非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體及K-Ras基因突變特征與臨床病理特征的關(guān)系

婁 沖，陳秀珍，羅 娟

(1．四川省內(nèi)江市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000;2．四川省資中縣資州醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000;3．四川省內(nèi)江市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000)

非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體及K-Ras基因突變特征與臨床病理特征的關(guān)系

婁 沖1，陳秀珍2，羅 娟3

(1．四川省內(nèi)江市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000;2．四川省資中縣資州醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000;3．四川省內(nèi)江市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 內(nèi)江 641000)

目的 分析非小細(xì)胞肺癌患者表皮生長因子受體(EGFR)及K-Ras基因突變情況，分析突變與患者臨床病理特征的相關(guān)性。方法選取本地區(qū)非小細(xì)胞肺癌手術(shù)標(biāo)本90例，運(yùn)用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(ARMS)-Taqman探針法檢測(cè)EGFR及K-Ras基因外顯子突變狀態(tài)，并分析基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果90例非小細(xì)胞肺癌患者有39例檢測(cè)到EGFR突變，包括18例19-del和12例L858R，另有9例存在L858R和T790 M雙突變;33例K-Ras突變，主要為12密碼子突變;3例患者檢測(cè)到EGFR和K-Ras同時(shí)突變，為無吸煙史晚期肺腺癌患者;不同性別、吸煙史、腫瘤類型等亞組患者中EGFR突變率有差異，二元logistic回歸分析結(jié)果顯示EGFR與性別、年齡、腫瘤類型相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)K-Ras與以上臨床病理因素的相關(guān)性。結(jié)論EGFR基因突變類型以及是否伴隨K-Ras突變對(duì)于非小細(xì)胞肺癌患者臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義，K-Ras基因與臨床病理特征的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

非小細(xì)胞肺癌;基因檢測(cè);DNA突變分析;表皮生長因子受體;K-Ras

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，肺癌中大約80%是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，晚期NSCLC患者5年生存率僅約15%［1］，2014年美國肺癌死亡率高居癌癥之首［2］。近年來，靶向小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKIs)因其特異性高、不良反應(yīng)輕，在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的晚期NSCLC患者的治療中得到了廣泛應(yīng)用。相應(yīng)地，EGFR突變已被臨床確立為評(píng)估TKIs治療敏感性的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)［3］。與EGFR突變相反，KRas突變患者對(duì)TKIs的應(yīng)答效果差［4］，該基因突變常作為NSCLC無進(jìn)展生存期重要的不良預(yù)后因子［5］。到目前為止，關(guān)于EGFR和K-Ras的關(guān)系，二者的突變率以及與臨床病理特征的關(guān)系尚缺乏臨床數(shù)據(jù)。本研究同時(shí)檢測(cè)了90例NSCLC患者的EGFR和K-Ras突變情況并分析兩者相關(guān)性，同時(shí)對(duì)EGFR和K-Ras突變與臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年6月至2015年12月內(nèi)江市第二人民醫(yī)院的病理確診為NSCLC患者的手術(shù)切除的新鮮肺癌組織90例并保存在液氮中，對(duì)其EGFR和K-Ras突變狀態(tài)和臨床病理特征進(jìn)行分析。

1.2 方法組織DNA采用QIAamp DNA FFPE組織提取試劑盒(QIAGEN)提取，DNA純度和濃度采用NanoDrop 2000分光光度儀(Thermo Fisher)檢測(cè)，A260/A280在1.8～2.0。使用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的ADx-ARMSTMEGFR和K-Ras基因突變?cè)噭┖校瑱z測(cè) EGFR基因第18、19、20、21外顯子共21個(gè)位點(diǎn)的突變，以及K-Ras基因第12、13密碼子共6個(gè)位點(diǎn)突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用雙變量相關(guān)分析檢測(cè)EGFR和KRas之間的相關(guān)性;用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法比較不同性別、吸煙史、臨床分期、組織學(xué)類型等亞組患者中EGFR和K-Ras突變率的差異;用二分類Logistic回歸分析K-Ras、EGFR基因突變與多個(gè)臨床病理特征之間相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR和K-Ras基因突變情況及相關(guān)性90例NSCLC病例中，39例EGFR突變，包括三種突變類型，其中有18例為19號(hào)外顯子序列缺失突變(19-del)，12例為 21號(hào)外顯子突變 L858R，9例L858R和T790 M共突變，見表1。33例K-Ras突變分布見表2，其中12例為12密碼子Cys突變，9例為12密碼子Ala突變，6例為12密碼子Arg突變，3例為12密碼子Asp突變，3例為13密碼子Asp突變;21例EGFR和K-Ras均未檢測(cè)到突變;3例為EGFR和K-Ras同時(shí)發(fā)生突變。采用spearman雙變量相關(guān)分析EGFR和K-Ras的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)性(r=－0.526，P ＜0.001)。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者EGFR突變分布特征

