四川省3個(gè)不同栽培地油橄欖品種皮瓜爾的含油率與遺傳差異分析

趙 琦，郭曉強(qiáng)，莊國慶，顏 軍，何世勤，李 銳*

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；3.四川省天源油橄欖有限公司，四川 達(dá)州 636251)

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四川省3個(gè)不同栽培地油橄欖品種皮瓜爾的含油率與遺傳差異分析

趙 琦1，郭曉強(qiáng)1，莊國慶2，顏 軍1，何世勤3，李 銳1*

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；3.四川省天源油橄欖有限公司，四川 達(dá)州 636251)

【目的】油橄欖是重要的油果兼用經(jīng)濟(jì)林木，含油率的高低直接影響到油橄欖品種經(jīng)濟(jì)價(jià)值。影響含油率因素包括所處生態(tài)環(huán)境和遺傳潛力?！痉椒ā勘疚囊砸N到四川省3個(gè)不同生態(tài)區(qū)(達(dá)州、金堂和西昌)的油橄欖品種皮瓜爾作為研究對象，首先分析了皮瓜爾原產(chǎn)地(西班牙地區(qū))和引種栽培地(達(dá)州、金堂和西昌)的氣候特點(diǎn)，結(jié)合含油率的測定結(jié)果(西昌皮瓜爾含油率最高)，推測日照時(shí)數(shù)是影響含油率的關(guān)鍵生態(tài)因子。隨后對克隆到的功能基因編碼序列DNA片段進(jìn)行SNP分析，發(fā)掘其中的單核苷酸變異位點(diǎn)和其編碼的氨基酸變異位點(diǎn)?！窘Y(jié)果】在花青素合酶(Anthocyanidin synthase，ANT)、鈣調(diào)蛋白(Calcium binding protein，CBP)和查爾酮合酶(Chalcone synthase，CHS)3個(gè)基因片段中檢測到了SNP，共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)CAPS位點(diǎn)，得到的2種SNP組合(SNP1-HphI/SNP2-EagI和SNP2-EagI/SNP3-BsgI)可以完成對皮瓜爾品種區(qū)域性的鑒別。【結(jié)論】本研究獲得的3個(gè)CAPS分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了對不同區(qū)域油橄欖品種皮瓜爾快速、準(zhǔn)確的鑒定，今后將加大對該基因功能差異的研究，以期為油橄欖育種研究奠定基礎(chǔ)。

油橄欖；含油率；單核苷酸多肽(SNP)；遺傳差異

【研究意義】油橄欖(OleaeuropaeaL.)為木犀科(Oleaceae)木犀欖屬(Olea)的常綠喬木，是世界四大木本油果兼用(油橄欖、油棕、油茶、椰子)樹種之一，該植物原產(chǎn)地主要分布于地中海沿岸國家，中國是其在東亞的主要引種栽培區(qū)，四川省是引種油橄欖最早的省份之一[1]。油橄欖果實(shí)中所含的橄欖油是世界上唯一可通過鮮果冷榨即可食用的植物油，具有預(yù)防心腦血管、癌癥等惡性腫瘤的功效，享有“植物油皇后”、“液體黃金”等美稱[2]。油橄欖最大的用途是制油，因此如何提高其含油率就成了研究重點(diǎn)，韓華柏等[3]利用逐步回歸分析的方法研究了影響油橄欖含油率的關(guān)鍵因子，結(jié)果表明，光、溫、水等指標(biāo)綜合影響油橄欖的產(chǎn)量和品質(zhì)。郭翔等基于GIS的生態(tài)評價(jià)系統(tǒng)則進(jìn)一步分析了四川油橄欖引種栽培的環(huán)境條件，指出油橄欖的含油量、產(chǎn)量和品質(zhì)與其所處的生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，當(dāng)前分布區(qū)的生境條件與引種區(qū)的生境條件越相似，越有利于油橄欖的生長發(fā)育[4]。另有研究則指出，對于生長在不同生境條件下的油橄欖，由于生境異質(zhì)性往往會通過歧化選擇或本地適應(yīng)來導(dǎo)致適應(yīng)性遺傳多樣性的發(fā)生[5]。從以上油橄欖含油率、產(chǎn)量與環(huán)境因子之間的關(guān)系研究可以看出，油橄欖所處的生態(tài)環(huán)境是一個(gè)重要的影響因素。【前人研究進(jìn)展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于分子標(biāo)記方法不受外界環(huán)境因素影響的優(yōu)點(diǎn)，越來越多的分子標(biāo)記(如RAPD[6]、SSR[7]、ISSR[8]、SRAP[9]等)被應(yīng)用于油橄欖的遺傳多樣性分析，人們可以直接從基因水平研究油橄欖的遺傳差異，進(jìn)而指導(dǎo)油橄欖的篩選與利用，獲得高含油率、高品質(zhì)的油橄欖資源。近年來，基于SNP標(biāo)記技術(shù)的PCR-RFLP方法(CAPS)被國外學(xué)者開發(fā)應(yīng)用于油橄欖品種鑒定和適應(yīng)性遺傳多樣性分析[10-11]。該方法通過簡單的實(shí)驗(yàn)手段(克隆、測序和序列比對)檢測堿基的序列差異，只需酶切具有突變的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)序列即可直接通過瓊脂糖凝膠電泳觀測SNP 基因分型結(jié)果，方法簡便易行。Ali[11]和Clarissa[10]等人分別利用CAPS技術(shù)對油橄欖品種做了遺傳多樣性分析和分類鑒別工作，而運(yùn)用該技術(shù)對油橄欖進(jìn)行適應(yīng)性遺傳多樣性的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】因此，本研究針對四川省3份具有不同氣候特征的引種栽培地油橄欖品種皮瓜爾進(jìn)行含油率測試分析比較，參考Ali[11]和Clarissa[10]等人報(bào)導(dǎo)的存在酶切位點(diǎn)的候選SNP位點(diǎn)序列，對這些序列進(jìn)行克隆測序和序列比對，檢測四川省不同引種栽培地皮瓜爾品種間的堿基序列差異，探討同一品種引種到不同生態(tài)環(huán)境栽培地的適應(yīng)性遺傳多樣性，以及將這些基因作為分子標(biāo)記應(yīng)用于不同引種栽培地皮瓜爾品種遺傳差異檢測的可能性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究為今后油橄欖品種的栽培與利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

