基于近場(chǎng)光學(xué)的微球超分辨顯微效應(yīng)?

周銳1)#? 吳夢(mèng)雪2)# 沈飛1) 洪明輝2)?

1)(廈門大學(xué)航空航天學(xué)院,廈門 361005)

2)(新加坡國(guó)立大學(xué)電機(jī)工程系,新加坡 117576)

基于近場(chǎng)光學(xué)的微球超分辨顯微效應(yīng)?

周銳1)#? 吳夢(mèng)雪2)# 沈飛1) 洪明輝2)?

1)(廈門大學(xué)航空航天學(xué)院,廈門 361005)

2)(新加坡國(guó)立大學(xué)電機(jī)工程系,新加坡 117576)

(2017年3月29日收到;2017年5月16日收到修改稿)

編者按自1873年阿貝提出衍射極限以來(lái),該問題就一直是學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn).近年來(lái),隨著近場(chǎng)光學(xué)、表面等離子體亞波長(zhǎng)光學(xué)、非線性光學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,人們開始在亞波長(zhǎng)尺度重新認(rèn)識(shí)衍射極限.本專題針對(duì)如何突破衍射極限,以及突破衍射極限之后的新問題,邀請(qǐng)本領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者闡述最新進(jìn)展和研究趨勢(shì),以期進(jìn)一步促進(jìn)相關(guān)理論、技術(shù)及應(yīng)用的發(fā)展. (客座編輯:中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所 羅先剛)

在光學(xué)成像領(lǐng)域,由于受到衍射極限的限制,常規(guī)成像分辨率在200 nm左右.科學(xué)的不斷進(jìn)步對(duì)更高分辨率有著迫切需求,如何突破這個(gè)極限來(lái)獲得更高質(zhì)量的高分辨率圖像是熱門研究領(lǐng)域.2011年提出了微球超顯微技術(shù)：在原有的光學(xué)系統(tǒng)中,將直徑幾微米至幾十微米的透明微球直接置于樣品表面,就能夠成倍提高傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的成像能力.微球超顯微技術(shù)以其簡(jiǎn)單直接的特點(diǎn),受到廣泛關(guān)注.本文介紹了光學(xué)顯微鏡的研究背景以及國(guó)內(nèi)外團(tuán)隊(duì)在微球超分辨顯微技術(shù)方面的研究進(jìn)展,包括通過在微球表面進(jìn)行環(huán)刻同心環(huán)、中心遮擋和表面涂覆的方法來(lái)調(diào)節(jié)微球所產(chǎn)生的光子納米噴射方面所開展的一系列研究,并進(jìn)行了理論模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,進(jìn)一步提升了微球的超分辨顯微效應(yīng).最后,展望了今后微球超分辨顯微技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展方向.

光學(xué)顯微鏡,微球超分辨,光子納米噴射

1 引 言

光學(xué)顯微鏡是利用光學(xué)原理,把人眼所不能分辨的微小物體放大成像,以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)信息的光學(xué)儀器.光學(xué)顯微鏡的發(fā)明是人類歷史上取得的一項(xiàng)重大成就,它使得人們能夠看到放大成百上千、甚至幾萬(wàn)、幾十萬(wàn)倍的肉眼所不能看見的精細(xì)結(jié)構(gòu).1590年,荷蘭的兩位眼鏡工匠Hans Janssen和他的兒子Zacharias Janssenfamil發(fā)明了世界上第一臺(tái)光學(xué)顯微鏡.后來(lái),經(jīng)過伽利略,羅伯特·胡可和列文·胡可等的進(jìn)一步研究改進(jìn),在動(dòng)、植物機(jī)體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出成就,對(duì)科學(xué)技術(shù)尤其是生命科學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了重大的影響.1873年,德國(guó)科學(xué)家阿貝(E.Abbe)[1]首次提出了光學(xué)衍射極限的概念,認(rèn)為顯微鏡所能看到的物體的最小尺寸為光波長(zhǎng)的一半左右(在可見光波段,這一極限大約為200 nm).然而對(duì)于生命科學(xué)而言,這個(gè)尺度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠.值得注意的是,阿貝的光學(xué)衍射極限的概念是基于光波自身的波動(dòng)屬性而得到的,而當(dāng)代許多先進(jìn)的光學(xué)顯微鏡往往是通過光與物質(zhì)的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn),這為突破光學(xué)衍射極限提供了可能.受到阿貝的啟發(fā),德國(guó)科學(xué)家Helmholtz[2]提出了著名的分辨率公式,并在1877年由Stephenson[3]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,這進(jìn)一步為突破光學(xué)衍射極限提供了理論基礎(chǔ).1942年,Francia首次假定了倏逝波的存在并于1949年進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[4].倏逝波是一種沿介質(zhì)界面?zhèn)鞑サ?、振幅在垂直于界面的方向上的電磁?作為一種近場(chǎng)駐波,在傳播過程中,攜帶物體的高頻率亞波長(zhǎng)空間信息,其強(qiáng)度隨著與物體表面距離的增加而呈指數(shù)衰減.相對(duì)于一般傳播波,倏逝波的平行分量較大,能夠表現(xiàn)出更加精細(xì)的細(xì)節(jié)信息[5-7].

1970年,Nassenstein[8]采用了一個(gè)巧妙的方案,利用倏逝波照射物體,并用全息技術(shù)獲得了放大的圖像,所放大圖像的分辨率由倏逝波的波長(zhǎng)決定.基于這一方案,1972年,近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡(near- field scanning optical microscopy,NSOM)由此誕生[9].通過物體表面覆蓋的具有微小針孔(孔徑小于入射光波長(zhǎng))的薄膜,成功進(jìn)行了首次超越經(jīng)典光學(xué)分辨率極限的亞波長(zhǎng)成像.雖然NSOM俘獲的圖像的分辨率優(yōu)于其他大多數(shù)顯微鏡,但探針掃描檢測(cè)的方法使得整個(gè)系統(tǒng)復(fù)雜且成像緩慢,不能進(jìn)行實(shí)時(shí)的生物檢測(cè),并受到孔徑尺寸的限制[10].

對(duì)于常規(guī)透鏡,圖像的清晰度總是受到光波長(zhǎng)的限制.2000年,Pendry[11]通過一系列理論分析和證明,提出了“完美透鏡”的概念,通過具有負(fù)折射率(折射率小于零)的人造介質(zhì)[12-16],能夠恢復(fù)傳播波的相位和倏逝波的振幅,放大倏逝波[17].使用這種透鏡,傳播波和倏逝波都可以貢獻(xiàn)于提升圖像的分辨率,使得物體的信息在成像點(diǎn)完美重建,打破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的限制,實(shí)現(xiàn)了超分辨聚焦的目的.完美透鏡的概念導(dǎo)致了對(duì)超材料和等離子體激元研究的激增.遵循Pendry的基本思想,過去十幾年中,世界各地的許多研究團(tuán)隊(duì)和研究人員研發(fā)了多個(gè)版本的等離子體超材料超透鏡[18-21],這些超透鏡雖然突破了阿貝的傳統(tǒng)光學(xué)限制,但分辨率仍限制在70—100 nm,無(wú)法達(dá)到生物領(lǐng)域所需的更高分辨率的水平[22,23].

超分辨顯微技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的最成功的顯微技術(shù).不同于近場(chǎng)成像的NSOM和超材料透鏡,超分辨顯微技術(shù)基于遠(yuǎn)場(chǎng)成像.它主要有兩種實(shí)現(xiàn)途徑：一種是基于特殊強(qiáng)度分布照明光場(chǎng)的超分辨成像方法(如stimulated emission depletion microscopy,STED),另一種是基于單分子成像和定位的方法(如photo activated localization microscopy,PALM).1999年,德國(guó)科學(xué)家Hell和Wichmann[24]基于愛因斯坦受激輻射理論首次實(shí)現(xiàn)了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(STED)[25].通過一束激發(fā)光將熒光分子激發(fā),使基態(tài)粒子躍遷到激發(fā)態(tài),隨后,用另一束環(huán)形STED光照射,使正處于激發(fā)態(tài)的粒子重新回到基態(tài),失去發(fā)射熒光的能力.剩余的可發(fā)射熒光區(qū)被限制在一個(gè)小圓環(huán)范圍內(nèi),相當(dāng)于獲得了一個(gè)小于衍射極限的熒光發(fā)光點(diǎn),進(jìn)而獲得突破傳統(tǒng)衍射極限的超分辨率圖像.

