表面等離激元結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)研究進(jìn)展?

張崇磊 辛自強(qiáng) 閔長(zhǎng)俊袁小聰

(深圳大學(xué),納米光子學(xué)研究中心,深圳 518060)

表面等離激元結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)研究進(jìn)展?

張崇磊 辛自強(qiáng) 閔長(zhǎng)俊1)?袁小聰?

(深圳大學(xué),納米光子學(xué)研究中心,深圳 518060)

(2017年3月29日收到;2017年4月27日收到修改稿)

結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(SIM)因其高分辨、寬場(chǎng)、快速成像的優(yōu)勢(shì),在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域發(fā)揮了不可估量的作用.結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)與動(dòng)態(tài)可控的亞波長(zhǎng)表面等離激元條紋相結(jié)合,可以在不借助非線性效應(yīng)的情況下,將傳統(tǒng)SIM的分辨率從2倍于衍射極限頻率提升到3—4倍,此外還有抑制背景噪聲、提升信噪比的能力,在近表面的生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用中有重要價(jià)值.本文介紹了表面等離激元結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)的原理,并總結(jié)了近幾年國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展.

結(jié)構(gòu)光照明,超分辨成像,表面等離激元

1 引 言

光學(xué)顯微成像技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展極大地推動(dòng)了人們對(duì)生命現(xiàn)象的研究與認(rèn)知.然而,由于光學(xué)衍射極限的存在,傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)的空間分辨率最高只能達(dá)到200—300 nm[1-3],無法滿足觀測(cè)生物細(xì)胞微結(jié)構(gòu)等重大應(yīng)用需求,也對(duì)能夠突破衍射極限的超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn).為此,近些年大批新穎的超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù)被陸續(xù)提出并快速發(fā)展,獲得了科學(xué)界的廣泛關(guān)注.2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)就頒給了“超分辨熒光顯微成像技術(shù)”,以表彰該領(lǐng)域科學(xué)家的突出貢獻(xiàn).

提高光學(xué)成像分辨率的關(guān)鍵問題是如何獲取樣品的光學(xué)高頻信息,但是光學(xué)高頻信息主要局域在光學(xué)近場(chǎng)范圍,即樣品表面一到幾個(gè)波長(zhǎng)范圍內(nèi),無法傳播到遠(yuǎn)場(chǎng)自由空間被探測(cè)到.為了解決這個(gè)問題,人們發(fā)展出許多近場(chǎng)光學(xué)成像技術(shù)來提取光學(xué)高頻信息.例如：掃描近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡(scanning near- field optical microscope,SNOM),該技術(shù)通過亞波長(zhǎng)探針將只在物體表面?zhèn)鞑サ馁渴挪?evanescent wave)即高頻信息轉(zhuǎn)換成可以在遠(yuǎn)場(chǎng)探測(cè)的傳播場(chǎng),由此大幅提高了成像分辨率,分辨率可達(dá)20—50 nm[4-6];另外超透鏡(superlens)是基于納米金屬薄膜結(jié)構(gòu)的一種新穎成像技術(shù)[7],可以通過特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)將倏逝波傳遞并放大到遠(yuǎn)場(chǎng),使人們可以觀測(cè)到物體表面的精細(xì)信息,從而突破了衍射極限[8-12].

因?yàn)榻鼒?chǎng)光學(xué)顯微成像技術(shù)只能獲取樣品表面局部的近場(chǎng)信息,所以只適合于物體表面信息的探測(cè).相比于近場(chǎng)光學(xué)成像方法,遠(yuǎn)場(chǎng)光學(xué)成像方法則更加靈活,能在提高x-y平面橫向空間分辨率的同時(shí),也具有z方向的縱向分辨率,從而得到樣品的三維光學(xué)信息.近些年,不少遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨光學(xué)成像方法得到了很大發(fā)展[13-23].為了克服光學(xué)衍射極限,這些遠(yuǎn)場(chǎng)成像方法從另一個(gè)角度出發(fā)考慮：光學(xué)衍射極限理論是建立在線性光學(xué)的基礎(chǔ)上,線性的超分辨技術(shù)不可能真正突破它,但可以利用非線性效應(yīng)來打破光學(xué)衍射極限.例如,受激發(fā)射損耗(STED)[13]顯微鏡利用熒光分子的非線性效應(yīng),用一束光作為激發(fā)光激發(fā)熒光,再用另一束長(zhǎng)波長(zhǎng)同軸的中空環(huán)形光束損耗掉部分第一束光激發(fā)的熒光,只剩下中間極小的熒光點(diǎn),從而得到更銳利的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù).此技術(shù)成像分辨率可達(dá)30—80 nm范圍,并可實(shí)現(xiàn)三維光學(xué)成像,但也因?yàn)槠渲瘘c(diǎn)掃描的成像方式,往往需要消耗大量的時(shí)間成本.此外,還有隨機(jī)光學(xué)重建技術(shù)(STORM)[14]和光激活定位顯微技術(shù)(PALM)[15]都是單分子定位顯微技術(shù),通過熒光分子的非線性效應(yīng)(例如光活化、光開關(guān)等)控制小部分熒光分子進(jìn)入激發(fā)態(tài),然后成像在遠(yuǎn)場(chǎng)電荷耦合器(CCD)中,最后通過高斯擬合得到這些發(fā)光分子的精確位置.這種方法可以讓相互影響的衍射光斑在不同時(shí)刻分別記錄,從而消除衍射影響.在每張?jiān)紙D片上雖然只有少數(shù)熒光斑點(diǎn),但上千張圖片集合起來就組成了所有熒光分子的強(qiáng)度分布圖,猶如點(diǎn)彩(pointillism)圖畫一樣.其成像分辨率可達(dá)30 nm級(jí)別,但是這種方法局限在小范圍成像,且需要大量圖片集合,成像和處理過程復(fù)雜,時(shí)間分辨率低.同時(shí)STED和PALM/STORM通常所需要的輻射強(qiáng)度在103—108W/cm2,在這種情況下,熒光蛋白/分子很容易被漂白,產(chǎn)生大量的自由基,損傷活細(xì)胞樣品.