在四川省收集3個(gè)具有典型氣候特征的引種栽培地油橄欖品種皮瓜爾(原產(chǎn)于西班牙)作為供試材料。材料收集地、氣候特征見表1。具體材料采集信息：西昌樣品收集于涼山州西昌市西溪鄉(xiāng)北河水庫油橄欖生態(tài)示范園，達(dá)州樣品收集于開江縣紅花山川東北油橄欖品種園，金堂樣品收集于成都市金堂縣淮口鎮(zhèn)油橄欖產(chǎn)業(yè)示范園。供試地區(qū)氣候特征通過搜集文獻(xiàn)總結(jié)得出[12-15]。以嫩葉為提取基因組DNA的材料。采集嫩葉后放入裝有硅膠的自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室置冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株與試劑

大腸桿菌菌株Top10由本實(shí)驗(yàn)室保存，primerstar高保真酶，pMD19-T 載體購自TaKaRa 公司，植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305-02)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP214-03)購自天根生化(北京)科技有限公司，PCR 引物合成和基因測序由北京擎科梓熙基因有限公司完成。其它化學(xué)藥品為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干果含油率的測定 采用索氏提取法測定干果含油率。方法：將鮮果烘干至恒重，打成細(xì)粉，用濾紙包裹好，每份5 g，記為M，一式三份；準(zhǔn)備干凈的圓底燒瓶(150 mL)，稱重，記錄圓底燒瓶的重量，記為M1(g)；將樣品置于索氏抽提儀中，用正己烷回流提取 8 h，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將正己烷蒸干，記錄含油圓底燒瓶的重量，記為M2(g)；按如下公式計(jì)算出干果含油率：含油率=(M2-M1)/M×100 %。

1.3.2 DNA的提取 每個(gè)栽培地油橄欖品種皮瓜爾取5個(gè)單株新鮮葉片組成混合樣品池，采用天根公司植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.3.3 所選基因片段的克隆 采用Ali[11]和Clarissa[10]所提出的基因序列及引物，在此基礎(chǔ)上篩選與油橄欖產(chǎn)量或含油率相關(guān)的6個(gè)基因作為研究對象(表2)。PCR反應(yīng)體系和條件見文獻(xiàn)[10-11]。所得產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞。菌落經(jīng)PCR驗(yàn)證后，挑取陽性菌落送往北京擎科梓熙基因有限公司測序。利用NCBI Blast軟件包對所得序列進(jìn)行比對分析，確認(rèn)序列的可靠性。

