防治設(shè)施蔬菜土傳病害生防菌株B1619生物學(xué)特性的研究

王璐瑤，甘 穎，劉永峰，陳志誼*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210014)

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防治設(shè)施蔬菜土傳病害生防菌株B1619生物學(xué)特性的研究

王璐瑤1，2，甘 穎1，劉永峰1，陳志誼1，2*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210014)

【目的】生防菌株 B1619是一株能夠防控設(shè)施蔬菜土傳病害的生防菌株。本文從分泌代謝物種類、生物膜形態(tài)、最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽、微量元素、pH 和溫度方面研究生防菌株B1619 的生物學(xué)特性?！痉椒ā孔罴烟嫉?、無機(jī)鹽、微量元素、pH和溫度的研究稀釋平板法進(jìn)行；生物膜通過Msgg培養(yǎng)基培養(yǎng)?！窘Y(jié)果】生防菌株 B1619 可產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素蛋白酶培養(yǎng)基、嗜鐵素培養(yǎng)基和纖維素酶培養(yǎng)基上產(chǎn)生暈圈，幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基上未產(chǎn)生分解暈圈；可形成致密、厚實(shí)的生物膜；最適生長溫度為 27 ℃，最適 pH 為5.9，最佳碳源為甘露醇，最佳氮源為牛肉膏，微量元素丙氨酸、VB1能促進(jìn) B1619 的生長，其中丙氨酸有顯著促進(jìn)作用；無機(jī)鹽CaCl2和MgSO4促進(jìn)B1619 生長。生防菌株 B1619在 24 h前處于對數(shù)生長期，24 h生長數(shù)量最大，24 48 h之后，菌體生長基本達(dá)到穩(wěn)定；24 h 主要以菌體形式存在，24 h 之后，開始出現(xiàn)芽孢，到72 h達(dá)到90 %以上的芽孢率。【結(jié)論】B1619可以產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素，但不分泌幾丁質(zhì)酶；B1619在大多數(shù)速效碳源下生長良好，在無機(jī)氮源中的生長優(yōu)于有機(jī)氮源；適宜的溫度、pH、微量元素和無機(jī)鹽可以促進(jìn)B1619的生長；B1619的生長在48 h后基本達(dá)到穩(wěn)定。此外，電鏡觀察了B1619 24、48、72 h生長過程中的菌體形態(tài)變化。

生防菌株； B1619 ；生物學(xué)特性

【研究意義】近年來，設(shè)施蔬菜的栽培面積近逐年擴(kuò)大，重茬連作加重，使得土傳病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，一般發(fā)病導(dǎo)致減產(chǎn)20 %以上，發(fā)病嚴(yán)重者甚至絕收，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。以往主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用污染環(huán)境，危害人類健康，同時(shí)容易導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生。為了解決設(shè)施蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量之間矛盾，達(dá)到有效控制連作障礙、減少化學(xué)農(nóng)藥使用量的目的，使用生物防治技術(shù)控制設(shè)施蔬菜土傳病害的策略越來越受到國內(nèi)外科研人員的關(guān)注，并初見成效[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植病生防研究室從2008年起，以番茄枯萎菌、青枯菌為指示菌，篩選拮抗細(xì)菌，獲得生防菌株B1619，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌Baicllusamyloliquefaciens；生防菌 B1619 對枯萎病菌Fusariumoxysporum有很強(qiáng)的抑制作用；在江蘇省沭陽、銅山、溱潼多地進(jìn)行田間試驗(yàn)示范，結(jié)果表明， B1619 對設(shè)施番茄枯萎病、青枯病和線蟲病均有較好防治作用，對番茄枯萎病的田間防效達(dá)到67.5 %～75.8 %[3-4]，對線蟲病的防效達(dá)到60.217 %～70.9 %，并且對番茄植株有一定的促生作用[3-4](待發(fā)表)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究通過實(shí)驗(yàn)室保存的菌株，對B1619的基本生物學(xué)特性和本試驗(yàn)主要針對 B1619 的最佳實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件和生物學(xué)特性進(jìn)行研究，揭示B1619的基本特性和生長規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為今后深入研究 B1619 的防病機(jī)理、提高其防效和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 生防菌株 B1619，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPG培養(yǎng)基[5]：葡萄糖 5 g，胰蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，定容至1000 mL,pH 7.0。

