煙草酚酸和有機(jī)酸對黑脛病菌生長的影響

白羽祥，朱 媛，楊煥文，王 戈**，徐照麗，李正風(fēng)

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205；3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650201；4.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南 昆明 650201)

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煙草酚酸和有機(jī)酸對黑脛病菌生長的影響

白羽祥1，朱 媛2*，楊煥文1，王 戈1**，徐照麗3，李正風(fēng)4

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205；3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650201；4.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，云南 昆明 650201)

【目的】探討煙草根系分泌物中酚酸和有機(jī)酸對煙草黑脛病菌生長的影響，為明確根系分泌物組分與黑脛病菌互作機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】采用外源添加方法，比較了不同酚酸和有機(jī)酸對黑脛病菌菌絲生長、孢子囊產(chǎn)生量及游動孢子的影響?！窘Y(jié)果】不同酚酸物質(zhì)在低濃度時(shí)促進(jìn)了黑脛病菌菌絲生長和孢子囊產(chǎn)生量，但隨著濃度增加促進(jìn)作用減小甚至轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?；除高濃度香草酸和香豆酸直接抑制游動孢子釋放，其他酚酸各濃度均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。除添加0.05 g/L蘋果酸表現(xiàn)為促進(jìn)作用外，其他有機(jī)酸對黑脛病菌菌絲生長具表現(xiàn)為抑制作用；蘋果酸、乳酸和富馬酸對孢子囊產(chǎn)生和游動孢子釋放表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)高濃度抑制，而草酸、酒石酸和丁二酸在各濃度下均表現(xiàn)為抑制作用；另外，乙酸基本完全抑制孢子囊產(chǎn)生和游動孢子釋放?！窘Y(jié)論】不同酚酸和有機(jī)酸對黑脛病生長的影響存在差異，其促進(jìn)或抑制作用取決于酚酸和有機(jī)酸種類及濃度。

煙草；黑脛病；酚酸；有機(jī)酸；菌落生長

【研究意義】煙草黑脛病菌(Phytophoraparasiticavar.nicotiana)是可給烤煙帶來毀滅性土傳病害的一種病菌，其對煙草的毀滅性巨大且蔓延比較迅速，一旦被侵染則會導(dǎo)致煙株整株死亡，該病在全國各地的煙區(qū)均有發(fā)生，云南煙區(qū)是黑脛病的多發(fā)區(qū)，每年因其造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[1]。我國大部分地區(qū)烤煙連作障礙現(xiàn)象嚴(yán)重，前人研究表明，連作的烤煙種植面積占中國烤煙總種植面積的30%～60%，由連作帶來的經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)嚴(yán)重[2]。長期連作會導(dǎo)致植煙土壤理化性質(zhì)惡化、土壤養(yǎng)分失衡、土傳病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，進(jìn)一步導(dǎo)致烤煙生長發(fā)育進(jìn)程受阻，產(chǎn)質(zhì)量下降[3-5]，從而使中國煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重阻礙?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】前人研究表明，植株的根系分泌物在其抗病機(jī)制中扮演著重要的角色[6-8 [9-12]。酚酸類物質(zhì)和有機(jī)酸物質(zhì)是植物根系分泌物的一部分，而且前者還是前人研究中公認(rèn)的化感物質(zhì)之一。苯甲酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、香草酸、鄰苯二甲酸會抑制禾頂囊殼菌[Gaeumannomycesgraminis(Sacc.) v. Arx. & Olivier]、平臍蠕胞菌[Bipolarissorokiniana(Sacc.) Shoem]、禾谷絲核菌[RhizoctoniacerealisV ander H oeven]的菌絲生長[13]，丁香酸和香草酸對西洋參立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的生長呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的影響，西洋參根腐菌(Phytophthoracinnamomi)的生長會受到阿魏酸和香豆素的促進(jìn)作用[14]，酚酸類物質(zhì)的濃度會在一定程度上影響細(xì)菌和放線菌的生長和繁殖，具體表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而高濃度抑制[12]，再者，外源酚酸類物質(zhì)可以為真菌提供碳源并促進(jìn)其生長和繁殖[15]。多酚氧化酶活性和黃瓜對炭疽病的抗性都會受到草酸的不同程度影響[16-17]，鄰苯二甲酸和丙二酸對半裸鐮孢菌(Fusariumsemitectum)、粉紅粘帚菌(Gliocladiumroseum)和尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum.f.sp.cucmrium)存在促進(jìn)或抑制作用[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】但是，煙草根系分泌物中酚酸和有機(jī)酸的種類對煙草黑脛病菌有何作用，以往的研究中并未涉及?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，課題組基于前期對煙草根系分泌物中的酚酸和有機(jī)酸組分的鑒定結(jié)果[19]，采用外源添加方法，設(shè)置不同濃度梯度并研究了不同酚酸和有機(jī)酸對煙草黑脛病的影響，以期豐富煙草黑脛病抗性機(jī)制研究以及為今后開展生物防治煙草土傳病害提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