為了克服一個(gè)艾里斑內(nèi)只允許一個(gè)分子發(fā)射熒光的限制,2006年,Betzig等[26]利用光激活綠色熒光蛋白(PA-GFP)的可控?zé)晒忾_關(guān)特性,結(jié)合單分子定位算法,實(shí)現(xiàn)了生物樣本的超分辨成像.他們首先利用低能量的405 nm激光來(lái)稀疏活化PA-GFP,再使用561 nm激光對(duì)活化后的PA-GFP進(jìn)行單分子熒光成像,直至活化后的PA-GFP分子被光漂白.重復(fù)激活-激發(fā)-定位-漂白過程,可以在艾里斑內(nèi)精確地找到大量PA-GFP分子的中心位置,從而重建出一幅由PA-GFP分子中心位置組成的超分辨圖像.這種技術(shù)被稱為光激活定位顯微鏡(PALM).2014年,因在超分辨熒光技術(shù)領(lǐng)域取得的重大成績(jī),Eric Betzig,Stefan W.Hell William E.Moerner獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),體現(xiàn)了光學(xué)成像在科學(xué)發(fā)展中的地位.但是,STED和PALM等技術(shù)仍存在許多不足.例如,PALM只能用來(lái)觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì),而對(duì)于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位則無(wú)能為力.同時(shí),需要注意的是,這些技術(shù)是基于熒光材料,而不是超高分辨率的透鏡,對(duì)于無(wú)法使用熒光標(biāo)記的物體也束手無(wú)策.而且,熒光的使用可能導(dǎo)致生物原始性質(zhì)的改變,并影響其動(dòng)態(tài)過程[27-30].因此,開發(fā)不需要進(jìn)行標(biāo)記的高分辨率透鏡非常關(guān)鍵.

以上對(duì)光學(xué)成像的探索雖然取得了一定的進(jìn)展,或多或少的打破了傳統(tǒng)光學(xué)衍射極限的限制,但上述這些技術(shù)所實(shí)現(xiàn)的分辨率在不同條件下仍被限制在70—100 nm之間.2011年,本課題組洪明輝教授及其博士研究生與李林教授合作,發(fā)現(xiàn)了一種新穎的微球超分辨顯微技術(shù)[31].他們將光學(xué)透明微球(如二氧化硅微球,直徑為2—9μm)放置在所需成像物體的表面,結(jié)合傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡,打破了傳統(tǒng)光學(xué)衍射的極限.在透射模式下,依靠直徑4.74μm的微球,成功分辨了具有50 nm直徑和間隔孔的魚網(wǎng)鍍金陽(yáng)極氧化鋁(anodic aluminum oxide,AAO)膜樣品,在反射模式下清晰地分辨了用于DVD磁盤的GeSbTe(廣泛用于光存儲(chǔ)和電存儲(chǔ)研究的相變材料)薄膜上所帶有的90 nm尺度邊角呈復(fù)雜星形的結(jié)構(gòu).在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,不論反射或透射成像模式,都可以觀察到50 nm的微小樣品.這種新的無(wú)需標(biāo)記且方法簡(jiǎn)單的微球超分辨顯微技術(shù),相對(duì)于之前的光學(xué)顯微技術(shù)有了更進(jìn)一步的突破,吸引了許多研究人員致力于微球超分辨顯微技術(shù)的研究[32-44].

2 微球光學(xué)顯微鏡

微球超分辨顯微效應(yīng)與微球本身的物化性質(zhì)(不同尺寸、材料以及折射率)[45-47]、實(shí)驗(yàn)環(huán)境(不同入射光、微球浸沒或半浸沒)以及樣品本身等因素有關(guān)[48-52].為了進(jìn)一步了解Wang等[31]發(fā)現(xiàn)的微球超顯微分辨技術(shù),Hao等[53]在Wang等人的微球?qū)嶒?yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),發(fā)現(xiàn)當(dāng)把微球半浸沒于液體中時(shí),微球內(nèi)部虛像的對(duì)比度能被極大地增強(qiáng),但將微球完全浸沒于液體時(shí),并沒有獲得預(yù)期的增強(qiáng)效果.圖1為Hao等所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)?zāi)M圖,其實(shí)驗(yàn)裝置包括反射模式下的光學(xué)顯微鏡NIKON Eclipse 80i、樣品(藍(lán)光光盤的芯片,槽脊寬200 nm,槽寬100 nm,如圖2(a))、二氧化硅微球(直徑3μm,折射率1.47)以及乙醇溶液層.

從圖2中可以觀察到,液體半浸沒后微球顯微鏡的能力被明顯增強(qiáng).考慮到乙醇層的揮發(fā)性, Hao等用視頻記錄下了成像的動(dòng)態(tài)過程.當(dāng)乙醇蒸發(fā)至微球一部分暴露時(shí),暗條紋出現(xiàn)在微球體內(nèi),并且逐漸變得清晰,圖像邊界更加尖銳,如圖2(d).當(dāng)乙醇完全蒸發(fā)消失之后,圖像再次變得模糊.他們對(duì)其中的機(jī)理做了詳細(xì)的說(shuō)明.Hao等發(fā)現(xiàn)的微球浸沒后得到的圖像更清晰,對(duì)比度增強(qiáng),分辨率更高,但所帶來(lái)的缺點(diǎn)是放大倍數(shù)的降低.無(wú)浸沒時(shí)3μm二氧化硅微球?qū)λ{(lán)光光盤的成像倍數(shù)為2.7倍,浸沒于乙醇中時(shí),放大倍數(shù)隨浸沒深度的變化相應(yīng)地發(fā)生改變.

圖1 半浸沒微球成像系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)裝置[53]Fig.1.Semi-immersion experimental con fi guration of microsphere-based nanoscope[53].

圖2 通過不同方式產(chǎn)生的藍(lán)光盤表面圖像 (a)掃描電子顯微鏡;(b)具有100×物鏡的光學(xué)顯微鏡;(c)3μm微球;(d)半浸沒在乙醇中的3μm微球[53]Fig.2.Images of the surface of the blue-ray disk generated by di ff erent technical methods：(a)Scanning electron microscope;(b)optical microscope with 100 objective lens;(c)3μm microsphere;(d)3μm microsphere semi-immersed in the ethanol droplet[53].

不同于Wang等[31]使用的2—9μm的二氧化硅微球,Lee等[54]通過與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相結(jié)合研究了更大尺寸的聚苯乙烯微球(直徑為30,50, 100μm)對(duì)圖像分辨率的影響.

在實(shí)驗(yàn)過程中所用的樣品為脊寬180 nm、槽寬120 nm的藍(lán)光光盤(圖3(a))和在石英上具有150 nm直徑點(diǎn)和600 nm間隔的金納米圖案(圖3(b)).微球通過水滴散布在樣品表面,干燥后在反射模式下觀察.

圖3 (a)藍(lán)光盤;(b)石英上的金納米板的SEM圖像[54]Fig.3.Scanning electron microscope(SEM)images of(a)blue-ray disc and(b)gold nano-patterns on quartz[54].