YPGA培養(yǎng)基[5]：葡萄糖 5 g，胰蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，瓊脂粉 18 g，定容至 1000 mL, pH 7.0。

NA 培養(yǎng)基[6]：牛肉浸膏 3 g，酵母膏 1 g，蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，定容至 1000 mL, pH 7.0。

蛋白酶培養(yǎng)基[7]： 脫脂奶粉 8 g，溶于300 mL水中，pH 7.0， 120 ℃ 滅菌 10 min；瓊脂8 g，定容至 300 mL，pH 7.0，120 ℃ 滅菌 20 min，A與B分別滅菌后混合。

嗜鐵素培養(yǎng)基[8]：A: 60.5 mg 鉻天青S溶于 50 mL去離子水；10 mL三價(jià)鐵溶液(1 mmol/L FeCl3·6H2O，10 mmol/L 鹽酸為溶劑)； 72.9 mg CTAB 溶于 40 mL去離子水；上述 3 個(gè)溶液混合定容至 100 mL， pH 調(diào)至中性，120 ℃ 滅菌 20 min。B: 30．24 g Pipes 加入 900 mL WA 培養(yǎng)基，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。A、B 液混合倒平板。

纖維素酶培養(yǎng)基[9]：蛋白胨 10 g，酵母粉10 g，羧甲基纖維素鈉 10 g， NaCl 5 g， KH2PO41 g，瓊脂 20 g，定容至 1000 mL，pH 7.0。

幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[10]： 膠狀幾丁質(zhì) 15 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， FeSO4·7H2O 0.01 g， K2HPO40.7 g， KH2PO40.3 g，瓊脂 20 g，定容至 1000 mL， pH 7.0。

Msgg培養(yǎng)基： 100 mmol/L 苯磺酸鈉(MOPS)(pH 7.0), 50 μg/mL 絡(luò)氨酸， 50 μg/mL 苯丙氨酸， 2 mmol/L 氯化鎂， 700 μmol/L氯化鈣， 50 μmol/L 三氯化鐵， 50 μmol/L 氯化鋅， 2 μmol/L VB1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌液的制備 將在斜面試管中培養(yǎng) 1 d(28 ℃)的B1619 移至YPG培養(yǎng)液中，置于 28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 生防菌株B1619產(chǎn)酶和次生代謝物的檢測 蛋白質(zhì)酶測定：在蛋白酶檢測平板上放置 6 mm 濾紙片，滴加 5 μl菌液，每個(gè)處理重復(fù) 5 次。 28 ℃恒溫培養(yǎng) 1～2 d觀察，接菌的濾紙片周圍產(chǎn)生透明圈則視為能產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

嗜鐵素測定：在嗜鐵素測定平板上放置 6 mm 濾紙片，滴加 5 μl 菌液，每個(gè)處理重復(fù) 5 次。 28 ℃恒溫培養(yǎng) 3～7 d 后觀察，接菌的濾紙片周圍的培養(yǎng)基是否產(chǎn)生橘黃色暈圈，產(chǎn)生橘黃色暈圈則為可以產(chǎn)生嗜鐵素。

纖維素酶測定：即在維素酶測定平板放置 6 mm濾紙片，滴加 5 μl菌液上，每個(gè)處理重復(fù) 5 次。28 ℃ 培養(yǎng) 3 d后，用 1 g/L 的剛果紅染 1 h后，倒掉染液，用 1 mol/L的 NaCl 浸泡 1 h，觀察有透明圈的則能產(chǎn)生纖維素酶。

幾丁質(zhì)酶檢測：在幾丁質(zhì)酶檢測平板上放置 6 mm濾紙片，滴加 5 μl菌液，每個(gè)處理重復(fù) 5次。 28 ℃恒溫培養(yǎng) 3～7 d 后觀察，接菌濾紙片周圍的培養(yǎng)基是否產(chǎn)生透明圈。