結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(structure illumination microscopy,SIM)是一種遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨光學(xué)顯微成像技術(shù),其原理是在寬場(chǎng)熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上,利用特殊調(diào)制的結(jié)構(gòu)光場(chǎng)來照明樣品,并運(yùn)用特定算法從調(diào)制圖像數(shù)據(jù)中提取焦平面的信息,從而突破衍射極限的限制,重建出超分辨切層的圖像信息.這種超分辨成像技術(shù)不需要逐點(diǎn)掃描樣品,可大范圍成像,具有快速、超分辨、寬場(chǎng)顯微成像的顯著優(yōu)點(diǎn).2000年,美國(guó)霍華休斯醫(yī)學(xué)研究院的Gustafsson等[16]首次在實(shí)驗(yàn)上證實(shí)了SIM的可行性,使用SIM成像方法對(duì)Hela細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)行了寬場(chǎng)超分辨成像研究,實(shí)現(xiàn)了170 nm左右的成像分辨率.2005年Gustafsson等[17]進(jìn)一步利用非線性效應(yīng)的飽和熒光成像技術(shù)對(duì)熒光顆粒實(shí)現(xiàn)了50 nm左右分辨率的超分辨成像.隨后Gustafsson等[18,19]又研究了對(duì)生物樣品的三維成像技術(shù),實(shí)現(xiàn)了SIM寬場(chǎng)超分辨成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,成像分辨率在100 nm左右. 2008年,Schermelleh等[20]將SIM技術(shù)應(yīng)用到哺乳動(dòng)物亞細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的成像中,對(duì)多重染色下的染色質(zhì)、核纖層和核孔進(jìn)行了高分辨率的精確成像,開啟了細(xì)胞核物質(zhì)運(yùn)輸交換研究的大門 (圖1(a)).2007年起,Chung等[21],Folka等[22]和Gliko等[23]先后使用全內(nèi)反射顯微鏡實(shí)現(xiàn)了表面倏逝場(chǎng)的SIM成像,由于表面倏逝場(chǎng)的穿透深度在100 nm左右,這些超分辨成像研究對(duì)于了解生物樣品膜表面特性具有重要的意義.2011年,Betzig課題組[24]報(bào)道了基于貝塞爾光束的結(jié)構(gòu)光照明顯微成像,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)囊泡、線粒體、有絲分裂的染色體等多種組分的動(dòng)態(tài)3D成像(圖1(b)).2015年,Betzig課題組[25]報(bào)道了利用一種新型反復(fù)光激活熒光蛋白Skylan-NS和結(jié)構(gòu)光激活的非線性SIM技術(shù),獲得了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和改變形狀過程中骨架蛋白的解體和自身再組裝過程,以及在細(xì)胞膜表面的caveolae的微小內(nèi)吞體動(dòng)態(tài)過程的影像(圖1(c)).

圖1 不同SIM顯微成像技術(shù)效果圖[20,24,25]Fig.1.The imaging e ff ect of di ff erent SIM microscopy technologies[20,24,25].

表面等離激元結(jié)構(gòu)光照明顯微成像(plasmonic structure illumination microscopy,PSIM)將SIM超分辨顯微成像技術(shù)與可動(dòng)態(tài)調(diào)控的表面等離激元(surface plasmons,SPs)干涉條紋相結(jié)合,可以在不借助非線性效應(yīng)的情況下,將傳統(tǒng)SIM的分辨率從2倍于衍射極限頻率提升到3—4倍.SPs干涉條紋是由兩個(gè)相向傳播的SPs波干涉產(chǎn)生的穩(wěn)定駐波場(chǎng),條紋周期大小依賴于SPs波長(zhǎng).由于SPs波長(zhǎng)可遠(yuǎn)小于自由空間光波長(zhǎng),所以SPs干涉條紋的周期也遠(yuǎn)小于衍射極限,從而可作為一種突破衍射極限的結(jié)構(gòu)光場(chǎng)應(yīng)用于SIM成像系統(tǒng).所以PSIM作為一種新型的超分辨寬場(chǎng)顯微成像技術(shù),結(jié)合了SIM顯微技術(shù)和SPs特性的優(yōu)勢(shì),進(jìn)一步提高了成像分辨率[26-32].2010年,美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校劉照偉教授等[26]首次明確提出類PSIM的概念,通過設(shè)計(jì)不同SPs激發(fā)結(jié)構(gòu),采用調(diào)整激發(fā)角的方式得到PSIM成像,其所在課題組隨后又開展了基于不同結(jié)構(gòu)的PSIM成像驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[27-29].同年,袁小聰教授課題組[30]利用全光緊聚焦激發(fā)金屬膜SPs,并動(dòng)態(tài)調(diào)控入射光學(xué)旋渦的拓?fù)浜蓪?shí)現(xiàn)多步相移,達(dá)到了接近理論值的PSIM成像分辨率,其課題組后期又在振幅調(diào)控、分?jǐn)?shù)階拓?fù)浜傻确矫孢M(jìn)行了改進(jìn)[31,32].目前PSIM成像技術(shù)作為一種仍在發(fā)展中的超分辨成像技術(shù),在成像分辨率、削弱背景噪聲等方面有明顯優(yōu)勢(shì),但其成像范圍局限于金屬表面,只能實(shí)現(xiàn)二維平面成像結(jié)果.目前已有利用PSIM成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)的研究報(bào)道[33],相信隨著PSIM成像技術(shù)的不斷研究發(fā)展,此技術(shù)的性能參數(shù)會(huì)得到進(jìn)一步提升,并在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)更多重要應(yīng)用.

2 基本理論

在介紹PSIM技術(shù)原理之前,有必要先了解SPs的基本特性、激發(fā)方式以及傳統(tǒng)SIM的成像原理,以便對(duì)PSIM技術(shù)進(jìn)行更深層次的研究.

2.1 表面等離激元的色散關(guān)系

表面等離激元是局域于金屬表面的一種電磁振蕩波,有的文獻(xiàn)中也稱為表面等離子體[34]. 20世紀(jì)初,Wood[35]檢測(cè)了具有連續(xù)光譜的偏振光經(jīng)過光柵后的變化情況,發(fā)現(xiàn)偏振光的頻譜在某一區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)損失的現(xiàn)象,稱為“Wood異常”,這是對(duì)于SPs現(xiàn)象的最早記載.1941年,Fano[36]發(fā)現(xiàn)“Wood異?！爆F(xiàn)象是由于一種表面波引起的,并提出了體積等離激元的概念,初步解釋了SPs產(chǎn)生的原理.1957年,Ritchie[37]發(fā)現(xiàn)當(dāng)電子穿過金屬膜之后存在能量消失峰的現(xiàn)象,他定義這種消失峰為“能量降低的”等離激元模式,并對(duì)這種模式與薄膜邊界之間的關(guān)系進(jìn)行了分析,首次提出了“金屬等離激元”的概念,用于描述金屬內(nèi)部電子密度的縱向波動(dòng)情況.在1958年,Stem和Farrel[38]研究了此種模式產(chǎn)生的條件并首次提出了“表面等離激元共振(surface plasmon resonance,SPR)”的概念.隨后在1960年,Powell和Swan[39]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ritchie的理論.1998年,Ebbesen等[40]在《Nature》報(bào)道了SPs在亞波長(zhǎng)金屬孔陣列結(jié)構(gòu)中的異常透射增強(qiáng)現(xiàn)象之后,SPs因其具有亞波長(zhǎng)尺度光信號(hào)傳遞與增強(qiáng)特性再次引起了廣大研究人員的興趣,有關(guān)SPs的新現(xiàn)象、新機(jī)理和新應(yīng)用的研究不斷發(fā)展.2003年,Barnes等[34]在《Nature》上發(fā)表了題為“表面等離激元亞波長(zhǎng)光學(xué)(surface plasmon subwavelength optics)”的綜述文章,標(biāo)志著SPs光學(xué)的興起并逐漸形成一門獨(dú)立的學(xué)科.近年來隨著納米尺寸加工技術(shù)的進(jìn)步,基于SPs的各種新奇應(yīng)用不斷涌現(xiàn),如突破衍射極限的成像[26]、亞波長(zhǎng)波導(dǎo)[41]、等離激元刻蝕[42]、負(fù)折射率材料等[43].