根據(jù)衍射極限的限制,本次實(shí)驗(yàn)所用光學(xué)顯微鏡的分辨極限在300 nm左右.在樣品表面放置微球之后,能清楚地觀察到突破傳統(tǒng)衍射極限的圖案,如圖4所示.對(duì)于不同直徑大小的微球,光學(xué)顯微鏡通過調(diào)整不同的聚焦位置來(lái)獲得最佳的圖像.對(duì)比圖4(d),(e),(f)可以看到,對(duì)于30和50μm的微球,在較大面積成像時(shí),由于相鄰微球之間的重疊干涉而影響超分辨效果.100μm的微球則可以有效避免這種情況,因?yàn)槲⑶蝮w的觀察窗大于光學(xué)顯微鏡的觀察窗,不會(huì)受到相鄰微球的邊界干涉影響.Lee等[54]研究發(fā)現(xiàn)大尺寸微球(直徑大于30μm)也能夠在非浸沒的空氣環(huán)境中實(shí)現(xiàn)超分辨成像,特別是相對(duì)于Wang等[31]研究所用的2—9μm小微球而言,消除了相鄰干涉的影響并實(shí)現(xiàn)了更大范圍的超分辨成像.

此外,他們還發(fā)現(xiàn)放大倍數(shù)與圖像聚焦位置相關(guān).圖5為不同尺寸微球在藍(lán)光光盤上的成像放大倍數(shù)和圖像聚焦位置的折線關(guān)系.在折線圖范圍之外,超分辨成像能力消失.當(dāng)焦點(diǎn)位置遠(yuǎn)離樣品時(shí),放大率上升,但隨之而來(lái)的是分辨率和對(duì)比度的下降.同樣,放大倍數(shù)也取決于微球的尺寸,當(dāng)α=3.0時(shí),30,50,100μm的微球放大倍數(shù)分別為6.5,7.5和8.0倍.由于倏逝波不具有衍射極限,因此成像分辨率很大程度上取決于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡所能放大的倍數(shù)和轉(zhuǎn)換處理圖像的方式.對(duì)于具有300 nm的衍射極限的該特定光學(xué)顯微鏡,在理想情況下約7倍的微球放大將允許光學(xué)顯微鏡觀察到的樣品細(xì)節(jié)達(dá)到43 nm(以300 nm/7來(lái)估算).

圖4 不同直徑微球下藍(lán)光盤(a)—(c)和石英金納米板(d)—(f)的放大圖像 (a)直徑30μm,焦距99μm;(b)直徑50μm,焦距120μm;(c)直徑100μm,焦距300μm;(d)直徑30μm,焦距60μm;(e)直徑50μm,焦距140μm;(f)直徑100μm,焦距200μm[54]Fig.4.Magni fi ed optical images with 30,50,and 100μm diameter PS microspheres in air：The blue-ray disc is resolved with(a)30μm,(b)50μm and(c)100μm PS microspheres when the optical microscope is focused 99,120 and 300μm below the target surface,respectively;the gold nano-patterned quartz is observed with the(d)30μm,(e)50μm and(f)100μm PS microspheres 60,140 and 200μm below the target surface,respectively[54].

圖5 藍(lán)光盤中微球放大因子折線圖 其中α定義為目標(biāo)基板下方的焦點(diǎn)圖像位置除以微球的直徑,折線上圓點(diǎn)為超分辨圖像采樣位置[54]Fig.5. Magni fi cation factor analysis of PS microspheres in the blue-ray disc.α is de fi ned as the α focal image position below the target substrate divided by the diameter of the PS microsphere.The circle spots are sampling positions for super-resolution imaging[54].

在一般的微球顯微效應(yīng)研究中,通常采用同一波長(zhǎng)的光源照射,而改變其他可能影響超顯微效應(yīng)的參數(shù).Lee和Li[55]從理論上研究了光子納米噴射效應(yīng),進(jìn)一步推測(cè)出光源波長(zhǎng)對(duì)成像的影響.他們使用的小球直徑為60μm,折射率為2.2,并浸沒在水中,用波長(zhǎng)分別為400,500,600和700 nm的平面波照射,在四種情況下光強(qiáng)最大處分別得到了0.69λ,0.63λ,0.59λ以及0.62λ的半高全寬(full with at half maximum,FWHM)和5635, 5212,4867,5059 nm的光強(qiáng)最大處與微球表面的距離(distance for the maximum intensity,DMI).由此可見,當(dāng)入射光的波長(zhǎng)改變時(shí),微球仍然具有光子納米噴射效應(yīng),同時(shí)產(chǎn)生了不同的光強(qiáng)分布,對(duì)進(jìn)一步研究微球超分辨顯微效應(yīng)具有指導(dǎo)意義.

3 微球光學(xué)顯微鏡成像效果的拓展

微透鏡具有優(yōu)異的調(diào)節(jié)入射光的能力,能夠產(chǎn)生約一半入射波長(zhǎng)的超過光學(xué)衍射極限的小焦斑.其中,研究最多的微透鏡是微球和微柱.2000年,Lu等[56]通過二氧化硅粒子增強(qiáng)了激光照射.后來(lái),Chen等[57]研究了在平面波照射下微柱體陰影側(cè)的電場(chǎng)增強(qiáng),提出了“光子納米噴射”的概念.光子納米噴射具有優(yōu)異的光學(xué)性能,如非交聯(lián)性、較強(qiáng)的局部電場(chǎng)以及尖銳的焦點(diǎn),能夠應(yīng)用于納米顆粒檢測(cè)、光學(xué)納米光刻和超分辨率成像等領(lǐng)域[58-62].其中,如何獲得更加尖銳的焦點(diǎn)是其關(guān)鍵問題,它體現(xiàn)了微球的聚焦能力.在光學(xué)超分辨成像中,樣品與光子納米噴射相互作用,產(chǎn)生散射波,通過微球傳播并最終成像,將微球的超分辨能力推向新的極限[63].

為了調(diào)整光子納米噴射的傳播距離和波寬,先前的科研團(tuán)隊(duì)采用了很多方法.如：通過組合不同折射率的材料來(lái)調(diào)節(jié)光子納米噴射的傳播距離和聚焦,提出了雙層介質(zhì)微球或不同折射率的微球[64,65];設(shè)計(jì)為半球形的單材料結(jié)構(gòu)[66].雖然在一定程度上提高了傳播距離,但是降低了光子納米噴射的強(qiáng)度.至今為止,通過構(gòu)造表面微結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)整光子納米噴射的方法尚未提出.表面微結(jié)構(gòu)具有改變光路傳播方向的能力,因此本課題組提出了一種通過在傳統(tǒng)微球表面構(gòu)造微結(jié)構(gòu),從而調(diào)諧微球所產(chǎn)生的光子納米噴射的FWHM[67]和工作距離的新方法[68].

圖6 (a)光學(xué)顯微鏡觀察光子納米噴射示意圖,位于物鏡和CCD之間的透鏡表示光學(xué)顯微鏡中的聚焦透鏡;(b)4環(huán)構(gòu)造微球的俯視圖;(c)4環(huán)構(gòu)造微球的側(cè)視圖[68]Fig.6.(a)Schematic of observing photon nano jet (PNJ)by an optical microscope,the lens located between the objective lens and CCD represents for the focusing lenses in the optical microscope,(b)top and (c)side views of a 4 ring microsphere[68].

如圖6所示,微球材料為二氧化硅,微球表面照射處經(jīng)過表面修飾,構(gòu)造出同心環(huán)微結(jié)構(gòu)(同心環(huán)寬為0.25μm).由于微球尺寸小(大約10μm),在實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了薄的金膜以承載小微球,金膜由常規(guī)的UV光刻和金電鍍制成.具體步驟為：利用激光直寫系統(tǒng)(海德堡儀器公司的UPG),在旋涂有530 nm的AZ1518光致抗蝕劑層的100 nm厚鉻基底進(jìn)行光刻;然后,清潔500μm厚的硅晶片,并用薄層的Cr/Au(100 nm/50 nm)作為黏合和電鍍基底;再通過旋涂沉積5μm厚的AZ9260抗蝕劑,然后通過UV光在掩模和鍵合Aligner(Karl Suss, MA8/BA6)中曝光;抗蝕劑顯影后,剩余的抗蝕劑模具用于金電鍍以形成金層,用丙酮和金蝕刻劑除去AZ 9260抗蝕劑和Au鍍層;最后,通過Cr蝕刻將整個(gè)金膜從襯底中釋放出來(lái).將整個(gè)結(jié)構(gòu)浸入稀釋的水中,把微球分散在金膜上,取出后,在環(huán)境氣體中干燥,在FEI DA 300聚焦離子束(FIB)系統(tǒng)下,使用30 kV和50 nA的液態(tài)金屬鎵離子源在微球表面構(gòu)造同心環(huán)結(jié)構(gòu).實(shí)驗(yàn)過程中,控制金膜上的小微球以50 nm的步長(zhǎng)沿Z軸移動(dòng).通過時(shí)域有限差分法( fi nite-di ff erence time-domain, FDTD)模擬,研究同心環(huán)環(huán)數(shù)和深度等因素對(duì)微球光子納米噴射的影響.

