雞蛋溶血巴斯德菌藥敏試驗(yàn)及氨基酸代謝研究

魏 超,周 虹，郭靈安，代曉航，劉 煒

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心, 四川 成都 610066)

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雞蛋溶血巴斯德菌藥敏試驗(yàn)及氨基酸代謝研究

魏 超,周 虹，郭靈安，代曉航，劉 煒

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心, 四川 成都 610066)

【目的】探討雞蛋中溶血性微生物進(jìn)來源及生物安全性?！痉椒ā坎捎锰禺愋耘囵B(yǎng)基在雞蛋中分離一株溶血性微生物，對(duì)其進(jìn)行生化鑒定、16SrDNA進(jìn)行測(cè)序并聚類分析，采用7類9種抗生素抗性試驗(yàn)對(duì)溶血微生物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵底物蛋白質(zhì)和游離氨基酸研究。【結(jié)果】生化鑒定與16rDNA鑒定分離的溶血性微生為溶血巴斯德菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明氨基糖苷類抗生素對(duì)此菌有一定的抑制作用，但青霉素鈉、羅紅霉素和喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星對(duì)此菌無抑制效果，底物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為溶血巴斯德菌的代謝對(duì)蛋白質(zhì)總量影響不大，但可升高發(fā)酵培養(yǎng)基中部分游離氨基酸的含量?！窘Y(jié)論】雞蛋中存在非常見致病微生物的污染，并且部分抗生素對(duì)致病微生物已無抑制作用，雞蛋中的微生物可以改變底物結(jié)構(gòu)，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)新鮮雞蛋微生物污染的控制，關(guān)注罕見致病菌及條件致病菌引起的危害。

溶血巴斯德菌；16SrDNA；藥敏試驗(yàn)；氨基酸及蛋白質(zhì)代謝

【研究意義】在雞蛋存偶爾會(huì)爆發(fā)多種致病微生物的感染，為其食用安全埋下隱患，本實(shí)驗(yàn)在雞蛋中發(fā)現(xiàn)溶血性微生物，對(duì)其進(jìn)行鑒定、耐藥試驗(yàn)和代謝分析旨在對(duì)其安全食用及衛(wèi)生防控提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】溶血巴斯德桿菌(Pasteurellahaemolytica)屬于巴斯德菌屬(Pasteurella) ，是一種革蘭氏陰性，無動(dòng)力，無芽孢的短桿或球桿菌，是存在于牛、綿羊、山羊等反芻動(dòng)物以及其他多種動(dòng)物上呼吸道的常在菌和機(jī)會(huì)致病菌[1-2]。由巴斯德氏菌屬引起的感染性疾病中，以出血敗血性巴斯德氏菌所致者較多見，溶血性巴斯德氏菌和其他巴斯德氏菌很少引起人類疾病，但溶血性巴斯德氏菌感染人體后癥狀大多表現(xiàn)較重[3-5]。我國(guó)已報(bào)道多例雞、鴨、鵝等家禽感染此菌患病的案例[6-8]，但在蛋中檢測(cè)出溶血巴斯德桿菌還未有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)在雞蛋中分離一株溶血巴斯德桿菌，經(jīng)生化鑒定為溶血曼海姆菌或溶血巴斯德菌，對(duì)此株微生物進(jìn)行16SrDNA進(jìn)行測(cè)序并聚類分析，此菌與巴斯德菌同源性為100 %與曼海姆菌同源性為94 %，因而判定為溶血巴斯德菌，對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和氨基酸變化分析，為研究微生物的耐藥性和生物代謝提供理論依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對(duì)雞蛋中溶血性微生物的研究旨在研究微生物對(duì)雞蛋食用安全及后游產(chǎn)業(yè)的影響，其結(jié)果將為該類條件致病菌的研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 雞蛋(成都市某超市)。

1.1.2 儀器與試劑 微生物生化鑒定：法國(guó)生物梅里埃公ATB細(xì)菌鑒定儀，試劑條ID 32 E，微生物培養(yǎng)純化所用培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱。

抗生素藥敏片：氯霉素，復(fù)方新諾明，羅紅霉素，鏈霉素，環(huán)丙沙星，慶大霉素，卡那霉素青霉素，土霉素，氯霉素，復(fù)方新諾明，慶大霉素，卡那霉素(Oxoid公司，Ф6mm)

