基于點(diǎn)掃描的超分辨顯微成像進(jìn)展?

趙光遠(yuǎn) 鄭程 方月 匡翠方劉旭

(浙江大學(xué)光電科學(xué)與工程學(xué)院,現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310027)

基于點(diǎn)掃描的超分辨顯微成像進(jìn)展?

趙光遠(yuǎn) 鄭程 方月 匡翠方?劉旭

(浙江大學(xué)光電科學(xué)與工程學(xué)院,現(xiàn)代光學(xué)儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310027)

(2017年3月30日收到;2017年5月2日收到修改稿)

光學(xué)顯微鏡一直推動(dòng)著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展.隨著科學(xué)的進(jìn)步,對(duì)顯微成像分辨率的要求在生物、材料等領(lǐng)域日漸凸顯,而常規(guī)寬場(chǎng)顯微成像一直面臨著成像分辨率衍射受限的問(wèn)題.1968年出現(xiàn)的共聚焦顯微鏡作為點(diǎn)掃描顯微鏡的開(kāi)端第一次實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)場(chǎng)下成像分辨率的突破,它具有層切性好、信噪比高等優(yōu)點(diǎn).在1994年出現(xiàn)的受激輻射熒光損耗顯微鏡將顯微成像能力突破到2.8 nm左右,并成為目前效果最佳、應(yīng)用較廣泛的超分辨顯微技術(shù).熒光差分顯微和飽和熒光吸收競(jìng)爭(zhēng)等點(diǎn)掃描技術(shù)具有無(wú)熒光染劑限制、飽和光強(qiáng)低、光路簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),并且能取得1/6波長(zhǎng)的分辨能力,進(jìn)而在超分辨顯微領(lǐng)域仍有著發(fā)揮空間.Airyscan技術(shù)作為以上方法的補(bǔ)充可以彌補(bǔ)點(diǎn)掃描系統(tǒng)中由于探測(cè)小孔半徑減小而帶來(lái)的信號(hào)丟失,從而提高成像信噪比和分辨率,但陣列探測(cè)器成本較高.上述點(diǎn)掃描顯微鏡通過(guò)改變照明或者探測(cè)的方式實(shí)現(xiàn)了分辨率突破.本文詳細(xì)討論了點(diǎn)掃描超分辨方法的原理、成像效果及面臨的瓶頸,并分析了點(diǎn)掃描超分辨顯微鏡在應(yīng)用和技術(shù)上的趨勢(shì).

超分辨,共聚焦,受激輻射熒光損耗顯微術(shù),點(diǎn)掃描

1 引 言

遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)顯微鏡一直被認(rèn)為是推動(dòng)科學(xué)發(fā)展的最重要技術(shù)之一.自從16世紀(jì)發(fā)明光學(xué)顯微鏡以來(lái),因其使裸眼不可見(jiàn)物體或結(jié)構(gòu)得到展現(xiàn),在諸如生物、醫(yī)藥以及材料科學(xué)中被廣泛應(yīng)用.這種技術(shù)能夠描繪微結(jié)構(gòu)的邊界、測(cè)量表面形態(tài)以及定位活體生物中特殊分子的分布.如果沒(méi)有光學(xué)顯微鏡,科學(xué)家對(duì)于“微觀世界”的探索將會(huì)受到很大限制.

作為成像質(zhì)量的重要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),分辨率是顯微鏡至關(guān)重要的參量.直到顯微鏡被發(fā)明300年后,光波傳輸?shù)难苌浔举|(zhì)以及它對(duì)分辨率的影響才得到深入研究.Airy在1835年將光通過(guò)圓形孔徑匯聚而成的圖案描述為Airy光斑.之后Abbe成為公式化描述衍射極限的先驅(qū).雖然在其1873年里程碑式的那篇文章中甚至沒(méi)有包含任何一個(gè)簡(jiǎn)明的公式,但Abbe至關(guān)重要地點(diǎn)明：常規(guī)顯微鏡的分辨率是由其工作波長(zhǎng)和成像物鏡的數(shù)值孔徑(numerical aperture,NA)決定[1].受到Abbe的啟發(fā),在1877年,Helmholtz和隨后的Stephenson[2]分別獨(dú)自從理論上得到衍射極限(橫向)的公式：

式中λ是工作波長(zhǎng),n是光傳播介質(zhì)的折射率,θ是物鏡可收集光線角的一半.在軸向方面分辨率將更加弱,da(軸向分辨能力)可改寫(xiě)成[3]：

在Abbe定理提出后,又產(chǎn)生了大量的關(guān)于如何通過(guò)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF)來(lái)定量描述系統(tǒng)分辨能力的工作,其中1874年Rayleigh(瑞利)判據(jù)[4]以及1927年Huston提出的半高全寬(full-width half-magnitude, FWHM)[5]方法逐漸成為研究者的首選準(zhǔn)則.

Abbe的工作的深遠(yuǎn)影響在于他不僅發(fā)現(xiàn)并從數(shù)學(xué)角度定義了衍射極限,同時(shí)也給出了提高分辨率的準(zhǔn)則.從(1)式中可以看出,通過(guò)減少工作波長(zhǎng)或者提高系統(tǒng)的數(shù)值孔徑,顯微鏡的分辨率可以提高到一定的程度.基于這個(gè)原理,Kohler在1904年搭建了第一臺(tái)紫外光顯微鏡,在這之后X射線被引入到顯微成像系統(tǒng)中[6].但超低波長(zhǎng)的光具有很大的損傷性,很難被應(yīng)用到生物成像中.與此同時(shí),雖然浸油物鏡能使系統(tǒng)的NA得到很大提升,但這樣的提高依舊是有限的,而且高折射率對(duì)于成像質(zhì)量會(huì)帶來(lái)色差等負(fù)面影響.因此,這些困難激勵(lì)著科學(xué)家們?nèi)ヌ剿髦嬲饬x上的超分辨顯微技術(shù),去繞過(guò)或者突破Abbe衍射極限.

