火龍果離體培養(yǎng)莖段滅菌及芽誘導(dǎo)增殖研究

牟海飛，劉潔云，黃永才，鄧福斌，吳艷艷，黃偉華，吳代東，梁桂東，黃黎芳

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.三亞緣之海農(nóng)業(yè)科技有限公司，海南 三亞 572000；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，廣西 南寧 530007)

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火龍果離體培養(yǎng)莖段滅菌及芽誘導(dǎo)增殖研究

牟海飛1，劉潔云1，黃永才1，鄧福斌2，吳艷艷1，黃偉華1，吳代東1，梁桂東3，黃黎芳3

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.三亞緣之海農(nóng)業(yè)科技有限公司，海南 三亞 572000；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，廣西 南寧 530007)

【目的】探討火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)增殖技術(shù)，為研發(fā)火龍果組織培養(yǎng)技術(shù)提供支撐。【方法】以桂紅龍1號火龍果莖段為外植體，研究不同因素對火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)增殖過程的影響?！窘Y(jié)果】莖段大小是影響滅菌效果的主要因素，其次是滅菌時間，莖段老熟程度的影響相對較小。滅菌時間對芽誘導(dǎo)的影響最大，6-BA濃度次之，莖段老熟程度和莖段大小對芽誘導(dǎo)影響較小，且差別不大。6-BA 4.0 mg/L時芽誘導(dǎo)效果最佳。6-BA濃度越高，芽增殖倍數(shù)越高，但當(dāng)6-BA達(dá)到4.0 mg/L時，芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。IAA的芽增殖效果優(yōu)于NAA，IAA為0.1 mg/L時芽增殖效果較好。在培養(yǎng)基中添加PP333對抑制玻璃化促進(jìn)火龍果組培苗繼代增殖的效果優(yōu)于AC。【結(jié)論】適宜莖段滅菌及芽誘導(dǎo)的方案為：選取生長1個月左右的健康莖段，切成含1個芽眼的小段，用0.1 %HgCl2溶液滅菌10 min，將滅菌的莖段接種至MS+6-BA 4.0 mg/L培養(yǎng)基。適宜芽繼代增殖的培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+PP333 1.0 mg/L。

火龍果；離體培養(yǎng)；滅菌；繼代增殖

【研究意義】火龍果(Hylocereusundatus)又稱紅龍果、芝麻果、仙蜜果等，為仙人掌科量天尺屬的果用栽培種?；瘕埞麪I養(yǎng)豐富，屬高纖低糖、低脂肪食品，其花和果實可加工成各種營養(yǎng)保健品[1]?；瘕埞N植具有較好的經(jīng)濟(jì)效益，近年來，我國廣西、廣東、海南、云南、貴州和福建等省區(qū)均有較大面積栽培，已成為農(nóng)業(yè)的新、優(yōu)、特、高開發(fā)項目[2]。目前，火龍果在生產(chǎn)上基本采用扦插繁殖。近年來火龍果種植發(fā)展迅速，火龍果種苗需求旺盛，由于大量從田間采集莖段作為種源，因此出現(xiàn)了種苗來源不明、品種雜亂等現(xiàn)象，特別是莖段攜帶潰瘍病等重大病蟲的情況難以避免，種苗的不健康隱患對生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。組織培養(yǎng)具有環(huán)境因子可人工控制，繁殖周期短，速度快，效率高，可周年生產(chǎn)，節(jié)省材料，保持植物原有優(yōu)良性狀等優(yōu)勢，利用組織培養(yǎng)技術(shù)能有效解決現(xiàn)階段火龍果種苗健康、品種純度等方面的問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，有一些學(xué)者對火龍果組織培養(yǎng)進(jìn)行研究。黃春華等[3]研究表明，火龍果外植體的選擇以近老化莖段為宜，試驗品種蜜寶火龍果適宜使用較低濃度的激素，可能是品種差異導(dǎo)致材料對激素的敏感程度不同。王云山等[4]發(fā)現(xiàn)火龍果外植體芽眼的叢刺處容易出現(xiàn)污染，這是由于芽眼處有成叢的葉刺，很難清洗干凈，消毒劑也較難透入，滅菌很難徹底。彭綠春等[5]研究認(rèn)為保留火龍果外植體刺座上小刺和絨毛更利于誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)，推測拔除小刺和絨毛的過程中，有可能使不定芽原基造成損傷，或不定芽原基被直接拔除。劉穎等[6]對火龍果芽增殖、伸長的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，結(jié)果表明適宜火龍果芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L，適宜火龍果芽伸長的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+ IAA 0.5 mg/L。張領(lǐng)等[7]選取火龍果莖段上芽刺座進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)分化、增殖，得出適宜繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 9.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，增殖倍數(shù)達(dá)12倍?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關(guān)火龍果組織培養(yǎng)的研究較少，主要集中在外源激素對火龍果組培增殖及生根的影響方面，且不同品種的火龍果適宜的培養(yǎng)基不同，有關(guān)火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)的影響因子、組培苗繼代增殖過程中的玻璃化問題研究尚未見深入報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以火龍果莖段為外植體，研究莖段老嫩程度、外植體大小、滅菌時間和6-BA濃度對滅菌及芽誘導(dǎo)過程的影響；研究細(xì)胞分裂素和生長素的種類和濃度對火龍果離體培養(yǎng)增殖的影響，以及不同濃度的活性炭(AC)、多效唑(PP333)對降低火龍果繼代過程中芽玻璃化率的效果，篩選出適宜的火龍果外植體滅菌及芽誘導(dǎo)增殖方案，為研發(fā)火龍果組織培養(yǎng)技術(shù)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為火龍果品種桂紅龍1號，由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo) 選擇生長健壯、無病蟲害的火龍果莖段，用洗潔精溶液刷洗表面，芽眼處重點刷洗，流水沖洗30 min。