1.2.3 生防菌株B1619 的生物膜觀察 挑取 B1619 的單菌落接種至含有 4 mL LB培養(yǎng)液的試管在 28 ℃培養(yǎng)過夜。吸取 100 μl培養(yǎng)液接種至 12 孔板，每孔加入 4 mL含有 20 μg/mL 的剛果紅的Msgg培養(yǎng)液，28 ℃培養(yǎng) 48 h后觀察生物膜的形成情況；挑取生物膜至 2 mL EP管中放于 37 ℃溫室培養(yǎng)箱中烘干 12 h，稱量生物膜的干重。

1.2.4 碳源、氮源對生防菌株B1619 生長的影響 分別以 10 g/L 的蔗糖、麥芽糖、D-甘露醇、菜籽油、甘油、可溶性淀粉、玉米粉、藕粉、糯米粉替換 NA 培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他成分不變，NA 作為對照，將不同碳源制成的培養(yǎng)基 pH調(diào)至 7.0，取在 28 ℃、 180 r/min 培養(yǎng) 24 h 的生防菌 B1619 菌液 1 mL于裝液量為 100 mL NA培養(yǎng)液的 250 mL三角瓶中，將接種后的三角瓶置于 28 ℃、 180 r/min 振蕩培養(yǎng)，48 h后采用稀釋平板法計(jì)算活菌數(shù)。

A：蛋白酶檢測; B：幾丁質(zhì)酶檢測; C：嗜鐵素檢測;D：纖維素酶檢測.A: Detection of protease; B: Detection of chitinase; C: Detection of siderophore; D: Detection of cellulase圖1 代謝分泌物檢測結(jié)果Fig.1 Analysis of metabolism secretions

分別以 8 g/L 魚粉、黃豆粉、胰蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、蛋白棟、尿素替換 NA 中的牛肉膏和蛋白胨，其他成分不變，以NA培養(yǎng)基為對照，將不同氮源制成的培養(yǎng)基pH調(diào)至 7.0，其他過程同上。

1.2.5 微量元素、無機(jī)鹽對生防菌株B1619生長的影響 在 NA 培養(yǎng)基中添加 0.01 g/L 的 天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、VB1、VB2、VB6、赤霉素和肌醇，以 NA 為對照，將添加不同微量元素制成的培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，其他過程同 1.2.4。

在 NA 培養(yǎng)基中添加 1 g/L 的 NaCl、MnSO4、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、Na2CO3、ZnSO4、FeSO4、KNO3，以 NA 為對照，將添加不同微量元素制成的培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，其他過程同 1.2.4。

1.2.6 溫度、pH對生防菌株B1619 生長的影響 取在 28 ℃、 180 r/min 培養(yǎng) 24 h 的生防菌 B1619 菌液 1 mL于裝有 100 mL NA培養(yǎng)液的 250 mL 三角瓶中，分別置于 20、25、26、27、28、30、33、40 ℃共 8個(gè)溫度梯度下 180 r/min 振蕩培養(yǎng)， 48 h后采用稀釋平板法計(jì)算活菌數(shù)。

NA培養(yǎng)液用 1 mol/L 鹽酸或 1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)到 pH為 4.0、5.0、5.5、6.0、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.5、8.0、9.0 幾個(gè)處理， 每個(gè)處理 4 瓶，由于高溫滅菌后pH變化，取2瓶記錄pH ，另2瓶在 28 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 24 h 的 B1619 菌液 1 mL于裝有 100 mL NA培養(yǎng)液的 250 mL三角瓶中，置于28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)，48 h后用稀釋平板法計(jì)數(shù)。

1.2.7 生防菌株B1619的生長曲線 將在 28 ℃、180 r/min 培養(yǎng) 24 h的生防菌 B1619 液移 1 mL至裝有 100 mL NA培養(yǎng)液的 250 mL三角瓶中，置于 28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別 在 4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h時(shí)用平板稀釋法計(jì)數(shù)， 以不加菌液的培養(yǎng)基為空白對照，同時(shí)在8、16、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76 h 時(shí)觀察產(chǎn)芽孢率。

