檢測人血清中5-羥色胺的高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術方法

黃 振，董衛(wèi)國

(武漢大學人民醫(yī)院消化內科，湖北 武漢 430060)

檢測人血清中5-羥色胺的高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術方法

黃 振，董衛(wèi)國

(武漢大學人民醫(yī)院消化內科，湖北 武漢 430060)

目的 建立一種快速、靈敏地測定血清中5-羥色胺的高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術方法(LC-MS/MS)。方法采用同位素內標稀釋法，直接沉淀蛋白，采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm)，大氣壓化學電離源(APCI)，正離子模式，選擇5-HT的特征離子對177.1/160.0，內標d4-5-HT的特征離子對181.1/164.0。結果5-HT在10～2000 ng/ml濃度范圍內線性關系良好(r=0.9996)，定量下限為10 ng/ml，提取回收率＞85%，日內和日間精密度＜15%。結論本LC-MS/MS技術方法準確可靠、重現(xiàn)性好，靈敏度高，適用于人血清樣品中5-HT的濃度測定。

5-羥色胺;血清;高效液相色譜-串聯(lián)質譜

5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)由色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶催化首先生成5-羥色氨酸，再經(jīng)5-羥色氨酸脫羧酶催化形成，最早是從血清中發(fā)現(xiàn)的，又名血清素，由吲哚和乙胺兩部分組成，是一種重要的生物胺，分子式C10H12N20，在20世紀40年代末期首次從血清中分離出一種縮血管物質并將之命名為血清緊張素，1949年將其確定為5-HT。人體內95%的5-HT在胃腸道的腸嗜鉻細胞及腸神經(jīng)元中合成，嗜鉻細胞受腸腔內壓力和化學物質刺激時通過旁分泌、腔內分泌、內分泌途徑釋放5-HT至血液，周圍組織和腸腔［1～3］。5-HT在人體中既是重要的神經(jīng)遞質也是外周調質，參與許多生理和病理過程，如胃腸道的運動、血小板的變形、刺激血管的收縮和舒張、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能以及內分泌調節(jié)等。類癌瘤綜合癥、精神分裂癥、厭食癥、焦慮癥、抑郁癥、阿爾茨海默病、帕金森病、藥物引起的嘔吐、高血壓、偏頭痛、雷諾病，心律失常等疾病常伴有5-HT 的代謝異常［4～7］。因此，對血清中的 5-HT 進行含量檢測，對多種疾病的診斷和治療有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Q Exactive高分辨液相色譜-質譜聯(lián)用儀、Thermo四元泵系統(tǒng)、CTC自動進樣系統(tǒng)、VORTE XKB-3旋渦混合器、BSA223 S分析天平、Eppendorf-5810R高速臺式離心機，Milli-Q Reference超純水儀。5-羥色氨(購自 Sigma公司，批號BCBG1337 V)、氘代5-羥色胺(購自CDN Isotopes公司，批號E344P59)、全氟戊酸(購自 Sigma公司，批號MKBN4540 V)、血清(購自 Sigma公司，批號H4522)、甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司，實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜和質譜條件色譜柱為Agilent Zorbax E-clipse XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm，批號LAAJ-93597-902)、流動相:1.25 mM全氟戊酸水溶液-甲醇溶液、柱溫:40℃、流速0.3 ml/min、進樣量10 μl;采用梯度洗脫程序，各段時間內流動相比例及流速變化，見表1。離子源為大氣壓化學電離源(APCI)、全離子掃描范圍300～2000 m/z、歸一化碰撞能量35、鞘氣流速20，輔助氣流速5，吹掃氣流速0，毛細管溫度250℃，APCI氣化室溫度250℃。

1.3 標準溶液的制備精密稱取5-HT及其同位素內標d4-5-HT對照品10 mg于10 ml量瓶中，加甲醇-水(80/20，v/v)的溶液溶解并稀釋定容，配制成1 mg/ml的5-羥色胺及其內標儲備液。分別取適量1 mg/ml的5-HT及其同位素內標d4-5-HT儲備液用甲醇-水(80/20，v/v)稀釋成濃度分別為20 μg/ml和100 ng/ml的工作液。分別取適量的工作液，用空白血清稀釋至標準曲線所需的濃度，配制成相當于 5-HT 血清濃度分別為 10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml的標準系列溶液;分別取適量工作液，用空白血清稀釋至質控樣本所需的濃度，配制成相當于5-HT血清濃度分別為30、200、1600 ng/ml的低、中、高質控溶液。

表1 5-HT的梯度洗脫

1.4 血清樣本的處理取若干1.5 mlEP管，編號后精密吸取50 μl待測血清樣本，加入450 μl d4-5-HT溶液;立即渦旋混合30 s，室溫下放置5 min;再次渦混10 s，以10000 rpm轉速離心5 min;取上清液100 μl，加入 100 μl甲醇-水(80/20，v/v)，渦混 30 s，吸取10 μl進行LC-MS/MS分析。