Abbe定理在顯微成像領(lǐng)域有著毋庸置疑的貢獻(xiàn),但另一方面,Abbe定理的廣泛影響力也限制著后續(xù)科學(xué)家的創(chuàng)造能力.在這之后的一個(gè)世紀(jì)內(nèi), Abbe定理所提到的衍射極限被認(rèn)為等同于分辨率極限.事實(shí)上,在常規(guī)顯微中Abbe定理的作用更大程度上體現(xiàn)在光束收集方面.對(duì)于一個(gè)成像系統(tǒng),理想的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)應(yīng)該為一個(gè)沖擊函數(shù),那么對(duì)應(yīng)得到的成像結(jié)果就能保持被成像樣品的原始分辨率,如圖1(a)所示.但實(shí)際上的成像系統(tǒng)都是衍射受限系統(tǒng),其點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)一般被擴(kuò)張至一定寬度,因此對(duì)應(yīng)的成像結(jié)果的分辨率下降,圖像變得模糊,如圖1(b)所示.若系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)突破衍射極限,對(duì)應(yīng)成像結(jié)果就會(huì)在原先衍射受限結(jié)果的基礎(chǔ)上更加靠近理想成像的結(jié)果,分辨率有所提升,如圖1(c)所示.

在既定探測(cè)性質(zhì)不可改變的條件下,我們通過(guò)改變進(jìn)入探測(cè)系統(tǒng)前光傳播和載波的方式來(lái)調(diào)節(jié)分辨率,從而縮小系統(tǒng)的有效PSF,達(dá)到超分辨顯微.在1968年以共聚焦顯微技術(shù)為開(kāi)端[7],這些突破性進(jìn)展中有在2014年獲得諾貝爾獎(jiǎng)的Hell提出的受激輻射熒光損耗顯微術(shù)(stimulated emission depletion microscopy,STED)[8],Betzig等[9]和Hess等[10]提出的光敏定位顯微術(shù)(photonactivated localization microscopy,PALM)、文獻(xiàn)[11—13]提出的隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)、以及結(jié)構(gòu)光照明(structured illumination microscopy,SIM)顯微術(shù)[14,15],和 blind-SIM顯微方法[16].上述方法無(wú)不利用這兩種性質(zhì)：1)不同于寬場(chǎng)顯微鏡平面波照明,Abbe定理在光照明時(shí)仍有作用;2)熒光顆粒和部分具有光開(kāi)關(guān)(photoswitchable)性質(zhì)的熒光顆粒使得光與樣品之間可以存在頻率移動(dòng)或者其他非線性作用[17].

點(diǎn)掃描超分辨系統(tǒng)以共聚焦系統(tǒng)為開(kāi)端,發(fā)展了許多改進(jìn)型的點(diǎn)掃描顯微技術(shù),其中包含STED、多點(diǎn)照明共聚焦以及蔡司公司的Airyscan等.因?yàn)辄c(diǎn)掃描系統(tǒng)的三維成像能力、高聚焦光強(qiáng)、高信噪比等能力,在生物、材料方面有著很重要的應(yīng)用.本文重點(diǎn)介紹點(diǎn)掃描超分辨系統(tǒng)的方法和最新進(jìn)展.

圖1 成像結(jié)果 (a)對(duì)應(yīng)于理想沖擊點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)得到的成像結(jié)果;(b)對(duì)應(yīng)于衍射受限系統(tǒng)的成像結(jié)果;(c)對(duì)應(yīng)于系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)突破衍射極限的成像結(jié)果Fig.1.Optical imaging results：(a)The imaging results corresponding to the ideal impulse PSF;(b)the imaging results analogous to the di ff raction limited system PSF;(c)the imaging results of the system that point spread function surpass the di ff raction limit.

2 共聚焦原理

共聚焦顯微鏡(confocal)如圖2所示,不同于寬場(chǎng)顯微的平面光波照明樣品,Confocal將聚焦高斯光斑照明在樣品上,并且在探測(cè)光路中引入物理小孔進(jìn)行濾波.共聚焦的定義也在于探測(cè)和照明的面為共軛關(guān)系且都為聚焦模式.共聚焦系統(tǒng)的成像過(guò)程可以表示為[18,19]

圖2 共聚焦熒光顯微系統(tǒng)原理示意圖 左邊為照明光路將聚焦光斑匯聚在樣品上,右邊為收集光路利用點(diǎn)探測(cè)器收集激發(fā)熒光Fig.2.The sketch of confocal imaging process.As can be seen in the fi gure,the light illuminated onto the sample from the left side with a focused beam spot. After illumination,the emitted fl uorescence from the sample is collected as seen on the right side.

這里hill,hdet分別是照明和探測(cè)PSF;P是小孔的孔徑函數(shù);hsys則是最終的系統(tǒng)PSF.通過(guò)掃描振鏡改變照明角度或者平臺(tái)平移可以實(shí)現(xiàn)照明光對(duì)樣品的掃描.因?yàn)辄c(diǎn)照明的特殊性,小孔在探測(cè)的同時(shí)具有強(qiáng)大的濾波和層切作用[20],在被掃描范圍以外的發(fā)出信號(hào),即離焦信號(hào)能被有效抑制,因此共聚焦顯微鏡可以得到高于寬場(chǎng)顯微鏡的信噪比的成像結(jié)果.共聚焦顯微系統(tǒng)與Heimstad發(fā)明的熒光顯微系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)[21],具有強(qiáng)大的三維成像[22]和描繪熒光染色結(jié)構(gòu)功能,目前已成為高分辨率顯微鏡的主流.

如果共聚焦系統(tǒng)小孔的孔徑無(wú)限小,它的孔徑函數(shù)可以表示為沖擊函數(shù),相應(yīng)地(3)式可以簡(jiǎn)化為

此時(shí)共聚焦系統(tǒng)的PSF可在軸向和橫向上都提高至寬場(chǎng)的1.4倍[23].但實(shí)際應(yīng)用中,小孔的孔徑越小代表能被探測(cè)到的信號(hào)越弱,信噪比會(huì)變差,影響分辨率的提高.實(shí)驗(yàn)證明在0.6—0.8 AU時(shí)可以達(dá)到信噪比和分辨率平衡的最佳效果[24].