外植體滅菌及芽誘導(dǎo)處理采用L9(34)正交試驗設(shè)計(表1)，設(shè)4個因子，莖段老熟程度：分別選擇生長1、3和5個月的莖段；莖段大?。悍謩e含1、2 和3個芽眼，其中含1個和2個芽眼的莖段處理方式為將莖段沿波浪形棱緣縱切成棱片(即去除髓部)，再將棱片分別橫切成大小相似的含1 和2個芽眼的小段，含3個芽眼的莖段處理方式為不去除髓部，直接將莖段橫切成大小相似的含3個芽眼的小段；滅菌時間：分別用0.1 %HgCl2(加1～2滴吐溫80)浸泡6、10和14 min，無菌水沖洗4次后，用無菌濾紙吸干表面水分；6-BA濃度：以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(2.0，3.0和4.0 mg/L)作為火龍果莖段芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復(fù)。觀察并記錄莖段污染情況和芽誘導(dǎo)情況。

1.2.2 火龍果組培增殖 以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA濃度設(shè)置為：2.0、3.0、4.0 mg/L，生長素選用NAA和IAA，生長素濃度設(shè)置為：0.1、0.5 mg/L，分別與不同濃度的6-BA組合。將誘導(dǎo)出的不定芽接種至不同培養(yǎng)基，每個處理接種30瓶，每瓶接種6個芽，3次重復(fù)。觀察并記錄芽增殖倍數(shù)及生長情況。

將上一個試驗篩選出的最佳培養(yǎng)配方作為基本培養(yǎng)基，分別添加活性炭(AC)、多效唑(PP333)，AC濃度：0、0.3、0.6、0.9、1.2 g/L，PP333濃度：0、0.2、0.5、1.0、1.5 mg/L。一共進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)，每次繼代篩選健康無玻璃化現(xiàn)象的芽接種至上述培養(yǎng)基，每個處理接種30瓶，每瓶接種6個芽，3次重復(fù)，觀察并記錄3次繼代培養(yǎng)的芽增殖倍數(shù)及玻璃化率。

表1 火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)正交試驗因素水平

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基內(nèi)均含3 %蔗糖和0.5 %瓊脂，培養(yǎng)基pH(5.8±0.1)，于121 ℃高溫下滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為(28±2)℃，光照強(qiáng)度為1500～2000 lx，光照時長為12 h/d。

1.3 統(tǒng)計分析

莖段污染及芽誘導(dǎo)情況均于接種后1周開始觀察，2周統(tǒng)計結(jié)果。芽增殖情況、玻璃化率接種后1周觀察1次，30 d統(tǒng)計結(jié)果。

污染率( %)=莖段污染數(shù)/接種的莖段總數(shù)×100

芽誘導(dǎo)率( %)=發(fā)芽的芽眼數(shù)/接種的芽眼數(shù)×100

芽增殖倍數(shù)=培養(yǎng)后的芽總數(shù)/接種的芽總數(shù)

玻璃化率( %)=玻璃化的芽數(shù)/生長的芽數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)的影響