1.3.4 SNP位點(diǎn)檢測分析 利用DNAMAN軟件對已確認(rèn)可靠的基因序列進(jìn)行多重比對分析，從PCR擴(kuò)增的DNA片斷中找到單堿基突變位點(diǎn)，確定SNP。通過NEBCutter V2.0 軟件(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)預(yù)測SNP位點(diǎn)所在的區(qū)域是否存在限制性酶切位點(diǎn)。隨后對存在酶切位點(diǎn)的候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP 檢測。應(yīng)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對目標(biāo)引物的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系及條件見參考文獻(xiàn)[10-11]。

表1 油橄欖干果含油率與栽培地氣候特征

2 結(jié)果與分析

2.1 各引種栽培地皮瓜爾含油率評價(jià)

從表1可以看出，不同栽培區(qū)生態(tài)環(huán)境對油橄欖含油率影響不同，涼山州西昌地區(qū)擁有最充足的光熱資源，氣溫、降水、空氣濕度和日照等指標(biāo)與其原產(chǎn)地西班牙地區(qū)接近，含油率最高，達(dá)州和金堂含油率低于西昌，屬于四川省山地低海拔地區(qū)，多數(shù)因子符合油橄欖的生長條件，僅有少數(shù)因子欠佳，比如日照時(shí)數(shù)只有原產(chǎn)地的一半左右。有研究表明，油料植物對光與輻射能的需要量較其它植物更大，日照強(qiáng)度與時(shí)長會通過影響植物光合作用和果實(shí)發(fā)育的同化代謝過程，進(jìn)而影響植物的產(chǎn)量、含油率和油脂成份[17]。因此日照時(shí)數(shù)的差異也許正是3個(gè)地區(qū)皮瓜爾含油率存在差異的原因之一。此外，周立江的分析指出，含油率和產(chǎn)量并不單受某一因子的影響，除了日照時(shí)數(shù)外，可能還受林地坡向、土壤、花與果實(shí)發(fā)育的氣候條件影響[5]。由此可見，引種栽培區(qū)與原產(chǎn)區(qū)的環(huán)境異質(zhì)性會導(dǎo)致植物的產(chǎn)量和品質(zhì)存在差異。

2.2 相關(guān)基因片段SNP分析

通過對皮瓜爾3個(gè)栽培地所選基因的PCR擴(kuò)增、克隆、測序，分別得到ANT基因279 bp、CBP基因333 bp、CHS基因300 bp、FAD2.1基因151 bp、LUP基因113 bp、ACP基因191 bp的編碼區(qū)域DNA序列。運(yùn)用NCBI、DNAMAN和NEBCutter V2.0軟件對所克隆的序列進(jìn)行SNP分析(表2～4)，結(jié)果顯示：在相應(yīng)長度核酸序列內(nèi)ACP、FAD2.1和LUP基因在本研究3個(gè)栽培地不存在多態(tài)性；克隆長度為279 bp的ANT基因序列中有7個(gè)單核苷酸位點(diǎn)發(fā)生變異，導(dǎo)致了4個(gè)氨基酸位點(diǎn)產(chǎn)生突變，3個(gè)為同義突變，4個(gè)為有意義突變，多態(tài)性頻率為1SNP/39.9 bp，其中達(dá)州ANT基因第181個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸變異引起了1個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HphI的改變；達(dá)州、西昌的CBP基因序列顯示出該基因片段含有一個(gè)EagI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，而金堂的該序列卻因G-C的轉(zhuǎn)換而失去這一酶切位點(diǎn)；類似的特點(diǎn)也存在于達(dá)州的CHS序列中，達(dá)州的CHS基因序列顯示出該基因片段含有一個(gè)BsgI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，而金堂、西昌的該序列卻因T-C的轉(zhuǎn)換而失去這一酶切位點(diǎn)。

表2 SNP-CAPS標(biāo)記引物信息

表3 基因片段單核苷酸變異位點(diǎn)

注：*代表CAPS位點(diǎn)。下同。

Note：*represents CAPS sites.The same as below.