酚酸標(biāo)準(zhǔn)品為香豆酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、香草酸(上?；瘜W(xué)試劑公司，中國)；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品為檸檬酸、草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、丁二酸、馬來酸、酒石酸(上?；瘜W(xué)試劑公司，中國)。以上試劑均為分析純，試驗(yàn)過程中采用無菌超純水，試驗(yàn)器材經(jīng)過高溫滅菌。供試病原菌為煙草黑脛病病菌(phytophoraparasiticavar.nicotiana)，病原菌采用PDA進(jìn)行斜面活化，再采用燕麥培養(yǎng)基(OA，1000 mL培養(yǎng)基中含燕麥片30.0 g，瓊脂20.0 g)進(jìn)行純培養(yǎng)，于黑暗中27 ℃下培養(yǎng)7 d后待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 有機(jī)酸、酚酸儲備液配制 分別稱取0.2000 g的對羥基苯甲酸、香豆酸、香草酸、阿魏酸、丁香酸，分別溶于5 mL的甲醇中并用超純水定容至100 mL，最終制備出濃度為2.0 g/L的酚酸類物質(zhì)儲備液。分別稱取0.5000 g的酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、草酸、乳酸、馬來酸、丁二酸，用超純水定容至100 mL，最終制備出濃度為5.0 g/L的有機(jī)酸儲備液。用G4漏斗，0.22 μm微孔過濾膜過濾以上兩種儲備液備用。

1.2.2 含有機(jī)酸、酚酸培養(yǎng)基的制備 將0.20、0.40、2.00和4.00 mL有機(jī)酸儲備液分別與19.80、19.60、18.00和16.00 mL燕麥培養(yǎng)基均勻混合，制成有機(jī)酸濃度為0.05、0.10、0.50和1.00 g/L培養(yǎng)基備用。以不加有機(jī)酸的培養(yǎng)基為對照組，每個(gè)濃度設(shè)置四次重復(fù)。將0.10、0.50、1.00和5 mL的酚酸儲備液分別與19.9、19.5、19.0和15.0 mL燕麥培養(yǎng)基均勻混合，制成酚酸濃度為0.01、0.05、0.10和0.50 g/L培養(yǎng)基備用，以含有1 mL甲醇的培養(yǎng)基為對照，每濃度設(shè)置4次重復(fù)。

1.2.3 不同有機(jī)酸和酚酸對黑脛病菌菌落直徑的影響 采用滅菌打孔器(Ф=0.5 cm)打取生長均勻菌絲塊，并分別接種到上述培養(yǎng)基中[19]。接種后培養(yǎng)皿于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后用直尺測定菌落生長直徑，分別以添加等體積的無菌水和含有1 mL甲醇的培養(yǎng)基作為對照。

1.2.4 不同有機(jī)酸和酚酸對黑脛病菌孢子囊產(chǎn)生量和游動孢子釋放率的影響 將上述培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，采用滅菌打孔器(Ф=0.5 cm)打取生長均勻菌絲塊并將其移入含有15 mL 0.2% KNO3(W/V) 滅菌去離子水培養(yǎng)皿中[20]。28 ℃條件下黑暗誘導(dǎo)5 d后調(diào)查孢子囊數(shù)目和游動孢子釋放情況。具體操作為：將誘導(dǎo)后菌絲塊充分混勻并隨機(jī)挑取4塊菌絲塊，采用顯微鏡(10×16)觀察3視野并計(jì)算每個(gè)視野的孢子囊數(shù)目，每個(gè)處理重復(fù)觀測4次。將上述處理培養(yǎng)基置4 ℃冰箱保存0.5 h，28 ℃條件下黑暗誘導(dǎo)24 h后取出，室溫放置0.5 h后，隨機(jī)鏡檢5視野，觀察游動孢子釋放情況[21]，并計(jì)算每個(gè)視野空殼孢子囊數(shù)占視野總孢子囊數(shù)的百分比[22]。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=4。不同小寫字母表示不同濃度間差異達(dá)5%顯著水平(P<0.05)。下同Data was average ± standard deviation, n=4. Different lowercase indicated significant difference in different concentration at 5% level. The same as below圖1 不同酚酸對黑脛病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effect of different phenolic acid on mycelial growth of P. parasitica var.nicotiana