(1)式為從麥克斯韋方程組推導(dǎo)出的金屬/介質(zhì)分界面的表面等離激元色散公式[44].圖2所示為光在自由空間(A)、高折射率介質(zhì)(B),以及表面等離激元(C)的色散關(guān)系曲線.由于金屬介電常數(shù)的實(shí)部為負(fù)值,根據(jù)(1)式SPs的波矢要大于自由空間入射光波矢.從圖2中可以看出SPs的色散曲線始終位于自由空間光波矢k0的右邊,并隨著頻率增加ksp與k0距離越來越遠(yuǎn),即SPs的波矢越來越大,波長(zhǎng)越來越小,因此入射光波無法直接在金屬膜表面耦合激發(fā)SPs.為了有效激發(fā)SPs,必須對(duì)激發(fā)光的波矢進(jìn)行補(bǔ)償,滿足激發(fā)所需的波矢匹配條件,才能激發(fā)SPs.下面簡(jiǎn)要介紹SPs激發(fā)的幾種常用方法.

圖2 光在自由空間、電介質(zhì)以及表面等離激元的色散關(guān)系曲線Fig.2.The dispersion relation curves of light in free space,dielectric and SPs.

2.2 表面等離激元的激發(fā)方法

2.2.1 棱鏡耦合法

這種方法是現(xiàn)在應(yīng)用最多的一種表面等離激元激發(fā)方法.1968年,Otto[45]首次基于棱鏡的全內(nèi)反射實(shí)現(xiàn)了表面等離激元的光學(xué)激發(fā),如圖3(a)所示.接著Kretschmann和Raether[46]也報(bào)道了一種更加實(shí)用的棱鏡結(jié)構(gòu)激發(fā)表面等離激元,如圖3(b)所示.入射光以不小于全反射角的角度入射,利用高折射率棱鏡(折射率np＞1)進(jìn)行波矢補(bǔ)償.通過調(diào)節(jié)入射角度θsp,改變?nèi)肷涔獠ㄊ竗0在x軸上的分量kx=k0npsinθ,使kx與SPs波矢ksp相等即可激發(fā)SPs,即滿足如下波矢匹配方程：

所以當(dāng)沿金屬與空氣界面方向的光波矢分量在特定入射角度和波長(zhǎng)條件下滿足波矢匹配方程(2)時(shí),即可有效地激發(fā)SPs.

值得提出的是在金屬薄膜的上下兩個(gè)表面均可激發(fā)SPs.對(duì)于較厚的金屬膜,光子隧道效應(yīng)很弱,這種情況Otto[45]的結(jié)構(gòu)比較適合.在該結(jié)構(gòu)中,全反射棱鏡和金屬膜有很小的空氣間隙(近場(chǎng)區(qū)域),依舊可在金屬和空氣間隙的界面上激發(fā)SPs.當(dāng)金屬膜厚度減少到上下表面電磁模的相互作用(SPR的相互耦合)不能忽略時(shí),SPs的色散關(guān)系會(huì)發(fā)生很大改變,此時(shí)表面等離激元共振頻率將產(chǎn)生分裂,分別對(duì)應(yīng)對(duì)稱模式(低頻模式)、非對(duì)稱模式(高頻模式).對(duì)于較大的SPs波矢,分裂后的頻率可用(3)式描述：

其中d是金屬膜的厚度.同時(shí),經(jīng)過研究表明,因?yàn)閷?duì)稱模式的波矢虛部隨厚度的減少而減少,其傳播距離也隨之增加,所以它也被稱為長(zhǎng)程表面等離激元(long range surface plasmons,LRSPs)[47].

圖3 利用棱鏡耦合法激發(fā)SPsFig.3.Using prism coupling method to excite SPs.

2.2.2 近場(chǎng)散射激發(fā)方法

波矢匹配條件限制了遠(yuǎn)場(chǎng)光波對(duì)近場(chǎng)SPs的耦合,而近場(chǎng)光波可以不受任何限制地耦合到SPs.采用尺寸遠(yuǎn)小于波長(zhǎng)的探針在近場(chǎng)范圍內(nèi)掃描金屬表面,由于探針對(duì)光的散射作用,在探針附近存在近場(chǎng)倏逝波,其波矢范圍包含了SPs的波矢量,這樣其中一部分倏逝波就能夠?qū)崿F(xiàn)波矢匹配從而激發(fā)SPs.同理,利用金屬表面的亞波長(zhǎng)尺寸散射體(如凸起、凹槽等缺陷)也能激發(fā)SPs.圖4(a)為近場(chǎng)探針激發(fā)SPs的結(jié)構(gòu)示意圖[48],圖4(b)為亞波長(zhǎng)尺寸散射體激發(fā)SPs的結(jié)構(gòu)示意圖[49].近場(chǎng)散射激發(fā)方法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、激發(fā)容易,缺點(diǎn)是只有很小一部分散射光能滿足SPs波矢匹配條件,所以激發(fā)SPs的效率比較低.

圖4 近場(chǎng)激發(fā)SPs示意圖[48,49]Fig.4.Schematic of exciting SPs by scattering wave[48,49].

2.2.3 光柵激發(fā)方法

最早關(guān)于SPs的報(bào)道就是采用光柵耦合激發(fā)的方法實(shí)現(xiàn).光柵耦合是利用光柵對(duì)入射光波矢引入一個(gè)額外的波矢增量來實(shí)現(xiàn)SPs的波矢匹配.常用的光柵有一維光柵,二維光柵以及孔陣列結(jié)構(gòu)和顆粒陣列結(jié)構(gòu)[50].圖5顯示的是一維光柵結(jié)構(gòu)激發(fā)SPs的示意圖,其波矢匹配方程為(4)式,其中θ為入射角,G=2π/Λ是光柵常數(shù),Λ是光柵周期長(zhǎng)度,m(=1,2,3,…)是光柵的級(jí)次.由于光柵的材料、幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)等都可以自由選定,可供研究的內(nèi)容很豐富.這種方法激發(fā)SPs的效率較高,缺點(diǎn)是光柵結(jié)構(gòu)制備成本較高,缺乏動(dòng)態(tài)調(diào)控性.

圖5 光柵耦合激發(fā)SPs示意圖Fig.5.Schematic of exciting the SPs by grating coupling.

2.2.4 緊聚焦激發(fā)方法

近年來,使用高數(shù)值孔徑物鏡緊聚焦激發(fā)SPs的方法備受關(guān)注[51],其原理與棱鏡耦合法中Kretschmann[46]的結(jié)構(gòu)相似,如圖6所示.將高數(shù)值孔徑的顯微物鏡通過油浸層靠近一個(gè)鍍有金屬薄膜的介質(zhì)襯底,入射光波通過該物鏡聚焦到介質(zhì)襯底/金屬界面.由于高數(shù)值孔徑物鏡能夠提供足夠大的入射角范圍,涵蓋了SPs激發(fā)所需要的共振角,從而能在SPs共振角位置滿足波矢匹配條件,激發(fā)SPs.此方法的優(yōu)點(diǎn)是激發(fā)容易,只要物鏡提供的入射角范圍包含SPs共振角就自然能激發(fā)SPs,缺點(diǎn)是只有SPs共振角附近很小一部分入射光可以激發(fā),絕大部分其他角度的入射光都被金屬膜反射了,所以激發(fā)SPs的效率比較低.這種激發(fā)方法能夠與傳統(tǒng)光學(xué)顯微系統(tǒng)相結(jié)合,因此被廣泛應(yīng)用于生物顯微成像、傳感等領(lǐng)域.

圖6 利用高數(shù)值孔徑物鏡緊聚焦激發(fā)SPsFig.6.SPs excieted by highly focused laser beam.