從表2～3可以看出，不同處理組合對火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)存在較大影響。在莖段滅菌階段，R值大小順序為：B(29.62)>C(15.48)>A(5.97)，莖段大小是影響滅菌污染率的主要因素，其次是滅菌時間，莖段老熟程度的影響相對較小。根據(jù)不同因素K值可知，污染率最低的處理為：莖段老熟程度為1個月，莖段大小為含1個芽眼，滅菌時間14 min。在芽誘導(dǎo)階段，R值大小順序為：C(27.17)>D(14.06)>A(3.01)>B(2.34)，滅菌時間對火龍果莖段芽誘導(dǎo)的影響最大，6-BA濃度次之，莖段老熟程度和莖段大小對芽誘導(dǎo)影響較小，且差別不大。根據(jù)不同因素K值可知，火龍果芽誘導(dǎo)率最高的處理為：莖段老熟程度為3個月，莖段大小為含3個芽眼，滅菌時間6 min，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 4.0 mg/L。莖段老熟程度、莖段大小和滅菌時間3個因子對污染率和誘導(dǎo)率的影響正好相反，從K值可知，火龍果莖段滅菌最佳處理方案的芽誘導(dǎo)效果最差。其中滅菌時間對污染率和誘導(dǎo)率的影響較大，根據(jù)表2的試驗結(jié)果，0.1 %HgCl2滅菌10min效果相對較好。而莖段老熟程度、莖段大小對芽誘導(dǎo)影響較小，因此莖段老熟程度為1個月，莖段大小為含1個芽眼，滅菌時間10 min的處理方法對污染率和誘導(dǎo)率影響效果相對較好。

表2 不同處理對火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)的影響

表3 火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)試驗直觀分析

表4 不同處理對火龍果芽增殖的影響

2.2 不同處理對火龍果繼代增殖的影響

由表4可知，不同濃度的6-BA對火龍果芽增殖的影響不同，可以看出，6-BA濃度越高，芽增殖倍數(shù)越高，但當(dāng)6-BA達(dá)到4.0 mg/L時，火龍果芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，影響其生長。NAA和IAA 2種生長素對火龍果芽增殖的影響效果不同，總體看來，添加IAA的培養(yǎng)基芽增殖倍數(shù)高于添加NAA的培養(yǎng)基，且芽生長情況也相對較好。IAA為0.5 mg/L時各處理的芽增殖倍數(shù)總體高于IAA為0.1 mg/L時，但芽的玻璃化現(xiàn)象也相對嚴(yán)重。綜合各因素后可以得出，以MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L的芽增殖效果最佳，芽增殖倍數(shù)為4.71，芽粗壯，生長正常。

2.3 不同濃度活性炭對火龍果繼代增殖的影響

由表5可知，培養(yǎng)基中不添加活性炭，火龍果芽的玻璃化率會隨著繼代次數(shù)的增加而上升，第3次繼代已達(dá)到38.22 %，芽增殖倍數(shù)先上升后顯著下降，第3次繼代為3.03。添加活性炭能有效降低玻璃化率，活性炭濃度為1.2 g/L時，3次繼代的玻璃化率為零。但隨著活性炭濃度的升高，第1次繼代和第2次繼代的芽增殖倍數(shù)呈下降趨勢，且不定芽顏色黃綠，生長緩慢。當(dāng)添加活性炭濃度為0.6 g/L時，芽生長情況較好，3次繼代的芽增殖倍數(shù)相對穩(wěn)定，平均4.23，玻璃化率較低且增幅小。

2.4 不同濃度多效唑?qū)瘕埞^代增殖的影響

從表6可以看出，隨著繼代次數(shù)的增加，各處理的玻璃化率呈上升趨勢。PP333對降低火龍果玻璃化率效果較好，添加PP333的處理玻璃化率都低于對照，且PP333還具有壯苗效果，與對照相比不定芽生長更健壯，第2、3次繼代時壯苗效果顯著?？傮w而言，隨著PP333濃度的增加，芽增殖倍數(shù)和玻璃化率先上升后下降。其中，PP333濃度為1.0 mg/L時效果最佳，3次繼代的平均芽增殖倍數(shù)為5.03，第2次繼代玻璃化率0.81 %，第3次繼代玻璃化率2.00 %。

表5 不同濃度活性炭對火龍果繼代增殖的影響

表6 不同濃度多效唑?qū)瘕埞^代增殖的影響

3 討 論

污染、褐化、玻璃化三大問題被認(rèn)為是植物組培的三大難題，其中污染最容易發(fā)生[8]。在外植體滅菌過程中，有很多因素會造成污染。外植體越大，滅菌越困難。尤其是火龍果莖段芽眼處有叢生的葉刺和絨毛，滅菌劑難滲入，是火龍果滅菌的重點部位。HgCl2滅菌劑浸泡時間越長，滅菌效果越好，污染率越低。但HgCl2毒性非常強(qiáng)，易對外植體造成毒害作用，影響發(fā)芽率。植株在自然環(huán)境下生長時間越長帶菌越多[9]，以幼嫩莖段作為外植體可降低污染率。

細(xì)胞分裂素在植物組培中的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化，誘導(dǎo)不定芽的形成。較低濃度的生長素配合細(xì)胞分裂素使用，可以促進(jìn)細(xì)胞伸長，以及不定芽的萌發(fā)和生長[10]。培養(yǎng)基中6-BA達(dá)到一定濃度后火龍果組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，與其他有關(guān)高濃度激素誘導(dǎo)組培苗玻璃化的報道相一致[11]。6-BA濃度偏低時莖段芽增殖倍數(shù)較低，且芽生長到一定長度后頂端壞死停止生長。本試驗選用NAA和IAA 2種生長素與6-BA組合誘導(dǎo)火龍果莖段芽增殖，誘導(dǎo)效果IAA>NAA。IAA是植物中生長素的主要活性成分[12]，添加生長素IAA更有利于火龍果莖段芽增殖。

