鴨肉中吉他霉素殘留的SERS測定

趙進(jìn)輝 洪 茜 袁海超 劉木華

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

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鴨肉中吉他霉素殘留的SERS測定

趙進(jìn)輝1,2洪 茜1,2袁海超1,2劉木華1,2

(1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法建立一種鴨肉中吉他霉素(KIT)殘留的快速檢測方法。在分析增強(qiáng)基底的紫外—可見吸收光譜與鴨肉中KIT的SERS光譜的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)法優(yōu)化了鴨肉中KIT的SERS檢測條件，并分別建立了KIT水溶液檢測與鴨肉中KIT殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明，KIT水溶液檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.046 2x+0.215 3，決定系數(shù)(R2)為0.927 9，對(duì)KIT水溶液預(yù)測的平均回收率為99%～123%。鴨肉中KIT殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 9x+0.940 9，R2為0.923 2，對(duì)鴨肉中KIT預(yù)測的平均回收率為104%～108%。采用SERS技術(shù)檢測鴨肉中KIT 殘留是可行的。

吉他霉素；表面增強(qiáng)拉曼光譜；鴨肉；檢測

吉他霉素(Kitasamycin，KIT)是一種半合成畜禽專用的16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]5-6。由于KIT比泰樂菌素(Tylosin，TYS)對(duì)溶血性巴氏桿菌與畜禽霉形體等有更好的抗菌活性，在預(yù)防及治療雞、鴨等畜禽呼吸道與腸道疾病中使用廣泛且效果良好[1]6-8[2]。但容易造成KIT在鴨等畜禽可食用組織中殘留，有潛在危害人們身體健康的可能性[1]11。目前可用于畜禽組織中的KIT等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素檢測的傳統(tǒng)方法有高效液相色譜法[3]、微生物法[4]、氣質(zhì)聯(lián)用法[5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6]等。但這些方法往往需要昂貴的儀器設(shè)備或復(fù)雜耗時(shí)的樣品處理過程[7]，在鴨肉中的KIT快速檢測中較難應(yīng)用。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一種快速、靈敏的化學(xué)與生物化學(xué)分析技術(shù)，已經(jīng)在食品污染物檢測中表現(xiàn)出了巨大的潛力[8]。Zhang Yuan-yuan等[9]應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼散射檢測魚組織中的孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留，Zhai Fu-li等[10]采用SERS來快速檢測豬尿中的萊克多巴胺殘留,表明采用SERS技術(shù)進(jìn)行鴨肉中的KIT殘留快速檢測是可行的?；诖?，本研究擬在分析增強(qiáng)基底的紫外—可見吸收光譜和鴨肉中KIT的SERS光譜的基礎(chǔ)上，分析含KIT的鴨肉提取液的加入量和吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)強(qiáng)度的影響，并分別建立KIT水溶液與鴨肉中KIT殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，旨在為實(shí)現(xiàn)快速檢測鴨肉中KIT殘留打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

麻鴨：購于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度約為92.0%，購于中國物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)；

OTR202和OTR103：歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司；

乙酸乙酯、正己烷：分析純，汕頭西隴化工股份有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)備

便攜式激光拉曼光譜儀：RamTracer-200-HS型，歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司；

腦卒中位列全球死亡原因第三位，每年會(huì)導(dǎo)致59萬人死亡[1]，是成人慢性重度殘疾的主要原因，需要長期的康復(fù)治療[2]。在這一過程中，腦卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是最常見的精神問題，約有33%的患者在腦卒中發(fā)作后發(fā)展為PSD，其臨床主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲緩，以及言語動(dòng)作減少等典型癥狀[3-4]。PSD對(duì)腦卒中患者的影響主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面會(huì)進(jìn)一步惡化認(rèn)知的恢復(fù)、身體功能的康復(fù)以及生活質(zhì)量；另一方面會(huì)對(duì)患者進(jìn)行康復(fù)治療的能力有負(fù)面影響[1]。

超聲波清洗器：JK-50B型，合肥金尼克機(jī)械有限公司；

漩渦混合器：VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器有限公司；

離心機(jī)：JW-1024型，安徽嘉文儀器裝備有限公司；

氮吹儀：HSC-24B型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)：T10型，湖南科爾頓水務(wù)有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：T6系列，北京普析通用儀器責(zé)任有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含KIT的鴨肉提取液加標(biāo)樣本溶液的配置 用攪拌機(jī)將麻鴨胸脯肉攪碎，然后用電子天平稱取攪碎的鴨胸脯肉5 g，用移液槍取乙酸乙酯10 mL，一起加入到離心管中。將離心管放在漩渦混合器上振蕩1 min，用低速離心機(jī)離心15 min(4 500 r/min)。用移液槍取上清液4 mL，向其中加入正己烷2 mL，用漩渦混合器渦旋振蕩1 min。待其靜置分層后，移去下層白色沉淀物。重復(fù)處理3次后，用氮吹儀在30 ℃溫水浴條件下將其吹干，然后用超純水定容到4 mL即為鴨肉提取液。將10 mg KIT溶于100 mL鴨肉提取液中得到含100 mg/L KIT的鴨肉提取液加標(biāo)儲(chǔ)備液。用鴨肉提取液將其稀釋可得含不同濃度KIT的鴨肉提取液加標(biāo)樣本溶液。