2.3 結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)基本理論

結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)屬于一種寬場(chǎng)成像技術(shù),在提高成像速度方面比點(diǎn)掃描成像具有明顯優(yōu)勢(shì).初期的結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)主要用來提高光學(xué)顯微鏡的層析能力,并且由于只需對(duì)傳統(tǒng)顯微鏡稍加改造就可以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)光照明,因此它更為經(jīng)濟(jì),目前已經(jīng)有商業(yè)公司提供結(jié)構(gòu)光照明模塊,如Olympus的OptiGrid[52]和Zeiss的Apotome[53].結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)最早是通過在照明光路中加入一個(gè)正弦光柵來實(shí)現(xiàn)[15],利用壓電陶瓷控制器整體移動(dòng)光柵來實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)光的相移,但是這種機(jī)械移動(dòng)裝置降低了系統(tǒng)的穩(wěn)定性;后期利用可動(dòng)態(tài)控制的空間光調(diào)制器[30-32]、數(shù)字微鏡器件(digital micromirror device)[54]來代替光柵,實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)光照明.結(jié)構(gòu)光照明不僅可以獲得層析成像能力,更重要的是利用結(jié)構(gòu)光頻率和樣品頻率分量形成的莫爾條紋可以提高橫向分辨率.通過空間調(diào)制后的結(jié)構(gòu)光照明樣品,將物場(chǎng)空間高頻率信息編碼,再通過計(jì)算提取高頻率信息,可將橫向分辨率提高到2倍于衍射極限頻率.需要說明的是橫向成像分辨率取值與結(jié)構(gòu)光波矢正相關(guān),因此提高結(jié)構(gòu)光的波矢就提高了系統(tǒng)接收高頻信息的能力,也就提升了成像的空間分辨率.

2.3.1 結(jié)構(gòu)光照明橫向分辨率原理

橫向的結(jié)構(gòu)光照明為正弦分布：

(5)式經(jīng)過傅里葉變換,可以在頻譜面上看到三個(gè)脈沖(δ)頻率分量：

在頻域內(nèi),定義源圖像的頻域?yàn)锽(k),其反映的是熒光分子等樣品的濃度分布信息.必須指出的是,無論是結(jié)構(gòu)光照明圖案的頻率I(k),還是源圖像的空間頻率B(k),都受到系統(tǒng)的衍射極限頻率限制OTF(k).故系統(tǒng)在頻域的輸出為O(k),其表示為

SIM系統(tǒng)所獲得的圖像空間頻譜實(shí)為寬場(chǎng)頻譜和衍射極限頻率外高頻信息所疊加產(chǎn)生的混合頻譜.為了復(fù)原超分辨頻譜的真實(shí)分布,首先需要將各頻譜分量B(k),B(k+k0)和B(k-k0)準(zhǔn)確分離;再將已分離的高頻信息搬回原有的位置;最后,結(jié)合去卷積運(yùn)算[55],獲得最優(yōu)化的超分辨圖像顯示效果.基于以上分析可知,由于(6)式中共包含三個(gè)未知頻譜分量B(k),B(k+k0)和B(k-k0),至少需要構(gòu)建三個(gè)獨(dú)立方程式以獲得未知數(shù)的精確解.顯然,在結(jié)構(gòu)光調(diào)控過程中,相位是最合適的調(diào)制參數(shù).選擇三個(gè)不同初相位{0,φ1,φ2}的結(jié)構(gòu)光激發(fā)樣品,得到三項(xiàng)頻域內(nèi)的輸出{O(k),O1(k),O2(k)},從而求得

經(jīng)過算法重構(gòu),結(jié)構(gòu)光系統(tǒng)最大的空間頻率可以達(dá)到系統(tǒng)衍射極限頻率的2倍,故可以將特定方向的空間分辨率提高一倍.同時(shí)改變相移方向,將所有方向獲得的高頻分量整合,可以將整個(gè)二維平面的分辨率都提高一倍.結(jié)構(gòu)光照明在k矢量空間的表示如圖7所示.

圖7 結(jié)構(gòu)光照明在k矢量空間的表示[56](矩形代表樣品k矢量空間的表示,為了簡(jiǎn)單說明分成三個(gè)方向,縱向條紋為樣品的直接成像寬場(chǎng)信息,斜條紋代表樣品的高頻信息) (a)小圓圈表示系統(tǒng)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的傅里葉變換,由于正弦照明,記錄強(qiáng)度是三個(gè)不同方向分量的總和的傅里葉變換,包含有縱向條紋物品信息與其他兩個(gè)斜條紋信息; (b)如果在圖像中記錄的三個(gè)信息分量被適當(dāng)分開,它們可以用來提升分辨率Fig.7.E ff ect of the structured illumination in k-vector space[56](the rectangle represents the sample kvectors,the sample separation in three areasis simply illustrative)：(a)The small circles are the Fourier transform of the point spread function,because of the sinusoidal illumination,the Fourier transform of the recorded intensity is the sum of three di ff erent components,include with the wide- field information(vertical stripes),information from two more areas of the sample(diagonal stripes),is mixed in the recorded image; (b)if the three information components recorded in the image are properly separated,they can be used to increase the resolution.

2.3.2 表面等離激元結(jié)構(gòu)光顯微成像基本原理

對(duì)于傳統(tǒng)SIM成像技術(shù),其分辨率R可以寫成[26]：對(duì)于熒光光譜來說,λeimission≈ λexciatation,因此SIM成像分辨率接近λeimission/(4NA),即傳統(tǒng)衍射極限頻率的2倍.而PSIM技術(shù)將SIM與可調(diào)控的SPs干涉駐波條紋相結(jié)合,對(duì)于PSIM成像, λexciatation=λsp,根據(jù)圖2可知SPs波矢總大于激發(fā)光波矢,使得SPs駐波比激發(fā)光波長(zhǎng)更短、頻率更高,因此將高頻的SPs條紋作為結(jié)構(gòu)光可以顯著提升成像系統(tǒng)分辨高頻信息的能力.SPs條紋可以通過相向傳播的SPs波干涉形成駐波來產(chǎn)生,并可以通過調(diào)節(jié)SPs波的初始相位實(shí)現(xiàn)駐波的相移.圖8給出了PSIM成像波矢空間的示意圖.

圖8 PSIM波矢空間示意圖[56](黑色圓圈是波矢空間中的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),圓越大表明分辨率越高) (a)初始點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù);(b)通過四個(gè)方向(箭頭表示)SIM成像重建的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),共有十二幅圖像獲取(每個(gè)方向的三幅圖像),得到更高的分辨率;(c)通過PSIM技術(shù)重建的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),條紋由相向傳播的SPs波干涉生成,這些條紋超越光學(xué)分辨,對(duì)于一個(gè)連續(xù)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),PSIM可實(shí)現(xiàn)衍射極限頻率三倍以上的成像分辨率Fig.8. Thek-vectorspacerepresentationsof PSIM[56](the black circles are the point spread functions in k space,the larger the circle the better the resolution)：(a)Original point spread function of the lens;(b)reconstructed point spread function via optical SIM for four directions(the arrows),twelve images are acquired(three for each direction)to reproduce a high resolution one;(c)reconstructed point spread function via PSIM,the illumination fringes are created from counter propagating SPs,these fringes beyond optically resolved,for a continuous point spread function,PSIM achieves triple better imaging resolution as the di ff raction limit.