火龍果在繼代培養(yǎng)過程中極易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致組培苗增殖倍數(shù)降低，生長異常。玻璃化是植物在離體繁殖過程中出現(xiàn)的一種形態(tài)和生理異常的狀態(tài)[13]。這種異常狀態(tài)對再生苗組織造成不可逆轉(zhuǎn)的變化和傷害，影響再生苗的正常生長[14]，嚴(yán)重影響組培苗的快速繁殖?；钚蕴?AC)是一種性能優(yōu)良的吸附劑，將適量的活性炭添加在培養(yǎng)基中能減少一些有害物質(zhì)對組培苗的影響[15-16]。多效唑( PP333)是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，具有延緩植物生長，抑制莖稈伸長，增加植物抗逆性，提高產(chǎn)量等效果[17]。本試驗分別在培養(yǎng)基中添加AC、PP333，2種物質(zhì)對火龍果組培苗玻璃化都具有抑制作用。由于AC的吸附能力不具備選擇性，不僅吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，也會吸附營養(yǎng)物質(zhì)，對組培苗的生長造成影響[18]。根據(jù)試驗結(jié)果，PP333對抑制玻璃化促進(jìn)火龍果組培苗繼代增殖的效果優(yōu)于AC。

4 結(jié) 論

適宜火龍果莖段滅菌及芽誘導(dǎo)的外植體處理方案為：選取生長1個月左右的健康火龍果莖段，去除髓部切成含1個芽眼的小段，用0.1 %HgCl2溶液滅菌10 min，將滅菌的莖段接種至MS+6-BA 4.0 mg/L培養(yǎng)基。適宜火龍果芽繼代增殖的培養(yǎng)基配方為：MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+PP333 1.0 mg/L。

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(責(zé)任編輯 汪羽寧)

Study on Stem Disinfection, Bud Induction and Proliferation ofHylocereusundatusin Vitro Culture

MOU Hai-fei1, LIU Jie-yun1, HUANG Yong-cai1, DENG Fu-bin2, WU Yan-yan1,HUANG Wei-hua1, WU Dai-dong1, LIANG Gui-dong3, HUANG Li-fang3

(1. Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China; 2. Sanya Yuanzhihai Agricultural Science and Technology Co. Ltd., Hainan Sanya 572000, China; 3. Horticultural Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007, China)

【Objective】Hylocereusundatusstem disinfection, bud induction and proliferation were explored during tissue culture to provide technical support for mass seedling production. 【Method】Taken stem ofHylocereusundatuscultivar Guihonglong No.1 as the explants, the effects of different factors on stem disinfection, bud inducement and proliferation were studied.【Result】Stem size was the main factor affecting the pollution rate of stem disinfection, followed by the effect of sterilization time and stem mature degrees. The sterilization time had the greatest influence on the bud induction, followed by the 6-BA concentration. Both the stem mature degrees and stem size had little effect on bud induction. 6-BA 4.0 mg/L had the best induction effect. The higher concentration of 6-BA showed the higher multiplication ratio of buds, but when 6-BA concentration reached 4.0 mg/L, the buds appeared vitrification. The effect of IAA was better than that of NAA, and the effect of bud proliferation was better when IAA was 0.1 mg/L. PP333 was better than AC in inhibiting vitrification and promoted subculture multiplication ofHylocereusundatus.【Conclusion】The optimal treatment for stem disinfection and bud induction was suggested as:sliced the health stems of about 1 months into pieces with single bud, and disinfected them with 0.1 % HgCl2solution, and inoculated the explants in medium of MS+6-BA 4.0 mg/L. The optimal medium for bud proliferation was MS+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L+PP333 1.0 mg/L.

Hylocereusundatus; Vitro culture; Disinfection; Subculture multiplication

1001-4829(2017)6-1439-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.034

2017-03-11

廣西自然科學(xué)基金項目“火龍果花粉超低溫保存研究”(2016GXNSFBA380107)；廣西特色水果(火龍果)創(chuàng)新團(tuán)隊(nycytxgxcxtd-04-19-6)；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基金科研業(yè)務(wù)專項項目“火龍果莖段組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究”(2015JM31)

牟海飛(1968-)，男，廣西玉林人，碩士，副研究員，主要從事作物的資源收集評價、品種選育、組培快繁、栽培等方面的研究和技術(shù)推廣服務(wù)工作，E-mail:haifei5052@126.com。

S667.9

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