首先,我們研究了在數(shù)值模擬中,保持深度一定(1.2μm),通過變化環(huán)數(shù)(0—6環(huán))來(lái)研究其對(duì)光子納米噴射的影響,模擬結(jié)果如圖7所示.

入射光照射在微球頂部,通過同心環(huán),最后聚焦在陰影側(cè).與沒有經(jīng)過表面修飾的微球相比,4環(huán)微球使得光束更加匯聚,如圖7(b)—(d).圖7(e)為環(huán)數(shù)為0—6時(shí)的光子納米噴射的最高強(qiáng)度點(diǎn)沿y軸的分布,可以明顯地觀察到FWHM的縮小.入射光波長(zhǎng)(λ)為405 nm,FWHM從274.2 nm(無(wú)環(huán),0.686λ)降低至182.8 nm(6環(huán),0.457λ),降低了33.3%.環(huán)數(shù)從變化到3時(shí),FWHM快速下降,當(dāng)環(huán)數(shù)為4時(shí),FWHM為194.3 nm(0.486λ),相對(duì)無(wú)環(huán)降低了29.1%.雖然FWHM下降明顯,但是從圖中我們可以看到,光強(qiáng)和工作距離也隨之減少.因此,為了平衡工作距離以及FWHM,我們選擇4環(huán)微球進(jìn)行更進(jìn)一步的模擬和實(shí)驗(yàn).環(huán)深度為微球表面到環(huán)底部的距離,將環(huán)數(shù)固定為4后,我們繼續(xù)研究環(huán)深度對(duì)FWHM和工作距離的影響.

圖8為環(huán)數(shù)4的不同環(huán)深(0—1.6μm)產(chǎn)生的光子納米噴射的FDTD模擬.其中,沒有環(huán)時(shí),微球產(chǎn)生的FWHM為274.2 nm(0.686λ).相比之下,當(dāng)環(huán)深度為1.2μm時(shí),FWHM可以被調(diào)制到194.3 nm(0.486λ),減少了29.1%.圖8(f)為不同環(huán)深下光子納米噴射的工作距離和FWHM折線關(guān)系圖,可以觀察到,環(huán)深度較淺時(shí)(0.2—0.6μm)時(shí),對(duì)應(yīng)的工作距離較長(zhǎng),FWHM較大(約260 nm),環(huán)深在1—2μm時(shí),工作距離較短,FWHM較小(約200 nm).可以得出結(jié)論,最小FWHM可以在0.8μm的深度處實(shí)現(xiàn).當(dāng)深度淺于0.8μm時(shí), FWHM和工作距離的變化不明顯.當(dāng)深度大于0.8μm時(shí),工作距離沒有顯著變化,但是FWHM略有增加.在淺深度(1.0μm)進(jìn)行的調(diào)制足以實(shí)現(xiàn)尖銳的光子納米噴射.從結(jié)果可以總結(jié),蝕刻深度在0.8—1.4μm之間可以產(chǎn)生清晰的聚焦,并且平均工作距離約為0.8μm.因此,我們選擇1.2μm的環(huán)深度以在實(shí)驗(yàn)上評(píng)價(jià)聚焦能力.

圖7 0—6環(huán)構(gòu)造微球下產(chǎn)生的光子納米噴射 (a)表面構(gòu)造微球的橫截面視圖;(b)—(d)在Y Z平面中具有,2和4個(gè)環(huán)的微球的光強(qiáng)分布;(e)在光子納米噴射的最高強(qiáng)度點(diǎn)處沿y軸的光強(qiáng)度分布;(f)FWHM和工作距離與環(huán)數(shù)的關(guān)系[68]Fig.7.PNJ generated by CRMS with 0 to 6 etched rings on the illumination side of CRMS：(a)Cross-section view of the CRMS;(b)–(d)light intensity distribution of CRMS with 0, 2 and 4 rings in the Y Z plane;(e)light intensity distribution along y axis at the highest intensity points of the PNJ; (f)dependence of FWHM and working distance of the PNJ on ring number[68].

為了驗(yàn)證具有表面微結(jié)構(gòu)的微球成像的功能,我們通過光學(xué)顯微鏡直接觀察光子納米噴射,以便于比較具有和不具有表面修飾微球所產(chǎn)生的效果.圖9(a)—(c)分別為環(huán)深1.2μm的4環(huán),單環(huán)微球和普通無(wú)構(gòu)造微球.圖9(d)—(f)為沿Z軸步長(zhǎng)50 nm下所采集的10個(gè)光強(qiáng)分布的原始圖像,可以看出,工作距離隨環(huán)數(shù)減少,這與模擬結(jié)果一致.具有4環(huán)的表面構(gòu)造微球產(chǎn)生的光子納米噴射的FWHM比單環(huán)以及普通微球更加尖銳.對(duì)于4環(huán)構(gòu)型,觀察到247.1 nm的FWHM,與僅由微球體(343.1 nm)獲得的結(jié)果相比,實(shí)現(xiàn)了FWHM的顯著降低(28.0%).

圖8 環(huán)深由變化至1.6μm下微球產(chǎn)生的光子納米噴射的FDTD模擬[68]Fig.8.FDTD simulation of PNJs generated by microspheres with ring depth changed from 0 to 1.6μm[68].

圖9 在405 nm激光照射下(a)4環(huán),(b)單環(huán)和(c)普通微球產(chǎn)生的光子納米噴射的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;(d)4環(huán),(e)1環(huán)和(f)普通微球在Z軸上以50 nm間隔拍攝的10個(gè)圖像;(g),(h),(i)為沿水平方向3種微球的強(qiáng)度分布[68]Fig.9.Experimental results of the PNJ generated under 405 nm laser illumination by(a)4 rings,(b)single ring microsphere and(c)microsphere only;10 raw images of light intensity distribution along Z axis for (d)4 ring microsphere;(e)1 ring microsphere and(f)microsphere only are listed;the images are taken with a separation of 50 nm in Z axis,10 images are chosen for each con fi guration to show the change at the focal plane;the intensity distributions along horizontal direction are plotted in(g),(h)and(i),respectively[68].

在以上的研究工作中,我們提出了表面構(gòu)造來(lái)調(diào)節(jié)微球光子納米噴射的新方法,通過具有表面修飾同心環(huán)的二氧化硅微球,研究了所產(chǎn)生的光子納米噴射的FWHM和環(huán)數(shù)以及環(huán)深的關(guān)系.在4環(huán)1.2μm得到了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并與模擬仿真結(jié)果一致.但是,由于環(huán)調(diào)節(jié)光束的傳播方向所帶來(lái)的散射效應(yīng),導(dǎo)致工作距離與光強(qiáng)也相應(yīng)減少.