3 表面等離激元結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)的研究進(jìn)展

國(guó)際上對(duì)PSIM技術(shù)的研究,根據(jù)SPs條紋的產(chǎn)生與調(diào)控方法可分為兩類：一類是基于微納米金屬結(jié)構(gòu)的PSIM,還有一類是基于全光激發(fā)與調(diào)控的PSIM.結(jié)構(gòu)型的PSIM技術(shù)具有高效耦合、局域場(chǎng)增強(qiáng)的優(yōu)勢(shì),但同時(shí)透過結(jié)構(gòu)的光對(duì)于成像會(huì)造成影響,并且因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)固定,限制了結(jié)構(gòu)光場(chǎng)的任意可調(diào).全光型的PSIM技術(shù)具有高動(dòng)態(tài)性、光場(chǎng)任意可調(diào)的優(yōu)點(diǎn),但其耦合效率較低.得益于納米加工技術(shù)的發(fā)展,基于納米尺度結(jié)構(gòu)的PSIM相比較全光的PSIM可以實(shí)現(xiàn)更高的條紋空間頻率,理論上可以得到更高分辨率的PSIM成像,但也存在加工難度高等問題.

3.1 基于結(jié)構(gòu)調(diào)制的PSIM介紹

2010年,美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校劉照偉教授在國(guó)際上首次提出PSIM的概念[26],并通過模擬分析了兩種結(jié)構(gòu)的PSIM成像分辨率.兩種結(jié)構(gòu)分別基于不同厚度的兩種金屬/介質(zhì)膜,以銀膜作為金屬膜,水作為周圍介質(zhì).其中一種結(jié)構(gòu)如圖9所示,銀膜厚度為100 nm(灰色區(qū)域),采用Kretschmann[46]結(jié)構(gòu)激發(fā)方法,563 nm激發(fā)光以不同入射角激發(fā)產(chǎn)生SPs干涉圖樣并發(fā)生橫向位移.當(dāng)入射激發(fā)角度分別為0°,4.6°和8°時(shí),三種SPs干涉駐波場(chǎng)沿橫向呈現(xiàn)120°的相位差.該方法可用于暗場(chǎng)熒光成像,文中分析可實(shí)現(xiàn)3倍的成像分辨率提高.

圖9[26](a)—(c)SPs駐波干涉條紋的時(shí)間平均電能量密度分布,分別以0°,4.6°和8°作為激發(fā)角,三種干涉SPs駐波模式沿橫向方向呈現(xiàn)120°的相位差Fig.9.[26](a)–(c)The time-averaged electrical energy density distribution of the SP interference pattern with incident angle equal to 0°,4.6°,and 8.0°,respectively.The three interference patterns show 120°mutual phase di ff erence along the lateral direction.

第2種結(jié)構(gòu)采用17 nm厚度的銀膜和光柵激發(fā)方法,通過優(yōu)化的周期性Cr金屬納米孔結(jié)構(gòu)去激發(fā)SPs[26],如圖10所示.納米孔結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生類似光學(xué)Bloch波的SPs-Bloch模式,當(dāng)m階SPs-Bloch波相向傳輸形成駐波條紋,條紋周期決定于納米孔的周期,其在矢量空間滿足kf=2(kS±m(xù)kg),這里kg為納米孔周期的倒數(shù).因此可以通過縮小納米孔的周期長(zhǎng)度來形成更為精細(xì)的SPs干涉駐波條紋,文中分析可實(shí)現(xiàn)4倍的成像分辨率提高.

2012年,袁小聰教授課題組[57,58]利用四方向金屬光柵結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了PSIM,具體結(jié)構(gòu)如圖11(a)所示,其中光柵圍繞的中心區(qū)域面積是12μm×12μm.采用633 nm波長(zhǎng)的線偏振的光學(xué)旋渦(optical vortex,OV)作為激發(fā)光弱聚焦于金屬光柵結(jié)構(gòu)上,在中心區(qū)域內(nèi)激發(fā)產(chǎn)生SPs駐波場(chǎng),再通過調(diào)控入射光的相位(即OV光束的拓?fù)浜?,實(shí)現(xiàn)SPs駐波條紋相移,致使熒光成像.這種實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單、重復(fù)性高,但由于成像視場(chǎng)范圍受限于SPs的傳播距離,中心成像區(qū)域面積較小,不利于大尺寸樣品的放置、對(duì)準(zhǔn)測(cè)量.通過調(diào)整激發(fā)光的偏振方向,可以實(shí)現(xiàn)雙方向的PSIM成像,最終實(shí)現(xiàn)的成像分辨率達(dá)到172 nm,接近激發(fā)波長(zhǎng)的1/4.

圖10[26](a)結(jié)構(gòu)示意圖與SP干涉圖案(取電場(chǎng)能量密度分布的時(shí)間平均值);(b)干涉圖案的傅里葉變換;(c)對(duì)應(yīng)的波矢空間表示;不同的顏色代表不同階照明圖案的波矢信息Fig.10.[26](a)Structure and SP interference pattern(time-averaged electric energy density distribution); (b)Fourier transform of interference pattern;(c)corresponding k space representations;di ff erent colors represent the information obtained from di ff erent orders of the illumination patterns.

圖11[58](a)四方向金屬光柵掃描電鏡圖像,可用于產(chǎn)生SPs莫爾條紋;(b)SPs駐波熒光顯微鏡原理圖; (c),(d)利用近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡得到狹縫陣列結(jié)構(gòu)中心區(qū)域的SPs駐波場(chǎng)的強(qiáng)度分布,其入射光偏振方向分別為x(c)和y(d)方向,(d)的插圖是采用二進(jìn)制相位板插入光路光學(xué)顯微鏡中實(shí)現(xiàn)的SP駐波相移的條紋圖像Fig.11.[58](a)SEM image of four metallic gratings to generate plasmonic Moiré fringes;(b)a schematic diagram of the SP-SWF microscope;(c),(d)NSOM images of SP standing wave fi led intensity distributions in the central area of slit array structures with polarization of illumination light along x(c)and y(d) direction,respectively.Insertion in(d)is the NSOM image of phase-shifted SP standing wave fringe by using binary phase plate inserted into optical path.

2014年,劉照偉課題組在《Nano Letters》期刊上發(fā)表的文章展示了其PSIM技術(shù)的最近實(shí)驗(yàn)研究成果[27].如圖12和圖13所示,他們?cè)诮饘倌ど峡涛g了正交的細(xì)縫,形成了正方形狹縫陣列.每次入射光照明,正方形對(duì)邊將會(huì)激發(fā)產(chǎn)生相向傳播的SPs,疊加后形成SPs駐波的結(jié)構(gòu)光用于熒光成像.他們又通過精確控制照明光的入射角度實(shí)現(xiàn)了駐波條紋的移動(dòng).而SIM二維超分辨成像的實(shí)現(xiàn),則是由調(diào)節(jié)照明光的偏振實(shí)現(xiàn),正交的偏振方向分別開關(guān)了正方形兩組對(duì)邊狹縫SPs的產(chǎn)生.這一技術(shù)使得成像分辨率提升了2.6倍,達(dá)到123 nm.

圖12[27]PSIM系統(tǒng)原理圖 在x-z與y-z平面的入射角度通過分別控制掃描電鏡S2和S1的旋轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn),掃描電鏡S2放在透鏡1的焦平面上,樣品放置在透鏡2的焦平面上,插圖為樣品區(qū)域的放大圖Fig.12.[27]Schematics of the PSIM system.The illumination angle tuning in x-z and y-z planes are controlled by the rotation of the s2 and s1 mirror of the Galvo scanner,respectively,with the s2 mirror placed at the focal plane of lens 1 and the sample placed at the focal plane of lens 2.Inset：a magni fi ed view of the sample region.