1.2.3 紫外—可見吸收光譜的采集 用T6系列紫外可見分光光度計(jì)分別采集金溶膠OTR202和由OTR202、KIT水溶液和OTR103組成的混合溶液的紫外—可見吸收光譜，其光譜的掃描范圍為400～700 nm。

1.2.4 SERS光譜的采集 使用便攜式激光拉曼光譜儀采集試驗(yàn)樣本的拉曼光譜。拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置：激光波長785 nm、激光功率200 mW，分辨率6 cm-1，積分時(shí)間10 s，積分2次求平均值。待測混合溶液中金膠OTR202、待測樣品與OTR103的體積分別為500，20，100 μL。

1.2.5 SERS光譜的前處理方法 樣本的拉曼光譜均采集5次，并取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在標(biāo)定曲線建立前均應(yīng)用自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘法(air-PLS)扣除樣本拉曼光譜中的熒光等背景信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 增強(qiáng)基底的紫外—可見吸收光譜

由圖1可知，金溶膠OTR202的最大吸收峰峰位約在536 nm處，同時(shí)擁有較窄的半峰寬(約50 nm)，說明本次使用的ORT202金納米粒子擁有較均勻的粒徑分布和較好的增強(qiáng)潛力；OTR202、KIT水溶液和OTR103組成的混合溶液的最大吸收峰峰位(544 nm)相對(duì)于OTR202的峰位紅移了約8 nm，同時(shí)半寬峰增大。說明KIT分子已經(jīng)吸附到了增強(qiáng)基底表面。

a. OTR202 b. OTR202+KIT+OTR103

2.2 鴨肉中KIT的SERS分析及歸屬

由圖2可知，鴨肉提取液的主要SERS特征峰為1 557，1 532，1 430，1 370，1 246，1 208，1 198 cm-1；KIT水溶液的主要SERS特征峰為1 564，1 532，1 444，1 364，1 268，1 228，1 208 cm-1；含有KIT的鴨肉提取液的主要SERS特征峰為1 564，1 532，1 438，1 370，1 268，1 228，1 208 cm-1。對(duì)比3條光譜曲線可知，1 532，1 370，1 208 cm-1為三者共同的SERS特征峰，同時(shí)，含有KIT的鴨肉提取液的SERS特征峰(1 438，1 564 cm-1)分別與鴨肉提取液的SERS特征峰1 430，1 557 cm-1的峰位比較靠近，因此，上述SERS特征峰

a. 鴨肉提取液 b. KIT水溶液 c. 含有KIT的鴨肉提取液

不適合用于檢測鴨肉中KIT存在的SERS特征峰。而1 228，1 268 cm-12處SERS特征峰出現(xiàn)在KIT水溶液和含有KIT的鴨肉提取液的SERS光譜曲線上，在鴨肉提取液的SERS光譜曲線上沒有出現(xiàn)。 因此，1 228，1 268 cm-1作為判別鴨肉中KIT存在的SERS特征峰，同時(shí)為了減小外界因素和光譜分析的非線性，以1 268 cm-1與1 228 cm-1峰高比(I1 268/I1 228)作為變量進(jìn)行后續(xù)分析和處理。1 228 cm-1處SERS特征峰的產(chǎn)生可能與吡喃基團(tuán)上的C—H剪切振動(dòng)、C—H和O—H搖擺振動(dòng)有關(guān)，1 268 cm-1處SERS特征峰的產(chǎn)生可能是吡喃基團(tuán)上的C—H和O—H搖擺振動(dòng)[11-12]。

2.3 鴨肉中KIT檢測條件的優(yōu)化

為了獲得更好的鴨肉中KIT殘留的SERS檢測效果，本研究嘗試優(yōu)化含KIT的鴨肉提取液的加入量和吸附時(shí)間。在固定OTR202(500 μL)和OTR103(100 μL)加入量的條件下，改變含KIT(濃度：15.0 mg/L)的鴨肉提取液加入量，得到如圖3(a)所示的變化趨勢。由圖3(a)可知，隨著含KIT的鴨肉提取液加入量的增加，比值I1 268/I1 228呈先增大后減小的趨勢，說明增強(qiáng)基底與含KIT的鴨肉提取液之間的體積比會(huì)影響比值I1 268/I1 228的大小。同時(shí)，當(dāng)含KIT的鴨肉提取液加入量達(dá)到20 μL時(shí)，比值I1 268/I1 228達(dá)到最大值，基于此，選定含KIT的鴨肉提取液加入量是20 μL。