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2013對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理和圖表制作，同時(shí)采用SPSS13.0 進(jìn)行方差分析(One way ANOVA)并利用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸對黑脛病菌生長的影響

2.1.1 酚酸對黑脛病菌菌絲生長的影響 不同酚酸在不同作用濃度下對菌絲生長的影響存在差異，均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)而隨著作用濃度升高逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?。對羥基苯甲酸對菌絲生長作用拐點(diǎn)為0.01 g/L，濃度為0.05 g/L時(shí)菌落直徑顯著低于對照；香草酸的作用拐點(diǎn)為0.05，0.10 g/L后均顯著抑制菌絲生長；丁香酸的作用拐點(diǎn)為0.05 g/L，且在0.50 g/L時(shí)顯著抑制菌絲生長；香豆酸的作用拐點(diǎn)為0.05 g/L，且在0.10 g/L后顯著抑制菌絲生長。

圖2 不同酚酸對煙草黑脛病菌孢子囊產(chǎn)生量的影響Fig.2 Effect of different phenolic acids on sporangium yield of P. var.nicotiana

圖3 不同酚酸對煙草黑脛病菌游動孢子釋放率的影響Fig.3 Effect of different phenolic acid on zoopore release rate of P. parasitica var.nicotiana

以上結(jié)果說明，酚酸物質(zhì)對黑脛病菌絲的生長作用取決于酚酸的作用濃度，均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。

2.1.2 酚酸對黑脛病菌孢子囊產(chǎn)生量的影響 不同酚酸對黑脛病孢子囊生成量的影響均表現(xiàn)低濃度促進(jìn)而隨著作用濃度升高逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?。對羥基苯甲酸、丁香酸和香豆酸在0.10 g/L之前均不程度促進(jìn)了孢子囊的生成，而之后則表現(xiàn)為抑制作用，且0.10 g/L后均顯著抑制了孢子囊生成量；香草酸和阿魏酸在0.01 g/L時(shí)一定程度上表現(xiàn)為促進(jìn)，之后各濃度均抑制了孢子囊生成，其中0.10 g/L后表現(xiàn)為顯著抑制。以上結(jié)果說明，酚酸物質(zhì)對孢子囊的生成影響取決于酚酸的種類和作用濃度，且表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制。

2.1.3 酚酸對黑脛病菌游動孢子釋放的影響 不同酚酸對游動孢子釋放率的影響因酚酸種類和作用濃度存在差異，但均表現(xiàn)為低濃度時(shí)促進(jìn)而隨著濃度升高促進(jìn)作用降低或表現(xiàn)為抑制作用。對羥基苯甲酸和丁香酸各濃度均促進(jìn)了游動孢子釋放，但隨濃度升高促進(jìn)作用逐步降低；香草酸和丁香酸在0.10 g/L之前表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而0.5 g/L時(shí)均直接抑制了游動孢子釋放；阿魏酸則在0.05 g/L之后表現(xiàn)為抑制作用，且0.5 g/L時(shí)均直接抑制了游動孢子釋放。以上結(jié)果說明，酚酸物質(zhì)基本上均對游動孢子釋放具有促進(jìn)作用，但濃度升高促進(jìn)作用降低或者轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

圖4 不同有機(jī)酸對黑脛病菌菌絲的影響Fig.4 Effect of different organic acid on mycelial growth of P. parasitica var.nicotiana

圖5 不同有機(jī)酸對烤煙黑脛病菌孢子囊產(chǎn)生量的影響Fig.5 Effect of different organic acid on sporangium yield of P. parasitica var.nicotiana