圖13[27]樣品制備與表征 (a)PSIM基板的光學(xué)圖像,PSIM基板面積為2 mm×2 mm;(b)—(d)PSIM基板掃描電子顯微鏡圖像,狹縫陣列的圖像(b),(b)結(jié)構(gòu)單元的掃描電子圖像(c),狹縫的進(jìn)一步放大圖像(d);(e)SPs干涉結(jié)構(gòu)示意圖,隨著入射角θ的變化,SPI干涉結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(由水平橫向黑色箭頭指示的方向);(f),(g)熒光強(qiáng)度與分別在x-z平面(f)和y-z平面(g)相對(duì)入射角的關(guān)系Fig.13.[27]Sample fabrication and characterization：(a)Optical image of a large PSIM substrate,the total PSIM substrate area is 2 mm×2 mm;(b)–(d)scanning electron microscope(SEM)images of a PSIM substrate,showing an array of the patterned slits(b),one unit cell(c)and a further magni fi ed view of the slits(d);(e)schematic illustration of the SPI tuning scheme,as the incident angle θ changes,the SPI pattern shifts laterally(direction indicated by the horizontal black arrow);(f),(g) fl uorescence intensity vs the relative incident angle in x-z(f)and y-z(g)plane,respectively.

此外,基于納米光學(xué)天線結(jié)構(gòu),劉照偉課題組又開發(fā)出一種局域表面等離激元結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)(LPSIM)[29].不同于前面基于周期性狹縫結(jié)構(gòu)的PSIM技術(shù),利用納米天線激發(fā)的局域表面等離激元,其空間頻率可以任意獲取,理論上并沒有分辨率的極限.圖14為光學(xué)天線的結(jié)構(gòu)示意圖[28],納米天線的直徑在60 nm,天線間距為150 nm,制作成六角形排布.圖中紅線表示照明激發(fā)光的p-偏振方向,通過改變激發(fā)光的入射角,即能實(shí)現(xiàn)SPs條紋的相移.結(jié)果顯示,LPSIM技術(shù)將圖像分辨力提高3倍,點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)半高寬從153 nm降到52 nm.

2016年魚衛(wèi)星課題組[59,60]理論研究了梯度介電常數(shù)人工結(jié)構(gòu)在SIM成像中的應(yīng)用.此人工結(jié)構(gòu)由金屬與介質(zhì)交替疊加組成,其多步相移通過調(diào)制入射角度得到,如圖15所示.采用532 nm激發(fā)光入射,可以得到SPs干涉駐波條紋周期達(dá)到84 nm,理想情況下可以實(shí)現(xiàn)亞45 nm的PSIM成像分辨率.這意味著相比較常規(guī)的熒光成像,可以實(shí)現(xiàn)5倍的成像分辨率提升.此類設(shè)計(jì)與之前劉照偉課題組[25]報(bào)道的結(jié)構(gòu)類似,但創(chuàng)新性地采用了金屬與介質(zhì)交替疊加的結(jié)構(gòu),進(jìn)一步增加了等效折射率,降低了駐波條紋周期,提升了空間頻率.

圖14[29]LPSIM原理示意圖(紅色箭頭代表p偏振激光,以不同角度激發(fā)等離子基板,在天線后產(chǎn)生短程的近場(chǎng)激發(fā)模式)分辨率表征 PSFs(a)衍射受限系統(tǒng)和(b)LPSIM技術(shù);(c)經(jīng)過LPSIM重構(gòu)之后的光學(xué)傳遞函數(shù);(d)實(shí)心條紋物體;(e)衍射受限圖像;(f)LPSIM圖像Fig.14.[29]The Schematics of the LPSIM.The red arrow represents p-polarized laser light,directed towards the plasmonic substrate at varying angles to create near- field excitation patterns a short distance behind the antennas.Resolution characterization：PSFs of(a)a di ff raction-limited system,and(b)the LPSIM technique;(c)expanded OTF after LPSIM-reconstruction;(d)a solid striped object;(e)di ff raction-limited image;(f)LPSIM image.

圖15[59]在SIM使用的GPMS的示意圖和它的成像性能仿真結(jié)果 (a)由GPMS產(chǎn)生SPS的光學(xué)示意圖,兩列相向傳輸?shù)谋砻娴入x激元形成駐波干涉條紋,用來激發(fā)在水膜中的量子點(diǎn)(或熒光珠);點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(b)的二(a)衍射受限系統(tǒng),(c)x方向的重建圖像,(d)傳統(tǒng)的熒光顯微鏡圖像(藍(lán)色曲線)和利用GPMS實(shí)現(xiàn)的超分辨率圖像(紅色線)之間的半高寬比較;(e)x和y方向的重建圖像Fig.15.[59]The schematic diagram of the GPMS used in SIM and the simulation results of its imaging performance：(a)Optical con fi guration of SPs generated by GPMS,the standing interference pattern,which is generated by two adjacent counter propagating SPs,is used to excite the quantum dots(or fl uorescent beads)in the water fi lm;point spread function(b)a di ff raction-limited system,(c)x-direction reconstructed image,(d)FWHM comparison between conventional epi- fl uorescence microscope image(blue curve)and the super-resolution image using the GPMS(red line);(e)both x and y direction reconstructed image.

3.2 基于全光調(diào)制的PSIM技術(shù)

全光調(diào)控型PSIM技術(shù)利用入射光束整形產(chǎn)生特殊相位、偏振分布的新穎光束作為激發(fā)光源,選擇性地在均勻金屬/介質(zhì)界面激發(fā)可重構(gòu)的SPs駐波條紋,并進(jìn)一步通過變化入射光束的相位、振幅、偏振來動(dòng)態(tài)調(diào)控所激發(fā)的SPs條紋.此方法無須制備復(fù)雜的微納米金屬結(jié)構(gòu),簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì),而且易與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微系統(tǒng)相整合.此技術(shù)類似于已經(jīng)報(bào)道的TIRF-SIM成像[25]手段,只是樣品的底層介質(zhì)不同,相比較而言PSIM由于SPs波長(zhǎng)短而具有更高的成像分辨率.

2009年,麻省理工大學(xué)的Chung等[61]發(fā)表了一項(xiàng)研究工作：將SPs應(yīng)用于寬場(chǎng)熒光超分辨成像中,稱為駐波-表面等離激元熒光成像技術(shù)(SWSPRF).圖16為光學(xué)系統(tǒng)示意圖,使用激光波長(zhǎng)為532 nm,在準(zhǔn)直系統(tǒng)中置入偏振片,以此選擇激發(fā)光為p偏振或者s偏振.實(shí)驗(yàn)中金膜蒸鍍?cè)谏w玻片上,然后在金膜上又鍍了一層5 nm厚的二氧化硅.激發(fā)所使用的緊聚焦物鏡是45倍,數(shù)值孔徑為1.45,此時(shí)兩束激發(fā)光入射角度為44.7°,每束光都會(huì)激發(fā)SPs,兩束相向的SPs干涉產(chǎn)生駐波結(jié)構(gòu)光照明體系,文中分析了此時(shí)對(duì)應(yīng)的對(duì)比度為0.8.SIM技術(shù)中重要的環(huán)節(jié)之一就是控制結(jié)構(gòu)光產(chǎn)生穩(wěn)定相移,從而覆蓋整個(gè)成像區(qū)域,如圖所示, Chung等在一束激發(fā)光中加入了反饋調(diào)節(jié)裝置,穩(wěn)定快速地完成了SPs條紋的相移過程.圖16(a1)為原始熒光像,(b1)為(a1)去卷積后得到的效果圖,(c1)和(d1)分別為三步相移的算法合成圖像以及合成后算法優(yōu)化處理后的圖像,(d2)表征了最后得到的熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的截面數(shù)據(jù),可以看出最終的成像分辨率達(dá)到124 nm.另外,此方法提高了信噪比,降低了熒光猝滅的可能性,可滿足生物醫(yī)學(xué)成像中的迫切需求.