表2 非小細(xì)胞肺癌患者K-Ras突變分布特征

2.2 EGFR和K-Ras共同突變患者的臨床病理特征3例EGFR和K-Ras同時(shí)發(fā)生突變的患者，EGFR 突變分別為 19-del、L858R、L858R+T790M，KRas突變均為12號(hào)密碼子突變，有2例為Cys突變，1例為Arg突變。1例為女性，2例為男性;均無吸煙史;1例為ⅢA期腺癌，2例為IV期腺癌，見表3。

表3 EGFR及K-Ras雙突變患者的臨床特征

2.3 EGFR和K-Ras突變與臨床病理特征的關(guān)系39例EGFR突變NSCLC患者中女性比例高(20/39)，與EGFR非突變組(13/51)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012);EGFR突變NSCLC患者以不吸煙為主(24/39)，而EGFR非突變組吸煙者比例更高(28/51)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010);EGFR突變組以肺腺癌為主(29/39)，鱗癌少(9/39)，EGFR非突變組鱗癌比例更高(21/51)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)，見表4。將性別、年齡、吸煙、腫瘤分期、腫瘤類型等因素納入二元Logistic回歸分析模型中，結(jié)果顯示EGFR突變與性別、年齡和腫瘤類型密切相關(guān)，見表5。未發(fā)現(xiàn)不同性別、吸煙史、臨床分期、組織學(xué)類型等亞組患者中K-Ras突變率的差異，二元Logistic回歸分析結(jié)果也提示K-Ras突變與以上臨床病理特征無相關(guān)性，見表6。

表4 NSCLC患者EGFR、K-Ras突變?cè)诓煌瑏喗M的分布情況比較

表5 EGFR突變與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系

表6 K-Ras突變與NSCLC臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

TKI類分子靶向藥物如吉非替尼(商品名:易瑞沙)療效顯著，已經(jīng)作為一線藥物用于治療EGFR突變陽性的 NSCLC患者［6］，其應(yīng)用的前提是明確EGFR突變狀態(tài)及突變類型。EGFR基因共28個(gè)外顯子，其中編碼酪氨酸激酶區(qū)的是第18～21外顯子［7］，對(duì)EGFR基因突變進(jìn)行數(shù)據(jù)分析表明，突變部位可以分散在整個(gè)酪氨酸激酶編碼區(qū)，但主要集中在第19外顯子的缺失(19-del)和第21外顯子的L858R點(diǎn)突變［8］。本研究中突變也集中在這兩個(gè)位點(diǎn)，有研究表明，這兩個(gè)位點(diǎn)突變屬于TKI藥物敏感性突變，使用TKI藥物療效好［6］。TKI藥物耐藥性突變包括 20-INS［9］和 T790M［10］，本研究發(fā)現(xiàn)有 9例患者同時(shí)有L858R和T790M突變，該組患者對(duì)TKI藥物耐藥，需要引起高度重視。