蛋白質(zhì)測(cè)定采用kjetltec 2400全自動(dòng)凱氏定氮儀。氨基酸測(cè)定采用S433D氨基酸分析儀德國(guó)sykam(賽卡姆)。

分子生物學(xué)鑒定試劑 MasterMix 購(gòu)于成都博瑞克生物技術(shù)有限公司; 引物為微生物16SrDNA通用引物27f，1492r 由上海英駿生物技術(shù)公司合成，測(cè)序?yàn)樯虾Ａ⒎粕锛夹g(shù)有限公司。

1.2 分離鑒定

雞蛋樣品均質(zhì)后，取25 g于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL緩沖蛋白質(zhì)水，拍擊30 min ，36 ℃培養(yǎng)18 h，增菌液劃線血平板36 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基觀察菌落特征。

對(duì)典型溶血微生物血平板進(jìn)行純化擴(kuò)菌，挑取血平板上純化菌落至比濁管，振蕩分散，調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，裝填I(lǐng)D 32 E試劑條，由ATB系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析并給出最終結(jié)果。

1.3 微生物的分子鑒定

采用25 μl反應(yīng)體系, 反應(yīng)體系為MasterMix 12.5 μl; 27f和1492r 引物各1 μl、模板DNA 1 μl、加ddH2O 至25 μl。反應(yīng)條件為: 預(yù)變性95 ℃ 5 m in；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。電泳結(jié)果進(jìn)行分析，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN,MEGA6.0軟件進(jìn)行處理分析。

1.4 抗生素抗性試驗(yàn)

純菌菌落在生理鹽水中制成0.5個(gè)麥?zhǔn)匣鞈乙?，? mL于空白培養(yǎng)皿中，傾注15 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行混菌，待培養(yǎng)基凝固后用藥敏紙貼于培養(yǎng)基表面，(36±1) ℃倒置培養(yǎng)24～48 h。

1.5 發(fā)酵液蛋白質(zhì)及氨基酸含量的測(cè)定

純菌菌落在生理鹽水中制成0.5個(gè)麥?zhǔn)匣鞈乙?，分別取1 mL接種于培養(yǎng)基BHI和5 %雞蛋液的BHI培養(yǎng)基，36 ℃漩渦震蕩培養(yǎng)24 h。

稱取2.5 g發(fā)酵液于凱氏定氮儀測(cè)定含氮量，用公式蛋白質(zhì)含量(g)=氮(g)×6.25計(jì)算發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的百分含量。

稱取發(fā)酵液1.0 g于磺基水楊酸沉淀蛋白質(zhì)，發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，水浴鍋上揮發(fā)為干物質(zhì)，采用0.02 mol/mL鹽酸水溶液1 mL進(jìn)行復(fù)溶解后進(jìn)樣測(cè)定游離氨基酸含量，未接種培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及生化鑒定

此株細(xì)菌在血平板上培養(yǎng)24 h后菌落特征為菌落淺灰色、光滑濕潤(rùn)，有明顯β溶血圈，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性；革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G-球桿菌。ATB生化鑒定分析結(jié)果見表1，其ID %為95.3，T值(表示其生化反應(yīng)結(jié)果與該菌最典型生化譜的接近程度，ID值為待檢菌在整個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)屬于哪個(gè)分類單位)為0.58，判定為溶血滿海姆菌或溶血巴斯德菌，評(píng)語(yǔ)為好的鑒定。

2.2 分子鑒定

由于微生物生化全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)給此株微生物雙結(jié)果鑒定，所以利用微生物16SrDNA鑒定方法對(duì)此株微生物進(jìn)行輔助鑒定，采用通用引物27f(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492r(5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3)對(duì)其16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果編號(hào)為W2014-7-1285，在GENEBANK上下載編號(hào)分別為：AY O78998.1、AY 362926.1、AY 507116.1、JF 706218.1、NR 024897.1、NR 024899.1、NR 1144448.1 3組曼海姆菌(Mannheimia)和4組巴斯德菌(Pasteurella)典型序列與其進(jìn)行同源性聚類分析，分析圖譜見圖1，由圖1可以看出，分離微生物與巴斯德菌株同源性98 %～100 %，與曼海姆菌的同源性94 %～97 %，且巴斯德菌同屬不同種之間同源性較高，可以判定此株微生物為溶血性巴斯德菌。

表1 溶血巴斯德菌生化鑒定

注：“-”表示陰性，“+”表示陽(yáng)性。

Note：‘-’means negative, ‘+’ means positive.