此外,本課題組還提出了一種新的通過微球表面中心覆蓋來(lái)調(diào)節(jié)入射光,實(shí)現(xiàn)尖銳光子納米噴射的方法[69].我們?cè)谖⑶蛘丈鋫?cè)表面的中心設(shè)計(jì)一層掩膜,作為過濾器,有選擇性地將原始的入射光束引入到微球之中,實(shí)現(xiàn)光子納米噴射的FWHM和工作距離的改變.為了在微球表面沉積鉑層作為掩膜,在FEI DA 300聚焦離子束系統(tǒng)下,使用30 kV和50 nA的液態(tài)金屬鎵離子源,在微球頂部制造約1μm厚的具有不同直徑的鉑層,在FIB制造期間,掩膜圖案的中心與微球的光軸對(duì)準(zhǔn).為了表征中心覆蓋微球所產(chǎn)生的光子納米噴射,我們構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)裝置,應(yīng)用低功率He-Ne 633 nm線偏振激光器(MellesGriot,25-LHP-925-230)作為入射光源.應(yīng)用半波片來(lái)形成光束的線性偏振,并且使用衰減器來(lái)將激光強(qiáng)度調(diào)諧到期望的亮度.為了操作三維工程微球,制成薄金膜(該金膜制作過程與上文相同),起到微球透鏡支架的作用.金膜的厚度約為5μm,金膜孔與微球的直徑相匹配.在表征實(shí)驗(yàn)期間,單一微球被置于照射光束下.為了記錄光子納米噴射的x-y平面反射模式,使用了高倍數(shù)物鏡(Olympus,LMPlan Apo 150×,NA 0.9)和高分辨率互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)相機(jī)(尼康數(shù)碼單反相機(jī)FX格式CMOS傳感器,4908×3264像素).在表征之前,進(jìn)行CMOS相機(jī)的像素尺寸的校準(zhǔn).測(cè)試樣品使用前經(jīng)過掃描電子顯微鏡(SEM)檢查.通過校準(zhǔn)SEM和光學(xué)圖像中的長(zhǎng)度,可以獲得CMOS相機(jī)的每個(gè)像素的大小.光子納米噴射的橫截面在焦平面附近被俘獲.對(duì)于每個(gè)覆蓋率,制造三個(gè)微球體.基于多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)了最終的結(jié)果(本部分中其他實(shí)驗(yàn)的表征系統(tǒng)與此實(shí)驗(yàn)相同).最終實(shí)現(xiàn)在633 nm波長(zhǎng)的平面波照射下,得到了245 nm(0.387λ)的焦點(diǎn).

圖10為通過線性偏振光照射后中心覆蓋掩膜的微球聚焦示意圖.其中,微球直徑為10μm,折射率1.5.入射光是波長(zhǎng)為633 nm的沿z軸指示方向照射的平面波.厚約1μm的鉑沉積在微球表面,作為中心覆蓋的掩膜.當(dāng)覆蓋的掩膜引入微球照射側(cè)中心后,在入射光軸附近的光線被反射,因此,只允許與光軸相距較遠(yuǎn)的光線通過.根據(jù)光傳輸和反射的斯涅耳定律,更遠(yuǎn)離光軸傳播的入射光束將聚焦在微球體的表面附近.這些光束經(jīng)微球聚焦后,與光軸形成不同的角度.焦斑的強(qiáng)度被計(jì)算為最小角度到最大角度的積分.注意到經(jīng)微球聚焦之后,離光軸較近的光束與光軸形成的角度小,和具有低數(shù)值孔徑(numerical aperture,NA)的聚焦透鏡相似,在低NA下,焦斑的工作距離較長(zhǎng),尺寸較大.而對(duì)于遠(yuǎn)離光軸的光束而言,聚焦現(xiàn)象類似于高NA的聚焦,入射光束經(jīng)過微球形成相對(duì)更加尖銳的焦點(diǎn),工作距離短.我們?cè)谖⑶蛏显O(shè)計(jì)了中心覆蓋的掩膜來(lái)調(diào)整光子納米噴射,為了進(jìn)一步的研究,提出了覆蓋率的概念(俯視圖下：覆蓋率=掩膜半徑/微球半徑),研究不同覆蓋率下調(diào)整入射光束所得到的效果.當(dāng)覆蓋率改變時(shí),進(jìn)入微球的入射光量也相應(yīng)改變,在大覆蓋率下,只有薄環(huán)形光束被微球聚焦.為了評(píng)估在X軸線性偏振聚焦束下中心覆蓋微球的性能,我們使用了3D FDTD進(jìn)行模擬,并在Y Z平面收集結(jié)果.在微球邊界外沿著光軸的最高強(qiáng)度點(diǎn)處討論光子納米噴射的FWHM和工作距離.線性偏振的模擬結(jié)果如圖11所示.

圖10 用于線性偏振光束的超聚焦中心包覆微球的設(shè)計(jì)[69]Fig.10. Design of the center-covered microsphere for super-focusing of linear polarized beam[69].

無(wú)任何覆蓋層時(shí),在633 nm入射光照射下產(chǎn)生的FWHM為424.11 nm(0.67λ).覆蓋率增加時(shí), FWHM降低并且逐漸獲得低于衍射極限(0.5λ)的FWHM.在較大覆蓋率下(0.6—0.8)時(shí),只有薄環(huán)形光束能夠通過微球體并聚焦,得到的FWHM約為259.57—208.33 nm,觀察到了尖銳的焦點(diǎn)和較大的旁瓣.在覆蓋率為0.8時(shí)得到了0.33λ的尖銳焦點(diǎn).微球覆蓋率增加時(shí),工作距離減少,如圖11(b),使得光子納米噴射更加接近微球陰影側(cè)表面.同時(shí),由于鉑覆蓋層的存在,減少了微球中光束的通過量,導(dǎo)致光子納米噴射的強(qiáng)度降低.我們對(duì)此進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證.

圖11 (a)不同覆蓋率下FWHM/λ的模擬結(jié)果;(b)不同覆蓋率下工作距離(WD)的模擬結(jié)果[69]Fig.11.(a)Simulated FWHM/λ value for di ff erent cover ratios;(b)simulated working distance(WD)for di ff erent cover ratios[69].

圖12(a)為各個(gè)覆蓋率下實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模擬結(jié)果的對(duì)比圖,表面覆蓋率從0增加到0.78,步長(zhǎng)約為0.13.覆蓋率為時(shí),測(cè)得410 nm(0.647λ)的FWHM,與模擬結(jié)果相似.隨著覆蓋率的上升,光子納米噴射所產(chǎn)生的焦斑尺寸減小,呈下降趨勢(shì).當(dāng)覆蓋率超過0.603時(shí),實(shí)現(xiàn)了中心覆蓋微球的超聚焦效應(yīng).從圖12(b)中可以觀察到,覆蓋率為0時(shí),沒有旁瓣產(chǎn)生,而當(dāng)覆蓋率增加到0.78時(shí),旁瓣增大,強(qiáng)度分布類似于貝塞爾光束(Bessel beam)[70-72].

雖然在微球表面構(gòu)造同心環(huán)和中心沉積鉑覆蓋的方法都實(shí)現(xiàn)了較好的FWHM的降低以及工作距離和強(qiáng)度的改變.然而,這些結(jié)構(gòu)制造復(fù)雜,并且無(wú)法進(jìn)行動(dòng)態(tài)自動(dòng)調(diào)整.于是,我們提出了一種通過改變溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)整FWHM的方法,并且無(wú)需改變微球參數(shù).我們將微球進(jìn)行簡(jiǎn)單處理,用二氧化釩涂覆在微球照射側(cè)半球之上.二氧化釩是一種相變材料,相變溫度為68°C.在68°C以下時(shí),二氧化釩為半導(dǎo)體,溫度升高至68°C以上,發(fā)生相變,變?yōu)榻鹣嗖牧?隨相變帶來(lái)的是折射率的改變[73-75].對(duì)比其他相變材料,二氧化釩相變溫度低,相變能夠輕易實(shí)現(xiàn),且相變可逆,反應(yīng)快速,無(wú)明顯滯后現(xiàn)象.同時(shí),由于較低的相變溫度以及所使用的玻璃微球的熱膨脹系數(shù)較低,可以忽略微球熱脹冷縮所帶來(lái)的影響,因此,二氧化釩被認(rèn)為是一種合適的微球表面涂覆材料.理論上,我們認(rèn)為表面涂覆材料折射率隨溫度的改變從而能夠?qū)е鹿庾蛹{米噴射的FWHM,工作距離和強(qiáng)度發(fā)生變化,并進(jìn)一步進(jìn)行了仿真模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,研究涂覆層厚度和微球參數(shù)之間的關(guān)系對(duì)結(jié)果的影響.