K-Ras基因是EGFR基因下游的一個(gè)信號(hào)通路，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，一旦發(fā)生突變會(huì)持續(xù)刺激細(xì)胞生長，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［11］。很多非小細(xì)胞肺癌動(dòng)物模型試驗(yàn)也證明K-ras基因的激活能提高細(xì)胞的增殖活性并誘導(dǎo)其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，對(duì)有K-ras突變的肺癌細(xì)胞系進(jìn)行K-ras基因表達(dá)的抑制則可使得細(xì)胞生長受到抑制［12］。Raponi等［13］報(bào)道NSCLC中K-Ras基因突變患者對(duì)TKI藥物治療基本無效，因此，在高K-Ras突變?nèi)巳?，K-Ras基因突變可作為行TKI治療前的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。本研究中K-Ras突變集中于12密碼子，僅3例位于13密碼子，與其它研究結(jié)果類似［14］。EGFR與K-Ras能否同時(shí)突變還有很大爭(zhēng)議，某些研究指出這兩個(gè)基因在腫瘤中是相互排斥的，不會(huì)同時(shí)出現(xiàn)突變［15～17］，但另一些研究發(fā)現(xiàn)了該雙基因能同時(shí)發(fā)生突變［18］，提示可能這兩個(gè)基因絕大部分是相互排斥的，共突變存在但是小概率事件。

EGFR突變與患者特征包括病理類型、性別、年齡、種族相關(guān)已經(jīng)有較多文獻(xiàn)報(bào)道［19～21］，也有文獻(xiàn)指出，EGFR突變還與臨床分期有關(guān)，EGFR突變常發(fā)生于腫瘤晚期，早期較少發(fā)生突變［14］。本研究未發(fā)現(xiàn)EGFR突變與臨床分期的關(guān)系，可能與臨床樣本量較少有關(guān)，需要增大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步分析兩者相關(guān)性。哪些臨床病理特征與K-Ras突變相關(guān)同樣存在爭(zhēng)議。Jiang等［4］指出，吸煙與K-Ras突變率增加相關(guān)。Tam等［16］也指出，K-Ras突變發(fā)生于腺癌，與吸煙、男性、分化差相關(guān)。相反，也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)K-Ras與臨床病理特征無相關(guān)性［22］。

綜上所述，EGFR突變與性別、吸煙史、病理類型相關(guān)，EGFR突變類型是否與這些臨床病理因素相關(guān)還需進(jìn)一步研究。K-Ras突變的相關(guān)因素尚不明確，需要積累大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析國人肺癌群體中EGFR和K-Ras突變與臨床病理特征之間的相關(guān)性，從而更為合理的應(yīng)用EGFR-TKI類藥物。

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The relationship between the mutations in EGFR and K-Ras genes and the clinicopathological features in patients with non-small cell lung cancer

LOU Chong1，CHEN Xiu-zhen2，LUO Juan3(1．Clinical Laboratory，Neijiang Second People's Hospital，Neijiang 641000，China;2．Clinical Laboratory，Zizhou Hospital of Zizhong，Neijiang 641000，China;3．Clinical Laboratory，Neijiang Traditional Chinese Medicine Hospital，Neijiang 641000，China)

LUO Juan

Objective To investigate the relationship between the mutations in genes of epidermal growth factor receptor(EGFR)and K-Ras and the clinicopathological features in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)．MethodsSurgical samples from 90 NSCLC patients were enrolled．All specimens were tested for mutations in EGFR and K-Ras by using amplification refractory mutation system(ARMS)-Taqman probe．The clinicopathological features of the patients were analyzed according to the mutation status of EGFR and K-Ras．ResultsOf these patients，EGFR mutations were detected in 39 patients，including 18 cases with 19-del，12 cases with L858R，and 9 cases with both L858R and T790 M mutations．There were 33 cases with K-Ras mutations，mainly 12 codon mutations．EGFR and K-Ras mutations at the same time were detected in 3 patients with advanced adenocarcinoma but no smoking history．EGFR mutation rate was different in subgroups of gender，smoking history and tumor types．Binary logistic analysis results showed that EGFR mutation was related with gender，age and tumor types while K-Ras mutation had no relation with these clinicopathological features．ConclusionDetection EGFR gene mutation type and whether complied with K-Ras mutations in NSCLC patients has an important guiding significance to clinical medication．The correlation between K-Ras gene and clinical pathologic features still needs further research．

Non-small cell lung cancer;Gene detection;DNA mutation analysis;Epidermal growth factor receptor(EGFR);K-Ras

R734.2

A

1672-6170(2017)04-0067-04

2017-01-06;

2017-03-24)

四川省衛(wèi)計(jì)委科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào):2014122)

羅 娟