1.2.8 生防菌株B1619菌體和芽孢形態(tài)的電鏡觀察 取在28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h的生防菌B1619菌液1 mL加入2 mL EP管中，5000 r/min，沉淀2～3 mm，去除上清，沉淀加PBS緩沖液混勻，吹打靜泡10 min，離心重復(fù)4次，去除上清，沉淀與2 %～3 %戊二醛混勻，4 ℃冰箱過夜；48，72 h的處理同上；使用掃描電子顯微鏡ZX-01(EVO-LS10)10 000倍下觀察菌體形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌株B1619產(chǎn)酶和次生代謝物的檢測結(jié)果

按照測定代謝分泌物的方法，對 B1619 的代謝分泌物進(jìn)行了測定(圖1)，圖1-A為透明圈，圖1-D為透明圈，可得知 B1619 分泌蛋白酶纖維素酶和代謝物質(zhì)嗜鐵素，由圖1-C為橘黃色暈圈，可知 B1619 也分泌代謝物質(zhì)嗜鐵素，圖1-B為幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基，可知 B1619 不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

圖2 B1619 的生物膜Fig.2 Pellicle of B1619

2.2 生防菌株B1619 的生物膜觀察

24 h時(shí)，培養(yǎng)液表面形成少量膜狀皺褶；48 h時(shí)，培養(yǎng)液表面形成緊密、堅(jiān)固、厚實(shí)的生物膜，表面有波浪狀凸起；由圖 2 可得知，B1619 的菌株在Msgg培養(yǎng)液液相-空氣交界處形成致密、厚實(shí)的生物膜； 稱量干重得，B1619 的膜干重達(dá)到 10.3 mg。

2.3 碳源、氮源對生防菌株B1619生長的影響

由圖3可獲知，當(dāng)用不同碳源替換NA培養(yǎng)基中的葡萄糖時(shí)，甘露醇、麥芽糖和玉米粉對 B1619 的生長促進(jìn)作用大于葡萄糖，而蔗糖、可溶性淀粉、甘油對B1619的生長促進(jìn)作用小于葡萄糖，菜籽油、藕粉對B1619的生長有抑制作用。其中甘露醇和麥芽糖對B1619的生長促進(jìn)作用相對NA中的葡萄糖分別提高了80.0 %和39.0 %。

由圖4可知，當(dāng)用不同氮源替換NA培養(yǎng)基中的牛肉膏和蛋白胨時(shí)，牛肉膏、胰蛋白胨對B1619的生長促進(jìn)作用大于NA中牛肉膏和蛋白棟混用，有機(jī)氮源蛋白棟、黃豆粉、魚粉和無機(jī)氮源硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、尿素對B1619的生長促進(jìn)作用小于牛肉膏和蛋白棟，總體上，B1619對無機(jī)氮源的利用效率低于有機(jī)氮源，牛肉膏對B1619的生長促進(jìn)作用相對NA中的牛肉膏和蛋白棟提高了32.5 %。

圖3 碳源對B1619生長的影響Fig.3 Effects of carbon sources on the growth of B1619

圖4 氮源對B1619 生長的影響Fig.4 Effects of nitrogen source on the growth of B1619

圖5 微量元素對B1619 生長的影響Fig.5 Effects of trace elements on the growth of B1619

2.4 微量元素、無機(jī)鹽對生防菌株B1619 生長的影響

由圖5可知，在NA中添加微量元素時(shí)，其影響為Ala>VB1>肌醇>NA>赤霉素>VB6>Glu>VB2>Gly>Asp，其中Ala和VB1對 B1619 的生長有顯著的促進(jìn)作用，其菌含量分別比NA培養(yǎng)基提高了 155.5 %和 113.7 %，肌醇、赤霉素和VB6對 B1619 的生長作用不明顯，Glu、Gly、Asp和VB2對 B1619 的生長存在抑制作用。