由共聚焦系統(tǒng)的公式,我們可以發(fā)現(xiàn)對(duì)于點(diǎn)掃描系統(tǒng)的進(jìn)一步突破也在于繼續(xù)改變照明或者探測(cè)成像系統(tǒng),從此衍生出了STED[8]、熒光輻射差分顯微術(shù)( fl uorescence emission di ff erence microscopy,FED)[25]和Airyscan等超分辨顯微系統(tǒng).

3 STED超分辨系統(tǒng)

STED超分辨系統(tǒng)的理論在1994年由Stefan Hell提出.簡(jiǎn)而言之,相比于共聚焦顯微技術(shù), STED產(chǎn)生了一個(gè)更小的聚焦光斑,也就是改變激發(fā)PSF來(lái)達(dá)到超分辨.

STED的原理如圖3(a),熒光光子被激發(fā)到S1能級(jí),掃描顯微鏡的激發(fā)PSF被疊加上一個(gè)λSTED＞λexc的STED空心光斑,產(chǎn)生受激輻射使得在激發(fā)態(tài)S1上的光子被STED光損耗到基態(tài)S0.S1能級(jí)上的激發(fā)光子概率將受到STED光光強(qiáng)調(diào)制[26]：

式中kexc=σ01Iexcλ/(hc1)對(duì)應(yīng)激發(fā)光激發(fā)速率; kSTED=σSTEDISTEDλ/(hc1),k0對(duì)應(yīng)STED光損耗速率以及熒光速率;σ01,σSTED分別是激發(fā)吸收截面、STED光吸收截面;h對(duì)應(yīng)普朗克常量;c1對(duì)應(yīng)光在介質(zhì)中的傳播速率;Iexc和ISTED分別為激發(fā)光和STED光光強(qiáng).

如圖3(b),因?yàn)楸化B加上的是空心STED光斑,在強(qiáng)STED光損耗下,激發(fā)光可有效激發(fā)的區(qū)域被限制在空心STED光的中心區(qū)域.當(dāng)STED光斑增強(qiáng),熒光可激發(fā)出光的區(qū)域便越來(lái)越小,利用縮小的光斑掃描樣品便能得到亞衍射極限級(jí)分辨率.圖3(c)為STED系統(tǒng)的裝置圖.STED系統(tǒng)分辨率隨著光強(qiáng)的變化可表示為[27]

其中P為照明光強(qiáng),Ps為STED的等效飽和光強(qiáng)[28].目前,最常見(jiàn)的獲取空心光斑的方法是基于高倍數(shù)值孔徑下的相位調(diào)制[29].因?yàn)镾TED對(duì)于光束的高要求,發(fā)展出了基于徑向矢量光調(diào)制的STED光斑[29,30].矢量光調(diào)制的STED光斑空心區(qū)域更小,但是熒光分子本身具有的熒光極性會(huì)帶來(lái)測(cè)量誤差.對(duì)于STED光斑操縱的研究也同時(shí)促進(jìn)了光刻[31]、光鑷[32]以及焦點(diǎn)調(diào)制[33]的研究.

圖3 STED超分辨顯微鏡過(guò)程 (a)STED雙能級(jí)系統(tǒng);(b)STED系統(tǒng)的激發(fā)聚焦光斑、STED聚焦光斑、最終有效激發(fā)光;(c)STED系統(tǒng)簡(jiǎn)圖：1,光子計(jì)數(shù)器;2,激發(fā)光;3,STED光;4,渦旋位相板;5,聚焦物鏡;6,激發(fā)光斑;7,STED光斑疊加在激發(fā)光斑上;8,自發(fā)輻射的熒光光斑Fig.3.The imaging process of STED super-resolution system：(a)The double energy level system of STED; (b)the excitation spot,STED depletion spot,the spontaneous emitted spot;(c)the sketch of STED system.

圖4為STED超分辨顯微鏡效果圖,其中提到的time-gated STED(g-STED)技術(shù)利用了熒光光子激發(fā)的不同壽命原理[34].外圈激發(fā)的熒光光子壽命比內(nèi)圈的短,換言之,外圈的熒光發(fā)光時(shí)間比內(nèi)圈的短,在收集熒光時(shí)利用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(time correlated single photon counting,TCSPC)壽命探測(cè)系統(tǒng),將外圈短壽命的熒光光子舍棄,從而縮小探測(cè)PSF獲得更高分辨率的超分辨成像結(jié)果.從圖4(d)的對(duì)比可以發(fā)現(xiàn),同樣光強(qiáng)下g-STED可以達(dá)到38 nm分辨率,相較于STED的80 nm有大幅提升.其他的類(lèi)STED點(diǎn)掃描超分辨方法有基態(tài)損耗成像(ground-state depletion imaging,GSD)[35],可逆飽和光線性熒光躍遷(reversible saturable optical linear fl uorescence transitions,RESOLFT)等[36].STED顯微方法不僅可用于生物樣品觀測(cè),也可以觀測(cè)量子通信中常見(jiàn)的NV色心等.NV色心的分子穩(wěn)定性可以使它承受3.7 GW/cm2量級(jí)的照明光強(qiáng),從而達(dá)到2.4 nm的圖像分辨率[37].

STED顯微方法存在的不足是深層成像時(shí)兩束光路難以保持對(duì)準(zhǔn)并且空心光斑畸變較嚴(yán)重,導(dǎo)致成像深度較低[38].一種可行的方法是引入貝塞爾光束生成STED光斑從而增加其穿透深度[39],實(shí)驗(yàn)中GB-STED在155μm深度下可達(dá)112 nm的分辨率[40].另外,STED系統(tǒng)搭建較之于共聚焦系統(tǒng)難度較大,利用自適應(yīng)光學(xué)等改善搭建效果和像差自動(dòng)校正是STED亟需解決的問(wèn)題[41].