2.2 有機(jī)酸對黑脛病菌生長的影響

2.2.1 有機(jī)酸對黑脛病菌菌絲生長的影響 有機(jī)酸不同濃度間基本均抑制了黑脛病菌菌落生長，其抑制作用隨濃度增加而增大。草酸、酒石酸和蘋果酸從第2天后各濃度均顯著抑制了菌絲生長，且草酸1.0 g/L時(shí)菌絲被完全抑制；乳酸濃度在0.50 g/L之后顯著抑制菌絲生長；乙酸各濃度均顯著抑制菌絲生長，且濃度在0.50 g/L之后菌絲生長基本被完全抑制；馬來酸在濃度為0.10 g/L之后全部抑制菌絲生長；富馬酸在濃度0.10 g/L之后均顯著抑制菌絲生長；丁二酸各濃度也表現(xiàn)為顯著抑制，且濃度為1.0 g/L時(shí)表現(xiàn)為全部抑制。以上結(jié)果說明，有機(jī)酸基本抑制了黑脛病菌絲生長，且馬來酸、乙酸和丁二酸抑制作用最大。

2.2.2 有機(jī)酸對黑脛病菌孢子囊產(chǎn)生量的影響 除蘋果酸、乳酸和富馬酸在低濃度對孢子囊生成量有一定促進(jìn)作用外，其余有機(jī)酸顯著抑制了孢子囊生成。其中草酸和丁二酸在1.00 g/L時(shí)，乙酸在0.10 g/L之后均表現(xiàn)為完全抑制孢子囊生成。以上結(jié)果說明，大部分有機(jī)酸對孢子囊生成具有抑制作用，且草酸、丁二酸和乙酸抑制作用較大。

2.2.3 有機(jī)酸對黑脛病菌游動孢子釋放的影響 除蘋果酸、乳酸和富馬酸在低濃度對游動孢子釋放有一定促進(jìn)作用外，其余有機(jī)酸顯著抑制了孢子囊生成。其中草酸和丁二酸在1.00 g/L時(shí)，乙酸在0.10 g/L之后均表現(xiàn)為完全抑制游動孢子釋放。以上結(jié)果說明，大部分有機(jī)酸對游動孢子的釋放具有抑制作用，且草酸、丁二酸和乙酸抑制作用較大。

3 討 論

根系分泌物某些特定物質(zhì)在防御病原菌入侵中扮演重要角色[24-25]。其中根系分泌物中的酚酸物質(zhì)被認(rèn)為是最具化感潛力的物質(zhì)之一[26]，也被認(rèn)為是具有很強(qiáng)抑菌能力的一類物質(zhì)[27]。根系分泌物中的有機(jī)酸組分在促進(jìn)礦物質(zhì)溶解，改變根際土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收和降低有毒物質(zhì)毒害方面具有重要作用[24]，而有機(jī)酸對病原微生物的直接作用研究鮮見報(bào)道。本研究以酚酸和有機(jī)酸為研究對象，研究其對黑脛病菌生長的影響，豐富了煙草根系分泌物與病原菌互作機(jī)制的研究。

圖6 不同有機(jī)酸對烤煙黑脛病菌游動孢子釋放的影響Fig.6 Effect of different organic acid on zoopore release rate of Phytophora parasitica var.nicotiana

本研究中，不同酚酸種類和濃度對黑脛病菌菌絲生長、孢子囊產(chǎn)生和游動孢子釋放均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，隨著濃度升高促進(jìn)作用逐漸減小并逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?。丁香酸和酚酸混合物可以促進(jìn)潛在病原菌Kosakoniasacchari的生長[28]。2,4-二叔丁基苯酚(0.2～2.0 mg/g)和香草酸(0.05 mg/g)在低濃度時(shí)均促進(jìn)了微生物量的增加，但隨著濃度增加生物量相應(yīng)減小[29]。香豆素對西瓜?；图怄哏牭毒咦用劝l(fā)和產(chǎn)孢能力具有很強(qiáng)的抑制作用[30]。香豆酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸對西瓜專化型尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢能力的影響存在差異[31]。對羥基苯甲酸和阿魏酸基本抑制了西瓜?；图怄哏牭毒?Fusariumoxysporumf. sp.niveum)菌絲生長，而香豆酸在低濃度時(shí)對菌絲生長有一定促進(jìn)作用，而濃度超過200 mg/L后隨著濃度增加表現(xiàn)為抑制作用。結(jié)合本研究結(jié)果可以看出，外源添加酚酸可對病原菌的生長產(chǎn)生顯著影響，但具體作用方式(抑制或促進(jìn))則取決于病原菌種類及酚酸濃度。