2010年,袁小聰課題組[30]提出了基于表面等離激元旋渦的PSIM顯微成像技術(shù).如圖17(a)所示,他們用高數(shù)值孔徑物鏡將OV聚焦在銀膜上,在銀膜上表面激發(fā)產(chǎn)生SPs旋渦駐波條紋,致使熒光成像.再利用OV光束的拓?fù)浜勺兓?實(shí)現(xiàn)了SPs駐波場(chǎng)的相移,如圖17(b)所示,拓?fù)浜蓮?—4變化,所對(duì)應(yīng)的相移為0,2π/5,4π/5和 6π/5.這種裝置較Chung等實(shí)驗(yàn)裝置更加簡(jiǎn)單,重復(fù)性高.從圖17(c)熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的截面數(shù)據(jù)可以知道,實(shí)驗(yàn)最終實(shí)現(xiàn)的圖像分辨率為150 nm,與152 nm的理論分辨率符合得很好.

圖16[61]SW-SPRF實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖 SW-SPRF顯微在垂直方向的分辨率：(a1)初始熒光圖像,(b1)去卷積的SPRF圖像,(c1)基于三幅去卷積后的SPRF圖像實(shí)現(xiàn)SW-TIRF算法得到SW-SPRF圖像,(d1)線性去卷積降低SW-SPRF圖像的旁瓣;(a2)—(d2)比較了不同方法得到的選定區(qū)域PSF函數(shù)分布.比例尺,2μm;插圖直徑1.3μmFig.16.[61]Experimental setup of SW-SPRF microscopy.Extended-resolution imaging with SW-SPRF microscopy in vertical direction：(a1)Original SPRF image,(b1)deconvolved SPRF image,(c1)SW-SPRF image after applying the SW-TIRF algorithm on three deconvolved SPRF images,(d1)SW-SPRF image with linear deconvolution to reduce side lobes;(a2)–(d2)comparison of PSF pro fi les of various imaging methods at a selected region of interest (ROI).Scale bar,2μm;inset size 1.3μm across.

2015年,袁小聰課題組[31]進(jìn)一步改進(jìn)了PSIM系統(tǒng),利用攜有分?jǐn)?shù)拓?fù)浜傻腛V光束激發(fā)特定相移的SPs駐波場(chǎng),同時(shí)對(duì)激發(fā)光束進(jìn)行強(qiáng)度調(diào)制,激發(fā)出利于算法處理的一維駐波條紋.如圖18(a)所示,強(qiáng)度調(diào)制器為一蝴蝶形的光闌,如此一來,OV光分為對(duì)稱的兩束光,同時(shí)攜帶了相移的拓?fù)湫畔?如圖18(c)所示,拓?fù)浜煞謩e為1, 1.66,2.34的OV光束進(jìn)入激發(fā)系統(tǒng)后產(chǎn)生的駐波相移分別是-2π/3,0,2π/3.實(shí)驗(yàn)處理后得到的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)截面半高寬(FWHM)為95 nm,國(guó)際上首次將全光調(diào)制型PSIM成像分辨率提高到100 nm以下.此項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了近似平行的均勻SPs駐波條紋,解決了之前旋渦光束激發(fā)產(chǎn)生SPs條紋為圓形且不均勻的問題,為后期圖像處理帶來了較大的方便.

由于全光調(diào)制型PSIM大都高數(shù)值孔徑物鏡聚焦的SPs激發(fā)方法,其中只有SPs共振角附近很小一部分入射光可以用來激發(fā),絕大部分其他角度入射光都被金屬膜反射了,所以激發(fā)SPs的效率比較低.2016年,袁小聰課題組[31]將新穎的完美渦旋光束(POV)引入PSIM系統(tǒng),利用完美渦旋光束的環(huán)形邊帶非常窄的特點(diǎn),將窄帶環(huán)形光束精確對(duì)應(yīng)到SPs共振角度,從而讓更多的入射光能量被用于激發(fā)SPs駐波場(chǎng).該項(xiàng)PSIM技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于SPs激發(fā)效率比普通OV光束高很多,目前已實(shí)現(xiàn)了6.2倍的成像激發(fā)效率提升.此外,由于完美渦旋光束是窄帶環(huán)形光束,中心沒有激發(fā)光透過金屬膜,能較好地抑制背景噪聲,提高成像的信噪比.

圖17[30](a)光學(xué)旋渦聚焦銀薄膜所產(chǎn)生的表面等離激元激元的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)示意圖;(b)具有不同拓?fù)浜蒷=1,2,3,4的線偏振光學(xué)旋渦光束x方向激發(fā)的表面等離激元駐波分布;(c)(a1)原始圖像,(b1)利用SPCE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)去卷積的SPRF圖像,(c1)應(yīng)用sw-tirf算法和線性Richardson-Lucy去卷積后sw-sprf圖像;(a2)—(c2)為(a1)—(c1)選定區(qū)域的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)包絡(luò)Fig.17.[30](a)Aschematic diagram of experimental setup of SPPs generated by OV which focuses on the Ag thin fi lm; (b)excitation SPs standing wave pro fi le generated by a linearly polarized OV beam in x direction which carries the topological charge of l=1,l=2,(cl)=3,and dl=4.(c)(a1)original SPRF image,(b1)deconvolved SPRF image with SPCE PSF kernel,(c1)SW-SPRF image after applying SW-TIRF algorithm and linear Richardson-Lucy linear deconvolution; (a2)–(c2)comparison of PSF pro fi les at a selected ROI in(a1)–(c1).

該技術(shù)通過調(diào)節(jié)POV光束的分?jǐn)?shù)階拓?fù)浜?實(shí)現(xiàn)SPs條紋相移的過程,如圖19所示,拓?fù)浜煞謩e為1.33,2,2.66的POV光束實(shí)現(xiàn)0,2π/3,4π/3的相移過程,得到的成像分辨率為132 nm.

4 總結(jié)及展望

由于傳統(tǒng)顯微成像技術(shù)存在的衍射極限極大地制約了其應(yīng)用范圍,如今有越來越多的新型成像技術(shù)被提出以突破這一限制.其中結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)因其超分辨、寬場(chǎng)、快速成像的優(yōu)勢(shì),在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用價(jià)值不可忽視.近些年來SIM技術(shù)結(jié)合表面等離激元的研究進(jìn)展,發(fā)展出了PSIM技術(shù).該技術(shù)將成像分辨率提高了衍射極限頻率的3到4倍,且其成像區(qū)域受限于金屬表面,背景噪聲弱,有較好的成像對(duì)比度.本文介紹的不同PSIM成像技術(shù)的綜合參數(shù)對(duì)比見表1.此外,PSIM技術(shù)還可以與其他顯微技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生更多應(yīng)用,例如：由于SPs具有局域電磁場(chǎng)增強(qiáng)的特性,有報(bào)道將PSIM技術(shù)與Raman成像技術(shù)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)表面增強(qiáng)拉曼的寬場(chǎng)成像[33,62];在理論上PSIM可以實(shí)現(xiàn)多種波長(zhǎng)多色成像,可以使用感興趣的不同熒光分子來成像;同時(shí)PSIM技術(shù)可以通過增加激發(fā)功率,增強(qiáng)熒光分子的非線性效應(yīng),進(jìn)一步提高成像分辨率,實(shí)現(xiàn)基于SPs的飽和吸收SIM成像.