圖3(b)給出了比值I1 268/I1 228隨吸附時(shí)間的變化趨勢圖。由圖3(b)可知，不同吸附時(shí)間比值I1 268/I1 228不同，說明不同吸附時(shí)間金納米粒子OTR202聚集產(chǎn)生的活性熱點(diǎn)會(huì)對(duì)鴨肉中KIT的SERS特征峰強(qiáng)度產(chǎn)生影響。吸附1 min時(shí)，比值I1 268/I1 228最大，說明在給定的吸附時(shí)間范圍內(nèi)，1 min為較優(yōu)的吸附時(shí)間。

圖3 含KIT的鴨肉提取液加入量和吸附時(shí)間對(duì)SERS信號(hào)的影響

Figure 3 Effect of the addition amount of duck meat extract containing KIT and adsorption timeon SERS intensity

2.4 KIT水溶液檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線及預(yù)測結(jié)果

以KIT水溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以SERS特征峰比值I1 268/I1 228為縱坐標(biāo)，建立了KIT水溶液檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可知，KIT水溶液檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.046 2x+0.215 3，決定系數(shù)(R2)為0.927 9，說明KIT水溶液濃度(0.05～28.0 mg/L)與比值I1 268/I1 228具有一定的線性關(guān)系，水溶液中KIT的最低檢測限可達(dá)0.05 mg/L。為了驗(yàn)證該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測KIT水溶液的可靠性，對(duì)不同濃度的KIT水溶液進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見表1。由表1可知，對(duì)KIT水溶液預(yù)測的平均回收率為99%～123%，說明本研究方法的可靠性較好，可為后續(xù)建立鴨肉中KIT殘留的SERS檢測提供依據(jù)。

圖4 KIT水溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)際值/(mg·L-1)預(yù)測值/(mg·L-1)平均回收率/%5.05.0937101.8719.023.3132122.7023.022.691098.66

2.5 鴨肉中KIT殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定與預(yù)測結(jié)果

以鴨肉提取液中KIT濃度為橫坐標(biāo)，以SERS特征峰比值I1 268/I1 228為縱坐標(biāo)，得到的鴨肉提取液中KIT檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。由圖5可知，鴨肉中KIT殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 9x+0.940 9，R2為0.923 2，表明鴨肉中的KIT濃度與比值I1 268/I1 228呈良好的線性關(guān)系。 為了驗(yàn)證該標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測鴨肉提取液中KIT殘留的可靠性，對(duì)鴨肉提取液中的KIT殘留進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)鴨肉中KIT預(yù)測的平均回收率為104%～108%。表明采用SERS方法來檢測鴨肉中的KIT殘留是可行的。

3 結(jié)論

本研究進(jìn)行了增強(qiáng)基底的紫外—可見吸收光譜與鴨肉中KIT的SERS分析，確定了以峰高比I1 268/I1 228作為鴨肉中KIT殘留快速檢測的SERS分析特征變量。對(duì)含KIT的鴨肉提取液加入量和吸附時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。KIT水溶液檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.046 2x+0.215 3，R2為0.927 9，對(duì)KIT水溶液預(yù)測的平均回收率為99%～123%。鴨肉中KIT殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 9x+0.940 9，R2為0.923 2，對(duì)鴨肉中KIT預(yù)測的平均回收率為104%～108%。

表2 鴨肉提取液中的KIT的預(yù)測結(jié)果分析

圖5 含KIT的鴨肉提取液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

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Detection of kitasamycin residues in duck meat using surface-enhanced Raman spectroscopy

ZHAO Jin-hui1,2HONG Qian1,2YUAN Hai-chao1,2LIU Mu-hua1,2

(1. College of Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China; 2. Optics-Electrics Application of Biomaterials Lab, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, Jiangxi 330045, China)

By applying surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), a rapid detection of Kitasamycin (KIT) residues in duck meat was proposed. On the bases of analyzing UV-visible absorption spectrum of enhanced substrate and SERS of KIT in duck meat, the SERS detection conditions of KIT in duck meat, the addition amount of duck meat extract containing KIT and adsorption time, were optimized by single factor method, and the standard curves for the detection of KIT aqueous solution and KIT residues in duck meat were build respectively. The experiment results showed that the standard curve equation and the coefficient of determination werey=0.046 2x+0.215 3 and 0.927 9 respectively for the detection of KIT in aqueous solution with the average recovery rate of 99%～123%. The standard curve equation and the coefficient of determination werey=0.011 9x+0.940 9 and 0.923 2 respectively for the detection of KIT residues in duck meat with the average recovery rate of 104%～108%.The experiment results showed that it was feasible to detect the KIT residues in duck meat by using SERS technology.

Kitasamycin; surface-enhanced Raman spectroscopy; duck meat; detection

江西省科技廳對(duì)外科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：20132BDH80005)；江西省科技廳科技支撐項(xiàng)目(編號(hào)：20121BBG70058)

趙進(jìn)輝，男，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，博士。

劉木華(1969—)，男，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。 E-mail：suikelmh@sohu.com

2017—01—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.012