本研究中，有機(jī)酸對黑脛病菌生長整體表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，供試有機(jī)酸基本抑制黑脛病菌菌絲的生長，而除蘋果酸、乳酸和富馬酸在低濃度時(shí)對孢子囊產(chǎn)生和游動孢子釋放有一定促進(jìn)作用外，其余有機(jī)酸均抑制了孢子囊產(chǎn)生和游動孢子釋放。高濃度的鄰苯二甲酸和丙二酸( 1.00 g/L)對半裸鐮孢菌(Fusariumsemitectum)、粉紅粘帚菌(Gliocladiumroseum)和尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)具有顯著抑制作用，而低濃度時(shí)則表現(xiàn)為促進(jìn)作用[18]。馬鈴薯根系分泌物丁二酸和檸檬酸可以刺激馬鈴薯粉痂菌(Spongosporasubterranea)的萌發(fā)[32]。有機(jī)酸對黑脛病菌生長表現(xiàn)的強(qiáng)烈抑制作用，可能是由于有機(jī)酸的加入導(dǎo)致了pH值過低，不適宜黑脛病生長，在低濃度時(shí)對pH值的干擾有限，因此對黑脛病生長影響不大甚至表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，不同酚酸種類和濃度對黑脛病菌菌絲生長、孢子囊產(chǎn)生和游動孢子釋放均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，隨著濃度升高促進(jìn)作用逐漸減小并逐步轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?，而有機(jī)酸對黑脛病菌生長整體表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用。綜上，不同酚酸和有機(jī)酸對黑脛病生長的影響存在差異，其促進(jìn)或抑制作用取決于酚酸和有機(jī)酸種類及濃度。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Effect of Phenolic and Organic Acid on Growth ofPhytophoraparasiticavar.nicotiana

BAI Yu-xiang1, ZHU Yuan2*, YANG Huan-wen1, WANG Ge1**, XU Zhao-li3, LI Zheng-feng4

(1.College of Tobacco Science, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China; 2.Institute of Agricultural Economy and Information, Yunnan Academy of Agricultural Science, Yunnan Kunming 650205, China; 3.Yunnan Academy of Tobacco Science, Yunnan Kunming 650201, China; 4.China Tobacco Yunnan Industrial Co., Ltd, Yunnan Kunming 650201, China)

【Objective】 The aims of study were to discuss the effect of phenolic and organic acids secreted from tobacco root on the growth ofphytophoraparasiticavar.nicotiana, and to provide a theoretical basis for clarifying the interaction between components of root exudates and the pathogen. 【Method】 the effect of different phenolic and organic acids on mycelial growth, sporangium yield and zoospore release rate were compared by artificially adding method. 【Result】Different phenolic acid stimulated the mycelial growth and sporangium yield at low concentration, while the effect decreased and even translated into inhibition effect with concentration increasing. Except for vanillic and cumaric acids stimulated the zoospore release rate at high concentration, the others phenolic acids all inhibited the zoospore release rate at any concentration. In addition, except for malic acid improved the mycelial growth at 0.05 g/L, the others organic acids inhibited the growth. Sporangium yield and zoospore release rate were stimulated at low concentration and inhibited at high concentration by malic acid, lactic acid and fumaric acid. However, oxalic acid, tartaric acid and succinic acid inhibited the sporangium yield and zoospore release rate in any concentration. Moreover, acetic acid completely inhibited the sporangium yield and zoospore release rate. 【Conclusion】 The different effect of phenolic and organic onPhytophoraparasiticavar.nicotianagrowth mainly depended on its species and concentration.

Tobacco;Phytophoraparasiticavar.nicotiana; Phenolic acid; Organic acid; Colony growth

1001-4829(2017)6-1364-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.022

2016-02-28

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(滇煙工科[2013]494號)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015FB145)；云南省煙草公司資助項(xiàng)目(2015YN03)；中國煙草總公司云南省公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014YN12)

白羽祥(1991-)，男，在讀碩士，主要從事煙草生理生化研究，E-mail: cotsbyx@163.com，*為共同第一作者：朱 媛，主要從事作物栽培與耕作學(xué)研究，E-mail: 15802458@qq.com，**為通訊作者：王 戈，主要從事煙草生理生化研究，E-mail: wangge302@126.com。

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