圖12 中心覆蓋微球在不同覆蓋率下光束尺寸的模擬和實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (a)光子納米噴射器的束寬度與覆蓋率的關(guān)系; (b)由CMOS照相機(jī)俘獲的光子納米噴射器沿光軸的橫截面的歸一化強(qiáng)度分布[69]Fig.12.Simulation and experimental results of the beam size for center-covered engineered microspheres at di ff erent cover ratios：(a)Dependence of the beam width of the photonic nanojet on cover ratio;(b)normalized intensity distribution of the cross-section of the photonic nanojet along the optical axis captured by the CMOS camera[69].

仿真原理如圖13所示,二氧化釩只涂覆在微球入射側(cè),因?yàn)楦邷叵露趸C具有金屬性質(zhì),不在陰影側(cè)涂覆是為了防止發(fā)生微球內(nèi)反射.所用入射光波長(zhǎng)為800 nm.光束主要通過二氧化釩涂層從頂表面進(jìn)入微球體,一部分通過涂層邊緣衍射而穿過微球體側(cè)面進(jìn)入微球體.二氧化釩通過兩種途徑來(lái)調(diào)節(jié)光子納米噴射,一方面首先是折射率的改變,另一方面則是二氧化釩變?yōu)榻饘傧嗪?增加了涂層對(duì)光的吸收,從而改變了微球內(nèi)部的光強(qiáng)度.

圖13 光照射方向涂覆二氧化釩的微球示意圖[76]Fig.13.Schematic of VO2-coated microsphere with direction of illumination indicated[76].

如圖14所示為不同涂覆厚度下光子納米噴射分別在20°C(相變前)和90°C(相變后)的FWHM,工作距離和強(qiáng)度的關(guān)系折線圖.可以觀察到當(dāng)涂覆厚度達(dá)到140 nm時(shí),FWHM從溫度20°C升高至90°C后變化明顯.但當(dāng)涂覆厚度過厚時(shí)(超過150 nm),工作距離為負(fù),即在微球體內(nèi)部聚焦,且整個(gè)涂層幾乎不透明,導(dǎo)致入射光強(qiáng)度大大降低.因此經(jīng)過綜合考慮,確定75 nm厚度的涂覆層較為合適.

同時(shí),在確定涂覆厚度為75 nm的情況下,本課題組研究了最適合用于調(diào)節(jié)光子納米噴射的FWHM的微球的直徑和折射率,模擬結(jié)果如圖15所示.從圖15(a)可以觀察到,光強(qiáng)度和微球直徑成正比,這是因?yàn)殡S著直徑增大,微球所暴露出來(lái)的面積更大,能夠吸收更多的光束通過而形成聚焦.在直徑為5μm時(shí),FWHM隨涂覆層溫度變化下降明顯,綜合考慮后,認(rèn)為4μm或5μm為比較合適的微球尺寸.微球的折射率是影響光子納米噴射的關(guān)鍵的參數(shù),我們?cè)诖_定涂覆二氧化釩厚度75 nm、微球直徑5μm的前提下,進(jìn)行了進(jìn)一步模擬,研究微球折射率變化所帶來(lái)的光子納米噴射的FWHM以及工作距離和強(qiáng)度隨涂覆層相變而帶來(lái)的改變.折射率增加時(shí),FWHM變得更窄,工作距離變短,強(qiáng)度上升.當(dāng)折射率過大(大于1.55時(shí)),光子納米噴射在微球體內(nèi)發(fā)生,如圖15(b)中間圖小方框所示,工作距離為負(fù)值.類似地,我們認(rèn)為折射率1.5時(shí)所帶來(lái)的FWHM和工作距離的改變較為合適.

為了進(jìn)一步降低二氧化釩相變后光子納米噴射的FWHM和工作距離,進(jìn)行了射線分析,分析結(jié)果與FDTD模擬結(jié)果一致.我們通過在直徑為5μm、折射率為1.5的微球上涂覆75 nm厚的二氧化釩涂覆層,應(yīng)用二氧化釩材料隨溫度變化的相變特性,實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)調(diào)節(jié)光子納米噴射的功能,對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)超分辨率成像具有重要意義[76].

圖14 涂覆厚度在0—200 nm下光子納米噴射對(duì)應(yīng)的(a)FWHM,(b)WD,(c)強(qiáng)度;垂線右側(cè)點(diǎn)為聚焦在微球內(nèi)部的點(diǎn)[76]Fig.14.(a)FWHM,(b)WD and(c)intensity of the PNJ versus thickness of VO2coating(nm).Points to the right of the vertical line are points where the focus spot occurs inside the micro-sphere.Thickness of the coating layer varies from 0 to 200 nm[76].

4 成像機(jī)理

微球的成像機(jī)理在全世界引起了熱議.有觀點(diǎn)提出微球超分辨顯微技術(shù)是通過將倏逝波轉(zhuǎn)化為傳播波來(lái)提高分辨率以打破光學(xué)衍射極限[50,77],其機(jī)理與亥姆霍茲方程[78]有關(guān).在均相介質(zhì)中：

圖15 (a)光子納米噴射的FWHM,工作距離和強(qiáng)度與微球直徑的關(guān)系,直徑為3—8μm;(b)光子納米噴射的FWHM,工作距離和強(qiáng)度與微球折射率的關(guān)系,折射率為1.3—1.6,藍(lán)框內(nèi)光子納米噴射發(fā)生在微球內(nèi)部[76]Fig.15.(a)FWHM,WD and Intensity of the PNJ versus diameter of the microsphere,diameter varies from 3.0 to 8.0μm; (b)FWHM,WD and Intensity of the PNJ versus refractive index of the microsphere,the refractive index of the microsphere varies from 1.3 to 1.6,the boxed-up area indicates the points where the PNJ occurs within the microsphere[76].

其中k0=(2πn)/λ;n為折射率;kx,ky,kz為波矢分量.倏逝波可以被獲得,當(dāng)

隨著z方向上波的倏減,kz可忽略不計(jì).當(dāng)波矢分量在x和y平面上增加,或者λ的值減少時(shí),分辨率提高,結(jié)果導(dǎo)致倏逝波也同時(shí)倏減.微球超分辨顯微技術(shù)可以通過將倏逝波轉(zhuǎn)化為傳播波來(lái)突破這些限制.在微球光學(xué)納米顯微鏡中,電磁(EM)場(chǎng)(E(x,y))由微球以外的成像平面來(lái)調(diào)節(jié).它被轉(zhuǎn)化為

其中變換函數(shù)G(x,y)和E′(x,y)可以通過幾何光學(xué)和微球的成像平面計(jì)算,G(x,y)表示微球外成像平面從物體平面到某一特定平面的轉(zhuǎn)換.超分辨效應(yīng)可以通過分析空間波矢坐標(biāo)來(lái)解釋.通過傅里葉變換,G(x,y)可以表示為波矢空間坐標(biāo)

傅里葉振幅A(kx,ky)由E(x,y)的傅里葉逆來(lái)確定,為

其中kx和ky為x和y方向的波矢分量,E′(x,y), E(x,y)和G(x,y)分別由(3),(4),(5)式得出.由E′(kx,ky)可以得到

空間波矢量傳遞函數(shù)G(kx,ky)和A(kx,ky)的卷積導(dǎo)致空間波矢量的拓展.因此,物體平面中的倏逝波通過卷積變換到傳播波,波矢的拓展顯著地受到具有非常寬范圍坐標(biāo)(kx,ky)的G(kx,ky)影響.