近年來(lái),在STED成像系統(tǒng)提高方面,Hell研究組做了大量前瞻性的工作.基于超連續(xù)光源的STED,通過(guò)聲光可調(diào)濾光器(AOTF)選?？梢詫?shí)現(xiàn)四色STED[43],近期發(fā)表的文章中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)用同波長(zhǎng)STED光實(shí)現(xiàn)四色成像[44].利用easy-STED模塊可以實(shí)現(xiàn)雙色STED光共路照明,目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出相應(yīng)產(chǎn)品[45].基于并行掃描的STED可以大幅度提高成像速度[46,47],而消色差以及圖像后處理方法在并行掃描中的應(yīng)用可以進(jìn)一步提高其成像質(zhì)量[48,49].

圖4 幾種方法的成像圖 (a)共聚焦顯微鏡;(b)STED顯微鏡;(c)g-STED;(d)圖(a)—(c)中虛線部分每種方法對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度圖;可以驗(yàn)證g-STED相比STED可達(dá)到更高分辨率[42]Fig.4.The imaging results of several systems：(a)Imaging results of confocal;(b)imaging results of STED;(c)imaging results of g-STED[42];(d)intensity of the dashed line part in fi g.(a)– fi g.(c),which verify the higher resolution of g-STED than STED.

因?yàn)閐epletion光激發(fā)或者受激輻射光無(wú)法被完全濾除的緣由,提高STED成像技術(shù)的信噪比是一個(gè)研究得較多的方向.其中相減方法也被廣泛應(yīng)用,在量子點(diǎn)STED研究中,文獻(xiàn)[50]提出了將得到的STED成像結(jié)果再減去單獨(dú)STED光照射產(chǎn)生的圖像從而提高信噪比.在近期發(fā)表的四色STED中將逐行掃描的STED成像結(jié)果減去STED照射結(jié)果來(lái)提高信噪比[44].不同的是,Gao等[51]提出了double-depletion STED方法中將同一脈沖周期內(nèi)的STED效果只和STED光背景噪聲相減.就STED相減去噪角度來(lái)看,這三種方法在減小被相減掃描圖像漂白、漂移方面為遞進(jìn)關(guān)系,doubledepletion有著最佳的效果但是在控制脈沖時(shí)延上最為復(fù)雜[51].

減小熒光照明光強(qiáng)和熒光漂白影響是STED近兩年的重要進(jìn)展.通過(guò)適當(dāng)減小STED波長(zhǎng)來(lái)增大STED光吸收截面,是有效減少STED光強(qiáng)度需求的方向之一,但STED光和激發(fā)光波長(zhǎng)接近產(chǎn)生的自發(fā)輻射會(huì)帶來(lái)圖像信噪比下降等風(fēng)險(xiǎn)[52].Liu等[53]利用“鑭系摻雜上轉(zhuǎn)換納米顆?！钡臒晒馍限D(zhuǎn)換效應(yīng)進(jìn)行STED成像,從而減小STED光所需要的光強(qiáng),為材料特性的研究提供了思路.Yang等[54]利用反射光增強(qiáng)STED光光強(qiáng)來(lái)達(dá)到STED光強(qiáng)度需求減少.Hell組先后提出了Protected-STED[55]和MINFIELD-STED[56]方法,根據(jù)STED激發(fā)的空心特點(diǎn)以及樣品的稀疏特性來(lái)保護(hù)熒光樣品的過(guò)度漂白.通過(guò)對(duì)納米抗體標(biāo)記的核孔復(fù)合物進(jìn)行成像,MINFIELD-STED證明了可以實(shí)現(xiàn)一般STED因?yàn)樾盘?hào)不足無(wú)法達(dá)到的小于25 nm分辨率的成像效果.

STED技術(shù)是目前點(diǎn)掃描超分辨顯微領(lǐng)域較為成熟的技術(shù),并且有著幾十納米量級(jí)的分辨率,在商業(yè)領(lǐng)域以Abberior Instruments的Rescue-STED,3D-STED、雙色-STED產(chǎn)品為代表,已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用.

4 飽和競(jìng)爭(zhēng)超分辨顯微方法

作為一種剛出現(xiàn)的點(diǎn)掃描超分辨顯微方法,飽和競(jìng)爭(zhēng)超分辨顯微方法(saturated competition microscopy,SAC)是一種同色光競(jìng)爭(zhēng)方法[57].不同于STED技術(shù)中受激輻射和自發(fā)輻射在S1能級(jí)熒光輻射中的后競(jìng)爭(zhēng),SAC在熒光吸收的S0能級(jí)中額外引入一束飽和空心光斑作為競(jìng)爭(zhēng)光去競(jìng)爭(zhēng)實(shí)心光斑的吸收過(guò)程.這類(lèi)似于GSD的基態(tài)損耗方法[35],但SAC利用的是同色激光在基態(tài)的飽和吸收競(jìng)爭(zhēng).SAC系統(tǒng)中將共聚焦顯微鏡分成兩路,一路進(jìn)行實(shí)心頻率調(diào)制(kexc),一路進(jìn)行相位調(diào)制成空心光斑當(dāng)兩種光斑共同激發(fā)到樣品面上,便形成了飽和吸收的過(guò)程(圖5(a)).低光強(qiáng)的實(shí)心光斑熒光激發(fā)區(qū)域被高光強(qiáng)的空心光斑減小,利用鎖相放大器解調(diào)被頻率調(diào)制的實(shí)心激發(fā)光可獲得超分辨圖像.類(lèi)似于STED,實(shí)心光斑的激發(fā)概率可以表示為

相比于STED,SAC有飽和光強(qiáng)需求低、對(duì)樣品損傷小的優(yōu)勢(shì)(圖5(b)).從(5)和(7)式的比較中可以發(fā)現(xiàn),這是因?yàn)橥ㄩL(zhǎng)的SAC相比STED有著更大的吸收截面以及競(jìng)爭(zhēng)分別發(fā)生在飽和吸收和輻射兩種不同能級(jí).文獻(xiàn)[57]將SAC與SIM以及Confocal(一種寬場(chǎng)情況下利用結(jié)構(gòu)光照明的超分辨方法)對(duì)比,驗(yàn)證了其超分辨顯微效果(圖5(d)—(g)).SAC取得了遠(yuǎn)高于Confocal的成像效果,即使和SIM成像結(jié)果比,SAC的分辨能力也更加優(yōu)秀(可見(jiàn)白色框標(biāo)重點(diǎn)區(qū)域).

