn)在遺傳多樣性研究、種質(zhì)鑒別及評(píng)價(jià)、DNA指紋圖譜構(gòu)建以及基因定位幾個(gè)方面。

目前在藥用植物研究應(yīng)用中的DNA分子標(biāo)記技術(shù)尚存在以下幾個(gè)問題：DNA標(biāo)記技術(shù)在中藥材研究中的應(yīng)用較少，而且存在方向聚集現(xiàn)象，近年關(guān)于藥用植物親緣性的研究越來越多，然而在其他一些領(lǐng)域，如藥材活性成分分離與提取以及相關(guān)成分控制基因定位等方面的研究卻少有報(bào)道，研究范圍不夠全面和深入。另外，每一種分子標(biāo)記技術(shù)都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定片面性，而標(biāo)記技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用也處于相對(duì)空白狀態(tài)；技術(shù)要求高，技術(shù)培訓(xùn)相對(duì)缺乏。因此，需要加大分子標(biāo)記技術(shù)的研究應(yīng)用，以便增加其在藥用植物研究中的實(shí)用性和可靠性，通過以不同分子技術(shù)的研究為基礎(chǔ)，可達(dá)到明確中藥材有效藥用成分的基因構(gòu)成，以及各種藥用植物基因的調(diào)控原理及產(chǎn)物的靶向作用原理，以便對(duì)中國中藥品種的保護(hù)利用及產(chǎn)業(yè)化做出更大的貢獻(xiàn)，以此實(shí)現(xiàn)中國中藥文化的規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化以及國際化。

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