表4 基因片段氨基酸變異位點(diǎn)

選擇其中存在有合適內(nèi)切酶的突變點(diǎn)，分別采用內(nèi)切酶HphI、EagI 、BsgI及引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物的酶切檢測。電泳檢測及測序結(jié)果如圖1。對3個(gè)區(qū)域3個(gè)基因CAPS 標(biāo)記分析可以看出，依次采用ANT基因的SNP1-HphI標(biāo)記可以將達(dá)州與金堂、西昌的皮瓜爾明顯分開，CBP基因的SNP2-EagI標(biāo)記將金堂與西昌的皮瓜爾區(qū)分開來；類似的首先采用CBP基因的SNP2-EagI標(biāo)記可以將金堂與達(dá)州、西昌的皮瓜爾明顯分開，隨后采用CHS基因的SNP3-BsgI標(biāo)記可將達(dá)州與西昌的皮瓜爾區(qū)分開來。因此，本研究得到2種SNP組合(SNP1-HphI/SNP2-EagI和SNP2-EagI/SNP3-BsgI)，可以完成對皮瓜爾品種區(qū)域多態(tài)性的鑒別，表明本研究中所用 SNP 位點(diǎn)具有良好的區(qū)域區(qū)分能力。

M:DNA Marker DL5000；1:達(dá)州；2：金堂；3：西昌圖1 CAPS電泳(A)及測序結(jié)果(B)Fig.1 CAPS electrophoresis(A) and sequencing results of ANT, CBP and CHS(B)

3 討 論

含油率是油橄欖育種考慮的首要性狀，分析影響含油率高低的因素意義重大。本研究表明，西班牙油橄欖品種皮瓜爾引種到四川省達(dá)州、金堂、西昌3個(gè)地區(qū)栽培后，表現(xiàn)出不同的含油率，尤以西昌地區(qū)含油率最高，該地區(qū)生態(tài)環(huán)境因子與原產(chǎn)地極為相似，從日照時(shí)數(shù)指標(biāo)看遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于達(dá)州和金堂，說明日照時(shí)數(shù)是影響油橄欖含油率的一個(gè)關(guān)鍵生態(tài)因子，這與姚麗華[17]的報(bào)道是一致的。

影響油橄欖產(chǎn)量與含油率的因素較為復(fù)雜，尤其在長期的引種馴化過程中，一些性狀難免會因環(huán)境或栽培條件的影響發(fā)生變異，導(dǎo)致其在遺傳多樣性上產(chǎn)生差異，而這些差異往往很難從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行鑒別，因此本研究基于特定的基因序列，利用CAPS技術(shù)對引種到四川省達(dá)州、金堂、西昌3個(gè)地區(qū)栽培地的皮瓜爾進(jìn)行適應(yīng)性遺傳多樣性研究，分析各栽培地皮瓜爾資源的多態(tài)性。與先前Ali對土耳其油橄欖的分析結(jié)果相比，本次供試材料的遺傳多樣性差異要相對低一些，說明3地的油橄欖品種皮瓜爾資源存在遺傳相似性較高、遺傳基礎(chǔ)較窄的情況，盡管如此本研究運(yùn)用SNP與限制性內(nèi)切酶相結(jié)合的策略，仍選擇出了3個(gè)SNP標(biāo)記(2種SNP組合)得以對皮瓜爾品種的區(qū)域多態(tài)性加以鑒別。此外，本研究所選擇的基因主要參與了油橄欖的逆境脅迫、果實(shí)發(fā)育等過程[18-19]，篩選獲得的SNP處于基因的編碼區(qū)，可能會在分子功能和生物過程方面發(fā)揮重要的作用，后期將對這些基因更多的SNP進(jìn)一步檢測，并且和含油量、產(chǎn)量等性狀聯(lián)系起來分析，找到影響這些指標(biāo)的SNP，為油橄欖的分子育種提供SNP分子標(biāo)記，以期在種質(zhì)資源保護(hù)、品種鑒別、適應(yīng)性遺傳多樣性研究以及生態(tài)演化等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

[1]鄧 煜. 從油橄欖引種看我國木本食用油料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2010，15：119-124.

[2]石永峰. 中國橄欖油市場發(fā)展現(xiàn)狀及建議[J]. 中國油脂, 2007(1)：86-87.

[3]韓華柏，何 方. 影響油橄欖產(chǎn)量與品質(zhì)的氣象因子分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008(15)： 6-10.

[4]郭 祥，范建容，朱萬澤，等. 基于GIS的四川省油橄欖生態(tài)適宜性模糊綜合評價(jià)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2010(3)：586-591.

[5]周立江. 四川油橄欖引種栽培的環(huán)境分析與評價(jià)[J]. 四川林勘設(shè)計(jì)，2005，14：1-8.

[6]馬萬里，G.Collins. 運(yùn)用RAPD技術(shù)鑒定澳大利亞油橄欖品種的研究[J]. 內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)漢文版)，2006，343：337-339.

[7]李金花，俞 寧. 利用熒光SSR標(biāo)記分析中國油橄欖品種遺傳多樣性[J]. 林業(yè)科學(xué)，2012(6)：47-55.