圖5 SAC機(jī)理和成像結(jié)果 (a)SAC超分辨顯微方法中用來(lái)照明激發(fā)強(qiáng)度的五能級(jí)系統(tǒng);(b)SAC在低光強(qiáng)和飽和光強(qiáng)激發(fā)下的熒光激發(fā)比率,‘a(chǎn)’表示高光強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)光束,‘b’表示低光強(qiáng)的主激發(fā)光束;(c)SAC的實(shí)心光斑熒光激發(fā)損失比率隨著空心競(jìng)爭(zhēng)光束光強(qiáng)增加時(shí)的變化曲線,可以看到空心光強(qiáng)增加時(shí)SAC的熒光激發(fā)損失比例相對(duì)STED更加大;(d)—(g)不同成像方法對(duì)于細(xì)胞核孔進(jìn)行成像的結(jié)果,(e),(g)分別代表對(duì)于Confocal和SAC進(jìn)行5次Richardson Lucy反卷積后的結(jié)果[57]Fig.5.The imaging principle and results of SAC：(a)Five-level molecular electronic state model used to calculate the relationship between the excitation emission intensities;(b)illustration of the saturation of S1state and the process of competition during the excitation,‘a(chǎn)’denotes the high-intensity competition beam(solid lines)while‘b’denotes the low-intensity primary excitation beam(dashed lines);(c)the remaining fl uorescence in S1state analogous to the competition or depletion intensity from SAC or STED;(d)–(g)comparison between SIM and SAC veri fi es SAC’s enhanced resolution,(e)and(g)represent the results that deconvolved from the raw confocal and SAC results after 5 Richardson Lucy iterations,respectively[57].

經(jīng)驗(yàn)證SAC成像方法可以達(dá)到1/6波長(zhǎng)的成像效果,同時(shí)具有比STED裝置簡(jiǎn)單、低光強(qiáng)、無(wú)熒光染劑限制、低成本等優(yōu)勢(shì).但該方法也有著一些待解決的不足：兩路競(jìng)爭(zhēng)的激發(fā)光來(lái)源于同一激光器,空心光激發(fā)和實(shí)心光激發(fā)的熒光需要先到達(dá)探測(cè)器再通過(guò)鎖相放大器將信號(hào)分離,這會(huì)面臨探測(cè)器飽和以及鎖相對(duì)噪聲抑制比不足帶來(lái)的信噪比等問(wèn)題,導(dǎo)致分辨率難以進(jìn)一步提高.

5 基于分時(shí)差分的自發(fā)輻射熒光顯微方法(FED)

差分成像可提供更高的分辨率和信噪比,因此被廣泛應(yīng)用[58-60].在較早的研究中,Heintzmann等[61]做過(guò)基于不同小孔大小下的成像,得到的圖像相減從而實(shí)現(xiàn)超分辨成像,但圖像的信噪比很低,邊緣還有著大量信號(hào)殘余.近幾年,文獻(xiàn)[25,62, 63]提出了以FED為代表的將空心光斑和實(shí)心光斑分時(shí)掃描得到圖像相減提高分辨率的方法.其核心原理可以表示為

圖6 FED示意圖 (a),(b)分別代表實(shí)心斑和空心斑激發(fā)PSF;(c),(d)代表兩種激發(fā)PSF分別經(jīng)過(guò)探測(cè)之后的PSF;(e)為最后得到的FED的PSF[25]Fig.6.Working process of FED：(a),(b)Represent the solid and doughnut excitation spot respectively;(c),(d)are the detected PSF after the detecting process;(e)is the fi nal system PSF of FED after undergoing the subtraction process[25].

圖7 飽和FED超分辨圖 (a)仿真所得的熒光分子激發(fā)強(qiáng)度隨著照明光強(qiáng)的變化;(b)不同照明光強(qiáng)下實(shí)心光斑、空心光斑以及飽和FED的仿真效果圖,可見(jiàn)隨著飽和程度的增強(qiáng)不僅負(fù)值畸變減小,分辨率也有所提高;(c)Confocal,FED,空心斑飽和的FED以及空心實(shí)心都飽和的sFED對(duì)微管成像結(jié)果圖,可見(jiàn)sFED在空心和實(shí)心激發(fā)光斑都飽和時(shí),分辨率和信息留存方面都表現(xiàn)更好[70]Fig.7.Imaging results of saturated FED(sFED)：(a)The simulated results of saturated excitation curve of FED corresponding to the increase of illumination intensity;(b)simulated PSFs of solid illumination spot,hollow illumination spot,and sFED result corresponding to di ff erent illumination intensities;(c)imaging results of microtubules corresponding to Confocal,FED, doughnut beam sFED,both doughnut and solid saturated FED,as can be seen in the fi gures,when the doughnut and solid excitation spot are both saturated,sFED achieves the best imaging performance[70].

其中PSFFED,PSFsolid,PSFdoughnut分別對(duì)應(yīng)著FED、實(shí)心光斑、空心光斑的PSF;γ為相減系數(shù).因?yàn)镕ED相減中會(huì)出現(xiàn)負(fù)值帶來(lái)的畸變,在相減系數(shù)取值以及光斑調(diào)制上需做大量的工作[64-66].

經(jīng)過(guò)矢量光調(diào)制的FED方法可以減少畸變和提高分辨率[67-69].用于照明的共聚焦實(shí)心光斑和空心光斑分別用偏振轉(zhuǎn)換器產(chǎn)生的徑向偏振光和切向偏振光調(diào)制而得,調(diào)制所得的實(shí)心光斑和空心光斑的外輪廓可以更加接近,減少負(fù)值畸變.同時(shí)因?yàn)榍邢蚱窆庹{(diào)制出來(lái)的光斑比傳統(tǒng)渦旋光斑的空心區(qū)域要小,可以得到更高的分辨率.矢量光調(diào)制FED在488 nm波長(zhǎng)照明下可達(dá)到110 nm的分辨率[67].