垂直于平坦且平滑的金屬邊界平面入射的平面電磁場(chǎng)是均勻反射平面波的折射.在微球光納米顯微鏡中,物平面在某些點(diǎn)處彎曲,其中物體具有凹和凸表面.在凸表面,反射電磁波束是發(fā)散的,因此減小了在這些點(diǎn)附近的電磁場(chǎng)強(qiáng)度.而在凹表面,反射電磁波匯聚,因此增加了這些點(diǎn)附近的電磁場(chǎng)強(qiáng)度.在物平面附近的反射電磁場(chǎng)具有對(duì)應(yīng)于物體曲率屬性的可變電磁場(chǎng)強(qiáng)度.

對(duì)于穿過物平面的透射電磁場(chǎng)發(fā)生類似的效應(yīng),其中凸和凹表面影響物平面附近的電磁場(chǎng)分布.凹面導(dǎo)致透射電磁波束的匯聚,而凸面導(dǎo)致光束發(fā)散.這種效應(yīng)導(dǎo)致物體的電磁成像,包括它們的精細(xì)結(jié)構(gòu),可以遠(yuǎn)小于波長(zhǎng).因此,超分辨率成像通過由微球收集的這種電磁波實(shí)現(xiàn),其吸收倏逝波并將其轉(zhuǎn)換成傳播波.

另外,從幾何光學(xué)角度分析微球透鏡的光學(xué)成像特性及其與常規(guī)顯微物鏡配合實(shí)現(xiàn)高分辨顯微的成像原理[79],如圖16所示.

圖16 基于微球的高分辯成像原理圖 (a)微球及其成像特性圖解;(b)微球與常規(guī)顯微物鏡配合的高分辨率(高倍率)顯微成像示意圖[79]Fig.16. High-resolution imaging of microspheres based on microspheres：(a)Microspheres and their imaging characteristics;(b)high-resolution(high magni fi cation)micrographs of microspheres with conventional microscopic spectroscopy[79].

圖16(a)中,設(shè)微球透鏡的焦距為f′,折射率n,半徑為r,則有

根據(jù)物距l(xiāng),像距l(xiāng)′和焦距f′的關(guān)系式

可以推導(dǎo)出微球的成像放大倍率M,

當(dāng)微球處于樣品表面時(shí),如圖16(b),d=0,物距l(xiāng)為

將(7)式與(10)式代入(9)式,可得

由(11)式可知,當(dāng)樣品位于微球下端面時(shí),微球?qū)悠返姆糯蟊堵蔒與微球直徑(或半徑r)無(wú)關(guān).

假設(shè)已知二氧化硅微球的折射率約為n= 1.46,計(jì)算得到M=2.7.若采用二氧化硅微球,可預(yù)先將樣品的微納米結(jié)構(gòu)放大約2.7倍(一次放大);然后,經(jīng)過后續(xù)的常規(guī)顯微物鏡接收,再將微球視場(chǎng)內(nèi)的樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)一步放大(二次放大),從而獲得比采用相同顯微物鏡時(shí)更高的放大倍率和更高的分辨率,為實(shí)現(xiàn)微納米樣品的超分辨成像提供了新途徑.

此外,2016年,Yang等[80]提出微球超分辨成像是由光子納米噴射的腰部(即最小FWHM處)決定的概念,用一種定量的方式描述光子納米噴射對(duì)于超分辨率成像的作用,如圖17所示.首先,使用有限元法(FEM)對(duì)被不同尺寸微球匯聚的光進(jìn)行系統(tǒng)的數(shù)值研究,使納米噴射形成于微球的后表面,并且將微球的理論放大系數(shù)與光子納米噴射的光聚焦能力相關(guān)聯(lián).

圖17 納米噴射的生成概念[80]Fig.17.Concept of the nanojet generation[80].

當(dāng)入射光源照射微球時(shí),位于微球左側(cè)和微球右側(cè)的平行波矢分量相互干涉而消除,而垂直波矢分量由于左右側(cè)的疊加作用,使得光子納米噴射沿波傳播方向進(jìn)一步延伸.他們運(yùn)用波長(zhǎng)600 nm的光源,在水介質(zhì)(折射率1.33)中進(jìn)行通過直徑為2—20μm的鈦酸鋇玻璃微球(折射率1.92)的光波傳播有限元研究.

如圖18所示,當(dāng)微球直徑為6μm時(shí),光子納米噴射匯聚在微球下表面;當(dāng)微球直徑增加到16μm時(shí),納米噴射聚焦在微球下表面外;微球直徑減少到2μm時(shí),納米噴射聚焦在微球內(nèi)部.為了定量研究光是如何由微球聚焦從而產(chǎn)生光子納米噴射這個(gè)問題,他們將從微球上表面處進(jìn)入的折射光的線性區(qū)域記為L(zhǎng),下表面處出射光束的寬度記作l,光子納米噴射的腰部記作w.

圖18 (a),(b),(c)分別為光通過水中2,6和16μm鈦酸鋇微球的有限元模擬[80]Fig.18.(a),(b)and(c)FEM simulation of the light propagation through a 6,2,16μm barium titanate microsphere in water,respectively[80].

圖19 微球的成像機(jī)理[80]Fig.19.Imaging mechanism of a dielectric microsphere[80].

圖19示意了微球的成像機(jī)理,當(dāng)被微球聚焦的光照射樣品時(shí),不產(chǎn)生納米噴射,而是遵循反射光的光學(xué)反射對(duì)稱路徑.當(dāng)微球與光柵之間的距離h足夠小時(shí),包含物體高頻空間信息的倏逝波被轉(zhuǎn)換為微球內(nèi)的傳播波.同時(shí),在遠(yuǎn)場(chǎng)中產(chǎn)生放大因子為M的虛像.由于涉及的相同的光學(xué)路徑,數(shù)值研究中,微球的成像能力與聚焦光子納米噴射的形成直接相關(guān).

如圖20所示,分別描述了由比率L/l表示的微球光聚焦能力和由w/λ表示的光子納米噴射的腰部分別與微球直徑的函數(shù).較大的L/l表示微球更好的光聚焦并且對(duì)應(yīng)于納米噴射的較小腰部.根據(jù)模擬分析,直徑為6μm的微球顯示出最佳的光聚焦能力和最小的光子納米噴射的腰部.

圖20 (a)微球直徑和比率L/l表示的聚焦能力的有限元模擬結(jié)果;(b)微球直徑和光子納米噴射腰部與波長(zhǎng)比率的有限元模擬結(jié)果;圖中黑點(diǎn)為模擬所得,紅線為指示線[80]Fig.20.(a)FEM simulation results of the light focusing capability of a microsphere,expressed by the ratio L/l,as a function of the microsphere diameter;(b)FEM simulation results of the normalized waist of the photonic nanojet w/λ,as a function of the microsphere diameter.The dots are obtained from the simulation,while the red dotted line is a guide to the eye[80].

同時(shí),進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,如圖21所示,將實(shí)驗(yàn)獲得的放大因子M與從模擬獲得的理論光聚焦能力L/l進(jìn)行比較時(shí),獲得與Pearson相關(guān)系數(shù)(反映兩個(gè)變量線性相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)量,絕對(duì)值越大,相關(guān)性越強(qiáng))為0.91的正相關(guān),表明微球具有更好的光聚焦能力,可以獲得更高的放大系數(shù).

圖21 (a)實(shí)驗(yàn)所得放大因子與微球直徑關(guān)系圖;(b)實(shí)驗(yàn)放大因子與模擬所得的表示光聚焦能力的比率L/l關(guān)系圖;實(shí)線代表Pearson相關(guān)系數(shù)為0.91的線性擬合曲線[80]Fig.21.(a)The dots represent the experimental magni fi cation factor as a function of the microsphere diameter, while the solid line is a guide to the eye;(b)the experimental magni fi cation factor M as a function of the light focusing capability L/l obtained from the simulations.The solid line represents a linear fi tting curve with a Pearson’s correlation coefficient of 0.91[80].