由圖6可知，在NA培養(yǎng)基中添加無機(jī)鹽時(shí)，其影響為MgSO4>CaCl2>NA>NaCl>Na2CO3>MnSO4>KH2PO4>KNO3>FeSO4=ZnSO4，其中MgSO4和CaCl2對 B1619 的生長有顯著的促進(jìn)作用，其菌含量分別比NA培養(yǎng)基提高了 42.9 %和 37.5 %，MnSO4、KH2PO4、KNO3對 B1619 的生長存在一定的抑制作用，添加FeSO4和ZnSO4的培養(yǎng)基上沒有生長任何菌落，說明Fe2+和Zn2+對 B1619 的生長有毒害作用。

2.5 溫度、pH對生防菌株B1619 生長的影響

由圖7可知，隨著溫度的升高， B1619 的活菌含量呈現(xiàn)一個(gè)先上升后下降的趨勢，在 20～27 ℃，活菌含量呈上升趨勢， 28 ℃之后其活菌含量逐漸下降。 B1619 在 25～27 ℃之間生長良好， 27 ℃下其生長周期較短，故取 27 ℃作為其最適生長溫度。

由圖 8 可得，pH 在 4.5～8.374，生防菌 B1619 均能生長，pH 在 5.6～6.7 ，菌體含量最高，其最適pH為 5.9。

圖6 無機(jī)鹽對B1619 生長的影響Fig.6 Effects of inorganic salts on the growth of B1619

圖7 溫度對B1619 生長的影響Fig.7 Effects of temperature on the on the growth of B1619

圖8 pH 對B1619 生長的影響Fig.8 Effects of pH on the growth of B1619

2.6 生防菌株B1619 的生長曲線

由圖 9 可知，生防菌 B1619 在24 h前處于對數(shù)生長期，生長速度很快； 24 h時(shí)達(dá)到菌體數(shù)量達(dá)到最大值， 24～48 h菌體數(shù)量穩(wěn)定，無明顯變化趨勢；B1619在24 h之前產(chǎn)芽孢率幾乎為零，培養(yǎng)24 h后開始產(chǎn)生芽孢，隨著時(shí)間增加芽孢數(shù)量增加，培養(yǎng)72 h后芽孢數(shù)量達(dá)到最大，約為90 %以上；綜合B1619的生長曲線和芽孢產(chǎn)生曲線，24 h處于B1619對數(shù)生長期末期，此時(shí)產(chǎn)生的芽孢數(shù)量少，從24 h之后芽孢數(shù)量上升，到48 h芽孢率大約達(dá)到50 %。

2.7 生防菌株B1619菌體和芽孢形態(tài)的電鏡觀察

在電鏡下分別觀察24、48、72 h B1619的菌體形態(tài)，可以發(fā)現(xiàn)24 h菌體(圖11-A)端部未產(chǎn)生芽孢，48 h菌體(圖11-B)端部凸起，芽孢產(chǎn)生，72 h(圖11-C)已經(jīng)完全形成芽孢。

圖9 B1619 的生長曲線Fig.9 The growth curve of B1619

圖10 B1619 的產(chǎn)芽孢率Fig.10 The sporulation rate of B1619

3 討 論

解淀粉芽胞桿菌最初是由 Priest等發(fā)現(xiàn)鑒定的，模式菌株為ATCC23350，1980 年之前鮮有研究解淀粉芽胞桿菌的報(bào)道。最初解淀粉芽孢桿菌屬于枯草芽孢桿菌，直到1967年之后才正式從枯草芽孢桿菌中分離出來[11-13]。解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌表型極相似，很容易混淆，并且同源性高，僅從16S rRNA序列同源性上很難將它們區(qū)分開來，所以，長期以來一直將解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌歸屬于同一個(gè)的種，直到1967年Welker等人才將其從枯草芽孢桿菌中分離為獨(dú)立物種[13]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，目前可以通過多種基因(如：gyrA、cheA等)進(jìn)行枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分類研究[14-15]。還有報(bào)道表明，可以利用基因yyaR、yyaO、tetL、tetB排列順序的差異，對這兩個(gè)種的菌株進(jìn)行分類鑒定[15]。目前絕大多數(shù)的生防菌均為解淀粉芽孢桿菌。