與SAC和STED的機(jī)理類(lèi)似,FED采用激發(fā)實(shí)心光斑和空心光斑同時(shí)飽和,得到的飽和FED(sFED)的光斑分辨能力將會(huì)更高[70].利用熒光飽和效應(yīng),我們獲得外輪廓拓展的實(shí)心斑和中心縮小的空心斑成像結(jié)果.因?yàn)榉蔷€性效應(yīng)的存在,兩種匹配的飽和圖像一定程度上消除了負(fù)值畸變,并且相比普通FED提高了成像分辨率和信噪比.如圖7所示,利用sFED在633 nm波長(zhǎng)光照明下可得到100 nm左右的分辨率.

FED超分辨方法具有無(wú)熒光染料限制、后處理方便的優(yōu)勢(shì),在相減系數(shù)研究方面目前最先進(jìn)的是強(qiáng)度權(quán)重相減(intensity weight subtraction, IWS)方法[71].FED今后的發(fā)展方向可以是利用脈沖激光器來(lái)減少漂白,也可以是三維的sFED動(dòng)態(tài)生物細(xì)胞觀測(cè)[72].

6 基于陣列探測(cè)器的超分辨方法

在引言中提到,普通共聚焦系統(tǒng)的分辨率和信噪比受限于pinhole大小.Pinhole越大收集熒光強(qiáng)度會(huì)越強(qiáng),但另一方面圖像的分辨能力會(huì)較弱,小pinhole則反之.因此pinhole大小多取在平衡點(diǎn)0.6 AU附近[24].盡管如此,0.6 AU的pinhole大小依然意味著光子信號(hào)的大量損失.1988年,Sheppard[73]提出了類(lèi)似于SIM的方法,有將共聚焦顯微鏡分辨能力提高2倍的可能.雖然理想帶寬最終能達(dá)到2倍,但是Sheppard等[74]也發(fā)現(xiàn)在不考慮斯托克斯紅移的情況下,半高全寬的值最高可達(dá)到普通顯微鏡的1.53倍,超過(guò)該倍率帶寬的信號(hào)將迅速衰減(圖8(c)).在Sheppard所提出的方法中,裝置依舊為共聚焦顯微鏡的聚焦照明,但是點(diǎn)探測(cè)器部分被替換成了陣列探測(cè)器((圖8(a))[75].通過(guò)對(duì)于每個(gè)探測(cè)器所獲得的圖像運(yùn)用相應(yīng)算法進(jìn)行像素重組,可以得到的成像結(jié)果分辨率提高.此類(lèi)方法被統(tǒng)稱(chēng)為Airyscan[75],而ISM[76]和OPRA[77]都可以作為這種方法的別名或變種.Airyscan方法在2010年由Müller和Enderlein等[76]利用EMCCD作為陣列探測(cè)器得以實(shí)現(xiàn).在2012年,York等[78]用多點(diǎn)激發(fā)實(shí)現(xiàn)了生物細(xì)胞的快速成像.de Luca等[79]在2013年證明不同探測(cè)器的像素重組不僅可在后處理中完成,也可以通過(guò)光學(xué)形式的Rescan形式完成.Sheppard等[74]發(fā)現(xiàn)在不考慮斯托克斯紅移的情況下,對(duì)于一個(gè)物體的點(diǎn)進(jìn)行成像,其焦點(diǎn)的峰值強(qiáng)度是普通顯微鏡的1.84倍,這種相比于共聚焦的優(yōu)勢(shì)也被稱(chēng)為Superconcentration現(xiàn)象.需要注意的是Airyscan雖然總的信號(hào)強(qiáng)度增大了,但是每個(gè)光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)通道的探測(cè)都伴隨泊松噪聲的產(chǎn)生,因此整體的噪聲是增加的.在蔡司的Airyscan顯微鏡產(chǎn)品的圖像后處理中有相減步驟,減去均勻化的噪聲值,從而提高圖像信噪比.圖8(b)比較了Airyscan(OPRA)和共聚焦、寬場(chǎng)顯微等的PSF,可見(jiàn)Airyscan在半高全寬上的提升[77].圖8(c)和圖8(d)為歸一化和未歸一化不同pinhole大小的Confocal與Airyscan(ISM)的光學(xué)傳遞函數(shù)(optical transmission function,OTF)分布的對(duì)比,可見(jiàn)利用Airyscan成像方法不僅在整體信號(hào)強(qiáng)度上有所提高(圖8(d)),并且在高頻區(qū)域的分量比例也更高(圖8(c))[80].不同于傳統(tǒng)的Airyscan處理方法, Kuang等[81]引入Vikmom方法去后處理Airyscan點(diǎn)探測(cè)器所得到的信號(hào)圖像,Vikmom將陣列探測(cè)器得到的信號(hào)用虛擬結(jié)構(gòu)光照明的方法進(jìn)行調(diào)制,然后引入傅里葉域?qū)盈B術(shù)(Fourier ptychography microscopy)方法到圖象恢復(fù)中.如圖8(d)所示, Vikmom在提高分辨率的基礎(chǔ)上,可以增強(qiáng)層切效應(yīng),修正光路畸變等.