[8]陳海云，寧德魯，李勇杰，等. 59個(gè)油橄欖種質(zhì)的ISSR分子鑒定[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013(2)：13-17.

[9]占明明，楊 毅，程子彰，等. 基于SRAP標(biāo)記的油橄欖品種遺傳多樣性分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2015(3)： 157-164.

[10]Consolandi C, Palmieri L, Severgnini M, et al. A procedure for olive oil traceability and authenticity: DNA extraction, multiplex PCR and LDR-universal array analysis[J]. European Food Research and Technology, 2008, 227: 1429-1438.

[11]Uncu A, Frary A, Doganlar S. Cultivar origin and admixture detection in Turkish olive oils by SNP-based CAPS assays[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63: 2284-2295.

[12]湯曉文，歐國平，董 妍，等. 西班牙、希臘油橄欖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的經(jīng)驗(yàn)與啟示[J]. 林業(yè)經(jīng)濟(jì)，2012(1)：116-122.

[13]朱萬澤，范建容，彭建國，等. 四川省油橄欖引種品種果實(shí)含油率及其脂肪酸分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2010，23：91-100.

[14]張達(dá)江，陳 兵，葉小軍，等. 龍泉山脈低山丘陵區(qū)—金堂縣油橄欖引種栽植試驗(yàn)初報(bào)[J]. 四川林業(yè)科技，2013，76：84-88.

[15]申旭紅，朱萬澤. 四川省油橄欖引種地氣候因子分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，1004：995-997.

[16]Rosa R D L，Talhaoui N，Rouis H, et al. Fruit characteristics and fatty acid composition in advanced olive breeding selections along the ipening period[J]. Food Research International, 2013, 54(2): 1890-1896.

[17]姚麗華. 從氣候資源分析城固縣引種油橄欖的有利和不利條件[J]. 北京林學(xué)院學(xué)報(bào)，1981(8)：1-8.

[18]夫 云，王慶美，李愛賢，等. 植物花青素合成酶的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，14：188-190.

[19]陳文拴，黃乾明，陳華萍，等. 油橄欖查爾酮合酶與查爾酮異構(gòu)酶基因全長的克隆及序列分析[J]. 食品科學(xué)，2015，23：117-124.

(責(zé)任編輯 陳 虹)

Analysis of Oil Content and Genetic Diversity for Introduced Picual Cultivars in Sichuan Province

ZHAO Qi1, GUO Xiao-qiang1, ZHUANG Guo-qing1, YAN Jun1, HE Shi-qin3, LI Rui1*

(1.College of Pharmaceutical and Biological Engineering,Chengdu University,Sichuan Chengdu 610106,China;2.Sichuan Academy of Forestry,Sichuan Chengdu 610081,China;3.Sichuan Tianyuan Olive Co.,Ltd.,Sichuan Dazhou 636251,China)

【Objective】Olive(OleaeuropaeaL.) which can be used for oil and food is a kind of important economic forest tree. Oil content is an important factor affecting the economic value of olive. Factors that affected oil content include ecological environment and genetic potential.【Method】 In this paper, theOleaeuropaeaL.varieties ( Picual) from Dazhou,Jintang and Xichang in Sichuan province were used as tested materials, firstly, the climatic characteristics of Picual between the origin (Spain) and cultivation areas (Dazhou, Jintang and Xichang) were evaluated, combining with the oil content data detected, sunshine duration was the key factor which affected the oil content, the related gene segments in three introduced areas (Dazhou, Jintang and Xichang) by using PCR technology were cloned, and their sequences were made for SNP analysis. 【Result】SNPs in three gene fragments of anthocyanidin synthase, calcium binding protein and chalcone synthase were detected, a total of three CAPS sites were found, and 2 pairs of three CAPS sites (SNP1-HphI/SNP2-EagI and SNP2-EagI/SNP3-BsgI) could differentiate between the Dazhou, Jintang and Xichang of Picual with rapid and accurate identification.【Conclusion】In the next future, the further research on the functional difference of these genes would be carried out to lay the foundation for olive breeding.

OleaeuropaeaL.; Oil content; SNP; Genetic diversity

1001-4829(2017)6-1279-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.007

2016-07-10

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目“四川油橄欖主產(chǎn)區(qū)產(chǎn)油地域性差異的分子基礎(chǔ)研究”(2013JY0057)

趙 琦(1981-)，男，河北滿城人，副教授，從事植物生物工程技術(shù)研究；*為通訊作者，E-mail：lirui1986523@163.com。

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