1.5 基質效應計算取50 μl空白血漿，除不加內標溶液外，按“1.4血血漿樣品處理”項下操作，每一濃度進行5個樣本分析，然后向100 μl的上清液中分別加入 100 μl 低、中、高濃度(30、200、1600 ng/ml)的5-HT和d4-5-HT溶液，渦流混合，取10 μl進樣分析，所獲得的峰面積(五次測定的平均值)記為Ci。另取5-HT標準溶液和d4-5-HT溶液，用流動相稀釋成相同濃度的標準溶液，每一濃度進行5個樣本分析，同樣取10 μl進樣分析，所獲得的峰面積(三次測定的平均值)記為Ai，基質效應(ME)=Ci/Ai ×100%［8，9］。

1.6 精確度及準確度測定按“1.3標準溶液的制備”的方法配制低、中、高三個濃度的質控(QC)樣品(5-HT的血清濃度分別為30、200、1600 ng/ml)，每一濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定三天，根據(jù)當日的標準曲線，計算QC樣品的檢測濃度。

1.7 穩(wěn)定性測定本實驗考察了5-HT血清樣品室溫放置3 h，經(jīng)沉淀蛋白處理后在室溫放置20 h，以及5-HT血清樣品經(jīng)歷3次冷凍－解凍循環(huán)，血清樣品冷凍(－20°C)放置45天的穩(wěn)定性。按“1.3標準溶液的制備”項下配制的低、高兩個濃度的血清樣品(5-HT的血清濃度分別為30、1600 ng/ml)，每一濃度進行3樣本分析，采用LC/MS/MS法來測定。

1.8 提取回收率的測定取空白血清 50 μl，按“1.3標準溶液的制備”項下操作，配制低、中、高三個濃度的樣品(5-HT的血清濃度分別為30、200、1600 ng/ml)，每一濃度進行5樣本分析，進樣體積為10 μl，所獲得的峰面積記為Bi。同時另取50 μl空白血清，其余操作同“1.5基質效應”的方法操作所得的峰面積記為Ci，提取回收率=Bi/Ci×100%。

2 結果

2.1 方法的特異性對已知的化合物5-HT及其同位素內標d4-5-HT，在設定的條件下，經(jīng)過多次掃描比較，選定5-HT(m/z)的離子對為:177.13725→160.07448，d4-5-HT(m/z)的離子:181.12094 →164.09955。其二級全掃描質譜圖，如圖1。在此離子對的基礎上，分別得到空白血清、空白血清添加標準系列溶液以及受試者的血清樣本的色譜圖，如圖2;5-HT及d4-5-HT的出峰時間，即保留時間約為1.3 min，峰形良好，無內源性物質干擾，顯示出該方法條件下的5-HT及d4-5-HT的特異性好。

2.2 標準曲線及定量下限檢測得到10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml的系列濃度血清溶液的5-HT及相應內標的峰面積，以血清中5-HT的濃度為橫坐標(X)，待測物質峰與內標峰面積比值為縱坐標(Y)，用加權(W=1/X)最小二乘法進行回歸運算，得直線回歸方程及其相關系數(shù)為:Y=0.00039818X-0.000715379，r=0.9996，建立了 5-HT的標準曲線，如圖3。結果表明血清中5-HT濃度在10～2000 ng/ml范圍內，線性關系良好;定量下限為10 ng/ml，檢測的精確度高。

2.3 基質效應得到三個血清濃度下的5-HT和一個濃度下的d4-5-HT的基質效應，具體基質效應數(shù)據(jù)分別詳見表2。結果顯示，本試驗的血清樣本處理方法及LC-MS/MS分離條件，生物樣本的基質效應在可控范圍內，得到的相對標準偏差RSD(又稱變異系數(shù))均小于6.7%，基質效應不影響5-HT血清濃度的測定。

2.4 精密度及準確度精密度通過測量值的相對標準差RSD來判定;準確度通過相對誤差RE(%)=(測量值/真實值)×100%。根據(jù)QC樣品結果計算本法的準確度與精密度，具體數(shù)據(jù)見表3。每一濃度水平的QC樣品的日內RSD小于3.8%，日間RSD小于5.6%，RE在±4.9%之內。

表2 5-HT的基質效應 (%)