圖8 A˙iryscan顯微方法和效果圖 (a)Airyscan系統(tǒng)簡(jiǎn)圖[82];CL,收集透鏡;M,反射鏡;L,透鏡;SL,掃描鏡;TL,場(chǎng)鏡;OL,物鏡;DM,二色鏡;(b)寬場(chǎng)、1 AU pinhole大小的Confocal、理想無(wú)pinhole Confocal,Airyscan方法對(duì)應(yīng)的PSFs;(c)歸一化不同小孔大小對(duì)應(yīng)的Confocal OTFs[80];(d)未歸一化的不同小孔大小對(duì)應(yīng)的Confocal OTFs;(e)0.2 AU小孔的Confocal,1 AU的confocal,0.2 AU的Airyscan,Vikmom對(duì)應(yīng)的成像結(jié)果;(f)spinning-disk Airyscan對(duì)應(yīng)的成像結(jié)果,左邊從上往下分別是spinning-disk共聚焦、Airyscan、經(jīng)過(guò)Fourier reweighting后的Airyscan結(jié)果,右邊為plot對(duì)左邊結(jié)果的plot;(g)spinning-disk Confocal和spinning-disk Airyscan對(duì)于生物細(xì)胞的成像結(jié)果[83]Fig.8.The principle and imaging results of Airyscan：(a)Imaging system of Airyscan[82],CL,collecting lens;M,re fl ecting mirror;L,lens;SL,scanning lens;TL, field lens;OL,objective lens;DM,dichroic mirror;(b)the normalized PSFs of wide field,Confocal with 1 AU,Confocal with non-pinhole,and Airyscan microscopies;(c)the normalized OTF for confocal microscopes with di ff erent pinhole sizes and ISM with a large array[80];(d)the unnormalized OTF for a confocal microscope with di ff erent pinhole sizes in Airy units,the OTF for ISM with a large array is also shown;(e)imaging results of Confocal with 0.2 AU pinhole,Confocal with 1 AU pinhole,Airyscan,and Vikmom with 0.2 AU pinhole;(f)imaging results of a single particle using spinning-disk Airyscan,on the left,upper,spinning-disk confocal result,middle,the Airyscan result, lower,the Airyscan result after the Fourier reweighting,on the right is the plot of three methods;(g)the imaging results of biological samples upon spinning-disk confocal method and Airyscan method[83].

在Airyscan探索中,在掃描過(guò)程中引入spinning-disk可以大幅提高成像速度.圖8(f)和圖8(g)展示了采用Airyscan方法的spinning-disk系統(tǒng)取得了分辨率的提高,但從圖中也可以發(fā)現(xiàn)Airyscan對(duì)于分辨率提高的局限性.相比于普通spinning-disk掃描的結(jié)果,無(wú)論是從半高全寬還是從最小分辨距離來(lái)看,Airyscan都達(dá)不到兩倍提高.就仿真效果來(lái)看,Airyscan相比于0.6 AU的共聚焦分辨率提升1.2倍左右[74].

7 其他的點(diǎn)掃描超分辨顯微系統(tǒng)

以上的點(diǎn)掃描超分辨顯微方法多應(yīng)用于熒光成像,但是在如非熒光成像等的材料科學(xué)領(lǐng)域,分辨率的提升依然重要.不僅是熒光顆粒存在飽和吸收過(guò)程,部分材料也存在光強(qiáng)吸收飽和效應(yīng).Wang等[84]在2013年將飽和吸收引入到pump-probe系統(tǒng)中觀察石墨烯,得到了石墨烯的超分辨成像效果.另外,Rogers等[85]證明在不存在飽和吸收的材料觀測(cè)中,用加工super-oscillation透鏡調(diào)制照明光可以使共聚焦系統(tǒng)取得更小的聚焦光斑,從而達(dá)到λ/6超分辨顯微效果[86].

近年來(lái),散射介質(zhì)對(duì)于超分辨成像的增益效果更加矚目.在傳統(tǒng)的認(rèn)知中,光經(jīng)過(guò)深層組織或者強(qiáng)散射顆粒應(yīng)盡量降低散射程度.有諸多研究嘗試用干涉等方法建立傳輸矩陣對(duì)透過(guò)散射介質(zhì)的光束進(jìn)行再整形.然而2011年P(guān)utten等[87]做了相反的工作,他們利用光經(jīng)過(guò)強(qiáng)散射系統(tǒng),得到了半高全寬在100 nm的匯聚光斑,稱(chēng)作高折射率散射分辨率增強(qiáng)(high-index resolution enhancement by scattering,HIRES)方法.HIRES的前提在于光波前相位的精確標(biāo)定.當(dāng)然HIRES也沒(méi)有打破衍射極限,文中解釋分辨率的提高在于光經(jīng)過(guò)散射介質(zhì)后OTF的最大錐角增大.2013年P(guān)ark等[88]將這種現(xiàn)象解釋為散射介質(zhì)的多重散射增強(qiáng)了對(duì)倏逝波的探測(cè),如圖9.散射介質(zhì)和倏逝波的研究為深層組織的超分辨方法提供了可能.

另外,近場(chǎng)光學(xué)基于等離子激元的超分辨顯微技術(shù)為超分辨顯微提供了另外一些可能,利用表面等離子體激元以及局域等離子體激元耦合產(chǎn)生大k矢照明光從而超分辨成像是其中的主要方法[89,90],這些對(duì)于遠(yuǎn)場(chǎng)點(diǎn)掃描顯微成像有著一些借鑒意義.通過(guò)片上波導(dǎo)增大超分辨顯微的視場(chǎng)目前已經(jīng)被應(yīng)用到STORM技術(shù)上,對(duì)于點(diǎn)掃描也有借鑒意義[91].

圖9 基于散射控制亞波長(zhǎng)成像原理[88](a)常規(guī)光學(xué)系統(tǒng)僅能控制或者觀測(cè)到在截止頻率內(nèi)的遠(yuǎn)場(chǎng)光波,圖中超過(guò)k0的部分是自由空間中的倏逝波矢量并且不可以被常規(guī)光學(xué)系統(tǒng)探測(cè);(b)常規(guī)透鏡只能在截止頻率內(nèi)的頻率分量;(c)當(dāng)平面波入射到一個(gè)隨機(jī)介質(zhì)中,多重散射的發(fā)生將入射波調(diào)制成既包含傳導(dǎo)波又包含倏逝波分量;(d)當(dāng)撞擊打散的波前被控制匯聚到一個(gè)目標(biāo)位置,產(chǎn)生波矢量被相位匹配從而在目標(biāo)位置重建出一個(gè)亞波長(zhǎng)焦點(diǎn)Fig.9.Principle of subwavelength manipulation using scattering control[88]：(a)Conventional optics can only control or observe propagating far- field wave vectors that fall within the cuto ffspatial frequency,For|k|·|k0|,where k0is the wave vector in free space,the wave vectors are evanescent and are consequently inaccessible in the far field using conventional optics;(b)a conventional lens can therefore only control the far field within the cuto fffrequency,when the phase of each wave vector within the cuto fffrequency is matched at a target point,a di ff raction-limited focus with a width of l/2 can be obtained;(c)when a plane wave is incident on random media,the wave is multiply scattered and converted into a manifold of di ff erent wave vectors that contain both propagating and evanescent terms,the scrambled random phase of each wave vector results in a speckle containing subwavelength spatial modes;(d)when the impinging wavefront is controlled at a target position,the resulting wave vectors can be phase-matched to construct a subwavelength focus at a target position.