圖18[31](a)利用振幅濾波器實(shí)現(xiàn)激發(fā)光變成為一對(duì)較小的半弧如綠色半弧所示;(b)在銀膜中心相向傳播SPS波形成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的SP駐波模式;(c)利用分?jǐn)?shù)階拓?fù)浜傻墓鈱W(xué)旋渦實(shí)現(xiàn)精確的相移{-2π/3,0,2π/3}Fig.18.[31](a)The excitation position was cut to a smaller pair of arcs showed as green solid arcs by amplitude fi lter; (b)a standard SP-standing-wave pattern with uniform periodicity could be generated by two counter-propagate SPs waves toward the silver fi lm center;(c)precise phase shifts of{-2π/3,0,2π/3}achieved by OVs with fractional topological charges.

圖19[32](a),(b)PSIM系統(tǒng)的示意圖;(c)具有分?jǐn)?shù)階拓?fù)浜傻耐昝拦鈱W(xué)旋渦;(d)原始的熒光圖像;(e)經(jīng)過三步相移算法重構(gòu)得到的超分辨熒光圖像;(f)對(duì)應(yīng)于(e)紅色線表示的強(qiáng)度分布,表明具有132 nm的成像分辨率Fig.19.[32](a),(b)Experimental setup for PSIM system;(c)perfect optics vortex with fractional topological charges; (d)origianl fl uorescence images;(e)super-resolved fl uorescence image by applied reconstructed algorithm to three inter media images;(f)the corresponding fl uorescence intensity cross-section in(e)shows the optical resolution(132 nm).

表1 不同PSIM成像技術(shù)的綜合參數(shù)對(duì)比Table 1.Comparison of di ff erent PSIM imaging techniques.

需要指出的是,雖然PSIM技術(shù)擁有諸多優(yōu)勢(shì),但其局限性也十分明顯：由于SPs是一種表面倏逝,所以其成像區(qū)域限定為距離金屬表面200 nm左右范圍內(nèi),只能實(shí)現(xiàn)近金屬表面樣品的二維平面成像;結(jié)構(gòu)型PSIM成像可以實(shí)現(xiàn)更高的成像分辨率,但受限于結(jié)構(gòu)固定,不易動(dòng)態(tài)調(diào)控,且信噪比、成像維度也受到影響;全光型PSIM成像均采用高數(shù)值孔徑聚焦,成像區(qū)域受到SPs干涉區(qū)域大小的限制.并且現(xiàn)在已有的PSIM成像報(bào)道,主要是通過熒光小球進(jìn)行分辨率的標(biāo)定,尚缺乏對(duì)于實(shí)際生物樣品的檢測(cè).同時(shí)現(xiàn)有PSIM成像研究都是基于一些基本的假設(shè)：如熒光強(qiáng)度與SPs條紋的相對(duì)線性相關(guān);形成的SPs條紋周期不會(huì)因?yàn)楸砻鏌晒夥肿拥姆植籍a(chǎn)生變化;不考慮金屬表面對(duì)于熒光淬滅的影響等.所以現(xiàn)有的PSIM成像技術(shù)還遠(yuǎn)不夠完善,仍有待于進(jìn)一步深入研究和發(fā)展.相信隨著該技術(shù)的不斷研發(fā)和改進(jìn),這些難題終將被解決,最終形成可實(shí)用化的新型超分辨光學(xué)顯微成像儀器,為生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域做出突出貢獻(xiàn).

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PACS:87.64.M—,65.40.gp,73.30.+y DOI:10.7498/aps.66.148701

Research progress of plasmonic structure illumination microscopy?

Zhang Chong-LeiXin Zi-Qiang Min Chang-Jun?Yuan Xiao-Cong?
(Nanophotonics Research Center,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China)

29 March 2017;revised manuscript

27 April 2017)

Structure illumination microscopy(SIM)is a novel imaging technique with advantages of high spatial resolution, wide imaging field and fast imaging speed.By illuminating the sample with patterned light and analyzing the information about Moiré fringes outside the normal range of observation,SIM can achieve about 2-fold higher in resolution than the di ff raction limit,thus it has played an important role in the field of biomedical imaging.In recent years,to further improve the resolution of SIM,people have proposed a new technique called plasmonic SIM(PSIM),in which the dynamically tunable sub-wavelength surface plasmon fringes are used as the structured illuminating light and thus the resolution reaches to 3–4 times higher than the di ff raction limit.The PSIM technique can also suppress the background noise and improve the signal-to-noise ratio,showing great potential applications in near-surface biomedical imaging.In this review paper,we introduce the principle and research progress of PSIM.In Section 1,we fi rst review the development of optical microscope,including several important near- field and far- field microscopy techniques,and then introduce the history and recent development of SIM and PSIM techniques.In Section 2,we present the basic theory of PSIM,including the dispersion relation and excitation methods of surface plasmon,the principle and imaging process of SIM,and the principle of increasing resolution by PSIM.In Section 3,we review the recent research progress of two types of PSIMs in detail.The fi rst type is the nanostructure-assisted PSIM,in which the periodic metallic nanostructures such as grating or antenna array are used to excite the surface plasmon fringes,and then the shift of fringes is modulated by changing the angle of incident light.The resolution of such a type of PSIM is mainly dependent on the period of nanostructure, thus can be improved to a few tens of nanometers with deep-subwavelength structure period.The other type is the alloptically controlled PSIM,in which the structured light with designed distribution of phase or polarization(e.g.optical vortex)is used as the incident light to excite the surface plasmon fringes on a fl at metal fi lm,and then the fringes are dynamically controlled by modulating the phase or polarization of incident light.Without the help of nanostructure, such a type of PSIM usually has a resolution of about 100 nm,but bene fi ts from the structureless excitation of plasmonic fringes in an all-optical con fi guration,thereby showing more dynamic regulation and reducing the need to fabricate nanometer-sized complex structures.In the fi nal Section,we summarize the features of PSIM and discuss the outlook for this technique.Further studies are needed to improve the performance of PSIM and to expand the scope of practical applications in biomedical imaging.

structure illumination microscopy,super-resolution imaging,surface plasmon

:87.64.M—,65.40.gp,73.30.+y

10.7498/aps.66.148701

?國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào)：61427819,61422506,61605118)、國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)：2015CB352004)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(批準(zhǔn)號(hào)：2016YFC0102401)資助的課題.

?通信作者.E-mail：cjmin@szu.edu.cn

?通信作者.E-mail：xcyuan@szu.edu.cn

?2017中國(guó)物理學(xué)會(huì)Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61427819,61422506,61605118),the National Basic Research Program of China(Grant No.2015CB352004),and the National Key Research and Development Program of China(Grant No.2016YFC0102401).

?Corresponding author.E-mail：cjmin@szu.edu.cn

?Corresponding author.E-mail：xcyuan@szu.edu.cn