A:24 h,B:48 h;C:72 h圖11 B1619 的菌體形態(tài)變化Fig.11 The mycelial morpHology change of B1619

解淀粉芽孢桿菌主要通過營養(yǎng)和空間位點(diǎn)的競爭、分泌抗菌物質(zhì)、溶菌作用和促進(jìn)植物生長等幾個(gè)方面來對植物進(jìn)行保護(hù)[16-18]。蛋白酶、纖維素酶等酶類可以降解真菌發(fā)育需要的物質(zhì)，破壞真菌生長蛋白酶可以通過降解各種蛋白類物質(zhì)破壞真菌生長，幾丁質(zhì)酶可通過降解真菌菌絲生長末端新合成的幾丁質(zhì)而破壞菌絲端部生長，達(dá)到抑制病原真菌生長的目的[19]。纖維素酶中的β-1，3-葡聚糖酶直接攻擊真菌菌絲上的葡聚糖，抑制真菌的生長[19-20]。嗜鐵素通過配基的螯合使環(huán)境中的鐵濃度降低，從而使病原微生物缺鐵而不能生長繁殖，進(jìn)而達(dá)到控制植物病害的目的[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) B1619 分泌產(chǎn)生蛋白酶，纖維素酶和嗜鐵素，不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。B1619的代謝物測定表明，B1619對病原菌具備良好抑制作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，有研發(fā)成生物殺菌劑的潛力。

近年來研究表明，芽孢桿菌可在植物根部群集，形成一層保護(hù)屏障，起到保護(hù)植物免受病原菌侵染、促進(jìn)植物生長的作用。芽孢桿菌的群集運(yùn)動(dòng)在定殖和保護(hù)屏障的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而芽孢桿菌的群集運(yùn)動(dòng)與其生物膜之間有著密切的相關(guān)性[22]。本試驗(yàn)中觀察到 B1619 在Msgg上能夠形成了緊密、厚實(shí)的生物膜，這種生物學(xué)特性有利于B1619群集在植物根圍，有利于其在土壤中定植，發(fā)揮生防效果。

生物殺菌劑中含菌量的高低直接影響生防菌的定殖能力及其生防效果，因此，了解生防菌的生物學(xué)特性，探明生防菌適宜的培養(yǎng)條件，這對于將來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)出含菌量高的生物農(nóng)藥產(chǎn)品具有重要意義。本研究通過單因素試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)不同的碳源，氮源，無機(jī)鹽，微量元素以及溫度和pH對 B1619 的生長均具一定影響。試驗(yàn)表明，B1619 菌株在絕大多數(shù)速效碳源下生長良好，而在幾種緩效碳源中，只有玉米粉中生長正常，藕粉、可溶性淀粉、糯米粉、菜籽油作為碳源時(shí)，該菌株生長量較小。這與章四平[23]等的研究結(jié)果相似。在篩選氮源的過程中，我們發(fā)現(xiàn)該菌對無機(jī)氮源的利用能力低于有機(jī)氮源。無機(jī)鹽試驗(yàn)表明，Ca2+、Mg2+對 B1619 的生長有促進(jìn)作用，而Fe2+、Zn2+對 B1619 的生長有強(qiáng)烈的抑制作用，在今后生防菌B1619推廣應(yīng)用過程中，應(yīng)當(dāng)避免與含有重金屬離子的化肥或農(nóng)藥混用，防止生防效益降低。微量元素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙氨酸、VB1對 B1619 的生長具有明顯的促進(jìn)作用，因此在B1619發(fā)酵過程中可以考慮適當(dāng)加入這兩種物質(zhì)，以達(dá)到提高 B1619發(fā)酵液的含菌量。溫度和pH試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌的最適溫度為 27 ℃，從 30 ℃以后該菌的生長量顯著降低，說明該菌不耐高溫，同時(shí)該菌的最適pH為 5.9 ，說明該菌喜在偏酸的環(huán)境中生長。B1619 的生長曲線表明，生防菌B1619生長繁殖很快，在0～24 h內(nèi)菌量繁殖具有較高的速率，處于對數(shù)生長時(shí)期，24 h后其菌量達(dá)到最大，隨后24～48 h內(nèi)菌量處于平穩(wěn)。