圖1 溶血巴斯德菌同源樹Fig.1 Homology tree of Pasteurella haemolytica

2.2 藥敏試驗(yàn)

采用9種人用或獸用常見抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中氨基糖甙類抗生素采用卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素；β-內(nèi)酰胺類抗生素采用青霉素鈉；大環(huán)內(nèi)酯類抗生素采用羅紅霉素；磺胺類抗生素采用復(fù)方新諾明；四環(huán)素類抗生素采用土霉素；氯霉素類抗生素采用氯霉素，喹諾酮類抗生素采用環(huán)丙沙星。按照藥敏試驗(yàn)抗性標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑(毫米)判定敏感度：0為不敏，10以下為低敏，10～14為中敏，15～20為高敏，20以上為極敏(表2)。β內(nèi)酰胺類抗生素青霉素鈉、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素羅紅霉素、喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星對(duì)溶血巴斯德菌均無抑制作用，微生物對(duì)幾種氨基糖甙類抗生素極敏，對(duì)復(fù)方新諾明和氯霉素也表現(xiàn)極敏。

2.3 溶血巴斯德菌發(fā)酵液蛋白質(zhì)及氨基酸代謝

蛋白質(zhì)測(cè)定總含量(表3)略有降低但減低幅度不大，即微生物的發(fā)酵不會(huì)影響整體底物蛋白質(zhì)的總含量。在蛋白質(zhì)總含量差異不大的條件下進(jìn)行游離氨基酸測(cè)定，添加蛋液和非添加蛋液的兩種發(fā)酵培養(yǎng)條件下游離氨基酸的含量普遍略有升高(圖2，表4)，但其中精氨酸(ARG)和絲氨酸(SER)含量有所降低，對(duì)γ-氨基丁酸(γ-Aba)測(cè)定也出現(xiàn)發(fā)酵液中的含量降低，表明微生物發(fā)育過程中會(huì)利用培養(yǎng)基中的這3種氨基酸。溶血巴斯德菌會(huì)微量改變底物的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用部分必須氨基供自身生長(zhǎng)繁殖同時(shí)也釋放或改變一些氨基酸組份。

表2 溶血巴斯德菌藥敏試驗(yàn)

表3 溶血巴斯德菌發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量

3 討 論

3.1 溶血巴斯德菌的鑒定

本實(shí)驗(yàn)生化檢測(cè)采用的是梅里埃的全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，試劑條為ID 32E ,雖然進(jìn)行了32個(gè)生化反應(yīng)，且鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)為好，但還是出現(xiàn)雙結(jié)果鑒定，由于溶血性曼氏桿菌和性巴氏桿菌在形態(tài)大小、染色特性等方面較相似，從而為這兩種細(xì)菌的準(zhǔn)確鑒定造成不便。溶血巴斯德菌和溶血曼海姆菌都是牛羊等反芻動(dòng)物致病菌之一，并且兩種菌經(jīng)常同時(shí)侵染個(gè)體，兩者同時(shí)檢出并難以區(qū)別。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雞蛋中分離微生物進(jìn)行16SrDNA測(cè)序，并與GENEBANK下載巴斯德菌和曼海姆菌進(jìn)行同源分析，不同種巴斯德菌16SrDNA相對(duì)保守且與曼海姆菌16SrDNA有一定差異，可見分子生物學(xué)方法可以將2種不同屬微生物分開，建立一種可以同時(shí)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定溶血性曼氏桿菌和溶血巴氏桿菌的方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 溶血巴斯德菌的致病性

從雞蛋中分離的溶血性巴斯德菌在血平板上有較明顯的β溶血現(xiàn)象，溶血性多為病原微生物所產(chǎn)生的毒素類物質(zhì)而導(dǎo)致機(jī)體紅細(xì)胞及其他有核細(xì)胞裂解。巴斯德氏菌屬引起感染性疾病中，以出血敗血性巴斯德氏菌所致者較多見，溶血性巴斯德氏菌很少引起人類疾病，但溶血性巴斯德氏菌感染后癥狀大多表現(xiàn)較重。溶血巴斯德桿菌主要有4種毒力因子:菌毛、多糖莢膜、內(nèi)毒素(LPS)及白細(xì)胞毒素(LKT)，致毒因子的含量與比例也與培養(yǎng)基底物氨基酸含量有一定關(guān)系。藥敏試驗(yàn)表明，此株溶血巴斯德菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生抗性，這與日?？股仡愃幬餅E用不無關(guān)系。