8 總 結(jié)

本文介紹了點(diǎn)掃描超分辨顯微鏡的發(fā)展方法類(lèi)別和最新進(jìn)展.點(diǎn)掃描超分辨顯微鏡以Confocal為開(kāi)端,經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,出現(xiàn)了STED,FED, Airyscan,SAC和散射超分辨成像等方法.相比于SIM為代表的寬場(chǎng)結(jié)構(gòu)光超分辨顯微成像,STED, SAC等成像方法具有成像分辨率的優(yōu)勢(shì).對(duì)比STORM等利用隨機(jī)定位的超分辨顯微成像,點(diǎn)掃描顯微成像具有成像速度快,三維成像效果佳和層析能力好的優(yōu)點(diǎn).隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,可以預(yù)見(jiàn)點(diǎn)掃描超分辨顯微術(shù)將發(fā)揮重大的作用.

STED作為其中的代表取得了最大的分辨率提升效果,可達(dá)生物細(xì)胞20 nm,NV色心2.4 nm的分辨能力.但目前,點(diǎn)掃描或者是現(xiàn)有的超分辨顯微方法從技術(shù)角度已經(jīng)出現(xiàn)了一個(gè)新的瓶頸,進(jìn)一步地增強(qiáng)超分辨顯微的效果將十分困難.除STED之外,其他超分辨顯微的成像分辨多在2—3倍以?xún)?nèi).但是STED等點(diǎn)掃描顯微鏡因?yàn)楣馍⑸涿媾R著不同程度的穿透深度限制問(wèn)題,如何解決這些問(wèn)題將是點(diǎn)掃描超分辨顯微鏡研究的重點(diǎn).另外散射介質(zhì)調(diào)控的亞衍射光斑匯聚值得探究.

Airyscan作為一種改變探測(cè)的成像改進(jìn),可以與其他方法結(jié)合,但是高性能陣列探測(cè)器價(jià)格昂貴是一大難題,目前這方面已做出7探測(cè)器的相對(duì)于寬場(chǎng)成像提高30%分辨率的拉曼超分辨顯微鏡[92].但Airyscan的廣泛應(yīng)用依然面臨著探測(cè)器昂貴、系統(tǒng)復(fù)雜的問(wèn)題.SAC成像系統(tǒng)作為新出現(xiàn)的成像方法,取得了λ/6的分辨率突破.相比STED,SAC有著潛在的優(yōu)點(diǎn),其圖像分辨能力和信噪比提高的潛力有待進(jìn)一步挖掘.

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PACS:87.64.mk,87.64.M—,87.64.kv,87.63.lm DOI:10.7498/aps.66.148702

Progress of point-wise scanning superresolution methods?

Zhao Guang-Yuan Zheng Cheng Fang YueKuang Cui-Fang?Liu Xu

(State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation,College of Optical Science and Engineering,Zhejiang University,

Hangzhou 310027,China)

30 March 2017;revised manuscript

2 May 2017)

Optical microscope has been giving impetus to the development of modern technology.As the advancement of these techniques,high resolution microscopy becomes crucial in biological and material researches.However,the di ff raction limit restricts the resolution of conventional microscopy.In 1968,confocal microscopy,the fi rst pointwise scanning superresolution method,appeared.It improves the imaging resolution,enhances the contrast,and thus breaks through the di ff raction limit.Since then many superresolution methods have come into being,among which the pointwise scanning superresolution method earns reputation for its high imaging resolution and contrast.The stimulated emission depletion microscopy becomes the most prominent method with an achievable resolution of about 2.4 nm and then widely used.Besides,the newly developed fl uorescence emission di ff erence microscopy(FED)and the saturated absorption competition microscopy(SAC)have their advantages of non-constraint on fl uorescent dyes,low saturated beam power, simpli fi ed optical setups,while they achieve a resolution of lower than λ/6.Further explorations of FED will be keen on vivo biological observations by using it,while that of SAC can concentrate on enhancing the resolution on a nanoscale and reducing the signal-to-noise ratio.In addition,the Airy scan technique in which a detector array is used for image acquisition,can serve as a complementary tool to further enhance the imaging quality of pointwise scanning superresolution method.The detector-array enables both the narrowed size of pinhole and the increasing of the acquired signal intensity by 1.84 folds.The other methods,e.g.superoscillation lens and high-index resolution enhancement by scattering,have the potentialities to obtain superresolved image in material science or deep tissues.After being developed in the past three decades,the superresolution methods now encounter a new bottleneck.Further improvement of the current methods is aimed at imaging depth,and being used more practically and diversely.In this review,we detailedly describe the above pointwise scanning superresolution methods,and explain their principles and techniques. In addition,the de fi ciencies and potentialities of these methods are presented in this review.Finally,we compare the existing methods and envision the next generation of the pointwise scanning superresolution methods.

superresolution,confocal,stimulated emission depletion microscopy,pointwise scanning

:87.64.mk,87.64.M—,87.64.kv,87.63.lm

10.7498/aps.66.148702

?國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)：2015CB352003)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)：2016YFF0101400)、國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：61335003,61377013,61378051,61427818)、浙江省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：LR16F050001)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助的課題.

?通信作者.E-mail：cfkuang@zju.edu.cn

?2017中國(guó)物理學(xué)會(huì)Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Basic Research Program of China(Grant No.2015CB352003),the National Key Research and Development Program of China(Grant No.2016YFF0101400),the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61335003,61377013,61378051,61427818),the Natural Science Foundation of Zhejiang Province,China (Grant No.LR16F050001),and the Fundamental Research Funds for the Central Universities,China.

?Corresponding author.E-mail：cfkuang@zju.edu.cn