4 結(jié) 論

B1619可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)：蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素，不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶；B1619具有緊密、厚實(shí)的生物膜，有利于其在植物根部的定殖；B1619對速效碳源的利用能力優(yōu)于緩效碳源，對無機(jī)氮源的利用能力優(yōu)于有機(jī)氮源，丙氨酸、VB1、Ca2+、Mg2+促進(jìn)B1619的生長，而Fe2+、Zn2+對 B1619 的生長有強(qiáng)烈的抑制作用，在B1619的發(fā)酵過程中應(yīng)注意此類物質(zhì)的利用；B1619發(fā)酵的最適溫度為27 ℃，最適pH 為5.9，其在0～24 h 具有較高的生長速率，48 h后菌體數(shù)量穩(wěn)定；24 h后開始產(chǎn)生芽孢，到72h時(shí)芽孢數(shù)量達(dá)到最大。本試驗(yàn)通過對解淀粉芽孢桿菌 B1619 的主要生物學(xué)特性進(jìn)行研究，得到了其較為適宜的生長條件，為以后生防菌B1619的產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)和田間應(yīng)用技術(shù)研究提供了科學(xué)依據(jù)。但是，這些適宜B1619生長的環(huán)境條件，對生防菌抗菌物質(zhì)生長代謝的影響；以及多種因素對B1619生長的綜合作用還有待于今后深入研究與分析。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Study on Biological Characteristics of B1619 Preventing Soil-borne Diseases of Facility Vegetable

WANG Lu-yao1,2， GAN Ying1， LIU Yong-feng1， CHEN Zhi-yi1,2*

(1. Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Nanjing 210014, China;2. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Jiangsu Nanjing 210014, China)

【Objective】Strain B1619 can prevent soil-borne diseases of facility vegetables. In this article, we studied its biological characteristics in respects of metabolite species, biofilm morphology, temperature, pH, carbon nitrogen sources, trace elements, inorganic salt and growth curve. 【Method】Dilution-plate method was used to find out the best culture conditions and Msgg medium was used for the observation of its biofilm. 【Result】Results showed there were halos in the protease medium, siderophore medium and cellulase medium, but no the phenomenon in the chitinase medium;B1619 can produce protease, cellulose and iron, B1619it also can form a dense and thick biofilm, at the same time, 27 ℃, pH 5.9, mannitol, beef extract, Ala, CaCl2and MgSO4were optimum for its growth. Logarithmic growth was at the first 24 hours, the cell number reach maximum at 24 h and its growth keep stable after 24 48 hours, it mainly keeps thalli before 24 hours while producing spores after 24 hours, the spore number reach maximum at 72 hours and its sporulation rate was high, even over 90 %. 【Conclusion】B1619 can produce cellulase, siderophore and protease. Inorganic nitrogen , available carbon source and suitable trace elements are beneficial to the growth of B1619, suitable temperature, pH also make difference. The growth of B1619 reach the dynamic balance after 48 hours.In addition, we observe the cell morphology changes of B1619 at 24,48 and 72 h by scanning electron microscopy.

Bio-control bacteria strain;B1619; Biological characteristics

1001-4829(2017)6-1350-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.020

2016-08-11

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技自主創(chuàng)新資金[CX(14)2128]；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[CX(12)1004-6]

王璐瑤(1993-) ，女，山東泰安人，碩士研究生，主要從事植病生防研究，E-mail：578835259@qq.com；*為通訊作者：陳志誼，Tel：025-84390393;E-mail: chzy84390393@163.com。

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