最后,使用點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)獲得了與系統(tǒng)的真實(shí)分辨率相關(guān)的實(shí)際圖像標(biāo)準(zhǔn)偏差σ與微球尺寸的函數(shù)關(guān)系和σ與w/λ之間的相關(guān)性,如圖22所示.并由實(shí)線擬合,得到了代表Pearson相關(guān)系數(shù)為0.88的線性擬合曲線.從邏輯上進(jìn)一步說(shuō)明了光子納米噴射的半高全寬越小,與真實(shí)圖像分辨率相關(guān)的圖像標(biāo)準(zhǔn)差越小,即分辨率越高.他們通過理論模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,從光子納米噴射的聚焦角度闡述了微球超分辨成像的機(jī)理.

圖22 (a)系統(tǒng)真實(shí)分辨率相關(guān)擬合獲得的實(shí)際圖像標(biāo)準(zhǔn)偏差與微球尺寸關(guān)系;(b)圖像標(biāo)準(zhǔn)差與光子納米噴射腰部和波長(zhǎng)比率的關(guān)系;實(shí)線代表Pearson相關(guān)系數(shù)為0.88的線性擬合曲線[80]Fig.22.(a)Actual image standard deviation σ obtained from the fi t,related to the true resolution of the system,as a function of microsphere size,the dots are obtained from the fi ts with the analytical model,while the solid curve is a guide to the eye;(b)the correlation between σ and the normalized waist of the photonic nanojet w/λ;the solid line represents a linear fi tting curve with a Pearson’s correlation coefficient of 0.88[80].

5 總結(jié)與未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)

微球超分辨成像雖然簡(jiǎn)單方便,但同時(shí)也存在著一些固有的缺陷.通常,微球被放置在樣品表面而無(wú)法被控制,導(dǎo)致單個(gè)微球無(wú)法對(duì)大面積樣品進(jìn)行成像.一種解決這個(gè)問題的直接簡(jiǎn)單的方法就是增加樣品表面微球的數(shù)目.然而,在高密度的微球下,微球傾向于聚集并且軸向重疊,反而不利于光學(xué)性能的發(fā)揮.即使光線照射表面微球能夠產(chǎn)生周期性的納米圖案,納米結(jié)構(gòu)的最小距離仍然受到微球直徑的限制[81].先前其他的嘗試包括使用光學(xué)鑷子來(lái)平移微球[82,83],或者使用放置在XY Z平臺(tái)上的玻璃微量移液管[33].然而,光學(xué)俘獲所需裝置的復(fù)雜性和玻璃的脆弱性以及潛在的微吸管破裂使得這些方法難以實(shí)施.因此,如何控制微球的位置[84]是未來(lái)微球超顯微技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一.

進(jìn)行微球成像時(shí),一般將微球直接浸入液體中.Darafsheh等[85]提出了一種蓋玻片形式的固體浸沒微球超透鏡的設(shè)計(jì).他們將高折射率微球嵌入在透明彈性的固化膜中,嵌入在固化膜中的優(yōu)點(diǎn)是可以提前制備,且成像能在倒置顯微鏡中進(jìn)行,同時(shí)消除了一般情況下微球浸入液體后液體蒸發(fā)導(dǎo)致對(duì)成像的影響[86].該固化膜制備如下：先將碳酸鋇微球置放在蓋玻片基底上,然后將折射率為1.41的液態(tài)聚二甲基硅氧烷和比例為1：10的硬化復(fù)合物旋涂在微球上,根據(jù)旋涂的速度和時(shí)間可以調(diào)整膜的厚度,最后在65°C下烘烤1 h即可獲得.他們用這種方法制備了厚度約300μm的薄膜,實(shí)現(xiàn)了人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞成像.這種類蓋玻片的設(shè)計(jì)的厚度足夠小,能使樣品直接插入常規(guī)顯微鏡和樣品之間的間隙中.球形透鏡現(xiàn)在可以重復(fù)使用,并且整個(gè)透鏡可以根據(jù)用戶的需要容易地進(jìn)行定位和操作,由于分離微球和環(huán)境的封裝,使得新的透鏡對(duì)于環(huán)境變化的敏感度降低,這種新穎的設(shè)計(jì)方法具有很大的商業(yè)價(jià)值.

圖23 片上微流體納米顯微鏡通過整合納米顯微鏡與微流體的新設(shè)計(jì),為實(shí)時(shí)高分辨率直接成像和分析生物樣品,包括病毒提供一個(gè)獨(dú)特的平臺(tái)[87]Fig.23.Proposed new on-chip micro fl udic nanoscope formed by integrating nanoscope with micro fl udics, providing a unique platform for real-time high resolution direct imaging and analysis of bio-samples,including viruses[87].

微球超顯微技術(shù)簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)、無(wú)標(biāo)記且分辨率高.微球超透鏡尺寸下,能非常自然地與其他微系統(tǒng)集成,形成具有新功能的設(shè)備.例如, Wang[87]將微球連接在內(nèi)窺鏡的最末端,獲得了λ/5的分辨率;Yan等[63]將二氧化硅微球,聚苯乙烯微球與激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合,在波長(zhǎng)為408 nm的照射光下獲得了25 nm的分辨率.

如圖23所示,微球超透鏡被封裝、對(duì)準(zhǔn)和定位在微流體通道的頂部,諸如細(xì)胞/病毒等對(duì)象可以流過通道,其高分辨率圖像可以實(shí)時(shí)投影到外部.用電等距流可以驅(qū)動(dòng)生物物質(zhì)沿著通道移動(dòng),并使用介電電泳力來(lái)停止和俘獲特定位置處的細(xì)胞/病毒.并且,當(dāng)它們與藥物作用時(shí),科研人員可以通過這種方式研究細(xì)胞和病毒的實(shí)時(shí)反映.除了超透鏡成像之外,超透鏡產(chǎn)品還可在納米激光、納米光刻、納米太陽(yáng)能聚光器以及納米化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域中找到應(yīng)用.

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29 March 2017;revised manuscript

16 May 2017)

In the field of optical imaging,the conventional imaging resolution is about 200 nm due to the di ff raction limit. The higher resolution is urgently needed for further developing scienti fi c research.Therefore,how to break through this limitation to acquire high quality and high resolution image has become a hot research topic.The microspheres with the size of tens of micrometers exhibit the ability to improve the imaging resolution of the conventional optical microscope by locating them directly on the sample surface.Due to its simplicity,the microsphere optical nanoscope technology is widely studied.This paper introduces the research background of the optical microscope and the research progress of microsphere optical nanoscope technology.At the same time,approaches to adjusting the photonic nanojet generated by the microspheres by fabricating concentric ringing,central mask,and surface coating of microspheres are reviewed. The possible reasons for this improved resolution are discussed.The applications and development of the microsphere ultra-microscopic technology in the future are discussed.

optical microscope,microsphere super-resolution,photonic nanojet

:07.60.Pb,07.60.—j,42.79.Bh

10.7498/aps.66.140702

?國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)：2013CBA01703)、國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：61605162)、福建省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：2017J05106)、中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所微細(xì)加工光學(xué)技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(KFS4)和福建省高端裝備制造協(xié)同創(chuàng)新中心資助的課題.

#共同第一作者.

?通信作者.E-mail：rzhou2@xmu.edu.cn

?通信作者.E-mail：elehmh@nus.edu.sg

?2017中國(guó)物理學(xué)會(huì)Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Basic Research Program of China(Grant No.2013CBA01703),the National Natural Science Foundation of China(Grant No.61605162),the Natural Science Foundation of Fujian Province of China(Grant No. 2017J05106),the State Key Laboratory of Optical Technology for Microfabrication of Institute of Optics and Electronics the Chinese Academy of Sciences(KFS4),and the Collaborative Innovation Center of High-End Equipment Manufacturing in Fujian,China.

#These authors contribute equally.

?Corresponding author.E-mail：rzhou2@xmu.edu.cn

?Corresponding author.E-mail：elehmh@nus.edu.sg