圖2 氨基酸分析圖譜Fig.2 AA analysis graph

氨基酸種類BHI培養(yǎng)基5%蛋液+BHI培養(yǎng)基游離氨基酸(mg/100g)游離氨基酸空白對(duì)照(mg/100g)游離氨基酸(mg/100g)游離氨基酸空白對(duì)照(mg/100g)ASP0.4080.3710.3400.333THR0.3000.2840.0610.304SER0.1230.3610.1040.106GLU0.7530.7040.7340.636GLY0.3540.3160.3450.309ALA0.5810.5600.7000.557CYS0.1770.1700.6290.141VAL0.3680.3630.4210.392MET0.3290.3050.3240.290ILE0.3040.2910.3250.317LEU0.9541.0020.8560.967TYR0.3200.3180.3300.299PHE0.4850.0220.5010.431HIS0.5370.5050.5790.616LYS0.7110.7300.7370.676ARG0.9681.0270.2700.861PRO0.00270.00240.1040.093合計(jì)7.6747.3317.3607.328γ-Aba0.0270.0210.0300.020

4 結(jié) 論

雞蛋中分離的溶血巴斯德菌有溶血性，且對(duì)多種抗生素耐藥，且可改變底物氨基酸組成結(jié)構(gòu)對(duì)雞蛋的營(yíng)養(yǎng)成分和生物安全埋下隱患。我國(guó)已報(bào)道多例雞、鴨、鵝等家禽感染此菌患病的案例，在雞蛋中還是首次檢出，在雞蛋的日常食用過程中，多以煎煮等加工熟食為主，但某些家庭喜好未完全煮熟的“糖心蛋”，這些為雞蛋的食用安全埋下隱患。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)新鮮雞蛋微生物污染的控制，嚴(yán)格動(dòng)物的飼養(yǎng)管理，除了檢測(cè)常規(guī)致病性微生物外，也應(yīng)該多關(guān)注罕見致病菌及條件致病菌，為研究、發(fā)現(xiàn)及控制做好數(shù)據(jù)儲(chǔ)備工作。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Study on Susceptibility Testing and Amino Acid Metabolism ofPasteurellahaemolyticain Eg

WEI Chao, ZHOU Hong, GUO Ling-an, DAI Xiao-hang, LIU Wei

(Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066,Chian)

【Objective】The study aims to explore the origin and biosafety of hemolytic microorganisms in eggs. 【Method】Isolated from the eggs by specific culture medium, a hemolytic microorganism was biochemically identified, and 16SrDNA sequencing and cluster analysis was also conducted on it. Resistance tests of seven kinds of and nine species of antibiotics were used to carry out the susceptibility testing of the hemolytic microorganism, and the proteins and free amino acids in the fermentation substrate were studied. 【Result】The isolated hemolytic microorganism was identified as Mannheimia haemolytica or Pasteurella haemolytica by biochemical identification and 16SrDNA identification. The results of susceptibility testing showed that except aminoglycosides, penicillin of β-lactams antibiotics, roxithromycin of macrolides antibiotics and Ciprofloxacin of 4-quinolones antibiotics had no inhibitory effect on the microorganism. The experimental results of fermentation substrate show that metabolism of hemolytic Pasteurella haemolytica has little effect on the total protein amount, however, it can increase the content of some free amino acids. 【Conclusion】There are non-common pathogenic microorganisms in the eggs, on which some antibiotics have no inhibitory effect and the microorganisms can change the structure of the substrate. Therefore, the relevant departments should strengthen the control of microbial contamination of fresh eggs and pay close attention to the hazards caused by non-common pathogenic microorganisms and conditional pathogenic microorganisms.

Pasteurellahaemolytica；16SrDNA；Susceptibility test; AA and protein metabolism

1001-4829(2017)6-1335-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.017

2016-06-13

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)(GJFP201 601302)

魏 超(1985-)，女，助理研究員，碩士研究生，主要從事食品農(nóng)產(chǎn)品微生物檢測(cè)及相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，E-mail：cc123qqq@163.com。

S858.31

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