圖1 二級全掃描質譜圖 a:5-HT;b:內標d4-5-HT

圖2 LC-MS/MS測定人血清中5-HT(Ⅰ)及內標d4-5-HT(Ⅱ)的典型色譜圖 a:空白血樣;b:空白血樣+5-HT對照品;c:受試者血清樣品

圖3 5-HT血清標準曲線

2.5 穩(wěn)定性高低兩個濃度的樣本在室溫放置3 h、處理放置20 h、3次解凍循環(huán)以及冰箱儲存的45天的長期放置等條件下的穩(wěn)定性測定，具體測得的數(shù)據(jù)見表4。結果表明，5-HT血清樣品室溫放置3 h穩(wěn)定(RE在±2.2%之間);經(jīng)沉淀蛋白處理后室溫放置20 h穩(wěn)定(RE在±1.1%之間);經(jīng)歷3次冷凍－解凍循環(huán)穩(wěn)定(RE在±0.3%之間);樣品樣品冷凍(－20℃)放置45天穩(wěn)定(RE在±2.9%之間)。

2.6 提取回收率血清樣品中5-HT的提取回收率數(shù)據(jù)祥見表5，提取回收率(%)均值大于85%，相對標準偏差RSD小于5.4%，具有較好的提取回收率。

表3 不同血清濃度5-HT的準確度和精密度

表4 5-HT的穩(wěn)定性

表5 5-HT的提取回收率

3 討論

評價一項新生物分析方法的優(yōu)劣，主要通過考察它的方法特異性、定量下限、響應函數(shù)和校正范圍(標準曲線性能)、準確度、精密度、基質效應、分析物在生物基質以及溶液中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性以及提取回收率等特征［9～12］。本研究方法中的5-HT及d4-5-HT的出峰時間短，約為1.3 min，峰形良好且無內源性物質干擾，特異性好;定量下限達到10 ng/ml級別，檢測的精確度高，標準曲線的線性關系良好。精密度是描述分析物重復測定的接近程度，也是驗證重復性的好壞的一個指標，本研究中每一濃度水平的QC樣品的日內RSD小于3.8%，日間RSD小于5.6%，數(shù)值遠低于批內及批間變異系數(shù)不得超過15%的檢測標準;準確度是描述該方法下的測量值與分析物標示濃度的接近程度，通過相對誤差RE(%)來體現(xiàn)，準確度均值的相對誤差一般應在質控樣品標示值的±15%之內，顯然本研究的RE在±4.9%之內，準確度高。本研究的基質效應的相對標準偏差RSD均小于7%，數(shù)值遠低于基質效應變異系數(shù)不得大于15%的檢測標準;高低兩個濃度的樣本在生物基質以及溶液中儲存和處理全過程中的的穩(wěn)定性好，相對誤差RE小于±3%，完全符合RE應在±15%之內的標準。血清樣品中5-HT的提取回收率(%)均值大于85%，相對標準偏差RSD小于5.4%，具有較好的提取回收率。因此，本研究的分析方法各項特征指標均達到或高于檢測標準。

目前，檢測5-HT的方法主要有生物法、放射免疫法、放射酶法、熒光光度法、高效液相色譜-紫外光檢測法等［4，10］。早期的生物法現(xiàn)已不用;而放射免疫法雖有較好的靈敏度和特異性，但同位素標記對人體有害;熒光法雖使用較多，但操作麻煩，需要反復萃取，對檢測物質有一定量的損失［13，14］;相比于這些檢測方法，本研究開發(fā)的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)雖有儀器昂貴和建立方法復雜的局限，但具有靈敏度高、特異性強、準確度和精密度高、重復性好、定量下限低、樣本處理步驟簡單、進樣量少及檢測時間短等優(yōu)點。本實驗根據(jù)《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》的規(guī)定，建立了5-HT的LC-MS/MS定量分析方法，結果也顯示，LC-MS/MS的方法選擇性好、基質效應很低、回收率高、穩(wěn)定性好、定量下限低達10 ng/ml，完全能夠滿足生物樣品分析的要求，并且出峰時間僅為1.3 min，結果準確可靠，具有高通量的優(yōu)勢，更適合于臨床或科研中對5-HT的大批量樣本檢測。

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Determination of human serum 5-HT in by LC-MS/MS

HUANG Zhen，DONG Wei-guo (Department of Gastroenterology，People's Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China)

DONG Wei-guo

Objective To establish a rapid and sensitive method of liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LCMS/MS)for determination of 5-HT in human serum．MethodsUsing d4-5-HT as the internal standard(IS)，the sample was pretreated by simplified protein precipitated．Chromatography separation was performed on an Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×50 mm，3.5 μm)column．APCI source was applied and operated in positive mode．The ion pair in quantitative analysis was m/z177.1/160.0(5-HT)，m/z181.1/164.0(d4-5-HT，IS)．ResultsFor 5-HT，calibration curve was linear in range from 10 to 2000 ng/ml(r=0.9996)．The limit of quantitation was 10 ng/ml．The recovery was more than 85%．The RSD of inter and intra day precisions were less than 15%，respectively．ConclusionThis method is found to be accurate，good reproducibility and sensitive for determination of 5-HT in human serum samples．

5-HT;Serum;LC-MS/MS

R446

A

1672-6170(2017)04-0041-05

2017-02-15;

2017-05-03)

董衛(wèi)國