整粒和半粒青稞種子DNA的提取及RAPD檢測

郝豆豆，張勇群*，高玉花，雷 鳴，武俊喜，拉 多

(1. 西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川 成都 610000；2. 西藏大學(xué)，西藏 拉薩 850000；3. 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，西藏 拉薩 850000)

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整粒和半粒青稞種子DNA的提取及RAPD檢測

郝豆豆1，張勇群1*，高玉花2，雷 鳴2，武俊喜3，拉 多2

(1. 西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川 成都 610000；2. 西藏大學(xué)，西藏 拉薩 850000；3. 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所，西藏 拉薩 850000)

【目的】從青稞種子中提取高質(zhì)量的基因組DNA?！痉椒ā恳园肓o胚青稞種子和整粒青稞種子為材料，用6種不同的方法提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，紫外分光光度計法檢測DNA的濃度和純度，并對提取的DNA進行了RAPD-PCR擴增檢測，同時將剩下的半粒有胚青稞種子進行萌發(fā)實驗?！窘Y(jié)果】從半粒和整粒青稞種子中都可以提取到高質(zhì)量的DNA，用提取的DNA作為RAPD-PCR擴增檢測模板，得到的擴增產(chǎn)物條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富，其質(zhì)量滿足RAPD分子標記的要求?！窘Y(jié)論】高鹽低pH法提取的DNA質(zhì)量最好，是這6種方法中的最佳方法；半粒青稞有胚種子也能夠正常生根發(fā)芽，可作為遺傳實驗的材料。

青稞種子；基因組DNA；RAPD-PCR擴增

【研究意義】青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)隸屬于禾本科大麥屬，是栽培大麥的變種。因其成熟時籽粒的內(nèi)外稃與穎果分離，籽粒裸露，故又稱之為裸大麥[1]。分子標記是研究青稞遺傳和育種的重要手段，既可以研究青稞種質(zhì)資源的遺傳多樣性，又可以對農(nóng)藝性狀進行輔助選擇，其優(yōu)點是針對性強、效率高、節(jié)省時間。要進行分子標記實驗，首先必須提取出高質(zhì)量的基因組DNA。一般經(jīng)常以新鮮葉片為提取材料，此過程需要浸種催芽，幼苗培養(yǎng)，液氮研磨[2]或者是在野外農(nóng)田采集需要對采集的葉片進行保存，過程都比較繁瑣。以青稞種子為材料，可以隨時提取DNA，節(jié)省了人力、物力、財力?！厩叭搜芯窟M展】青稞麥苗的藥用價值在明清時早有記載，如《本草綱目》中記載：“麥苗，辛寒無毒。主治消酒，毒暴熱，酒疽目黃。又解盅毒、煮汁濾服，解時疾狂熱，退胸膈熱，利小腸，作齋食，甚益顏色”[3]。青藏高原高寒缺氧，環(huán)境惡劣，青稞是青藏高原最具特色的高原農(nóng)作物，它的生長表現(xiàn)出了極強的抗逆性，這與它所含的相關(guān)耐逆基因之間有重要的關(guān)系，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，青稞符合“三高兩低”(高蛋白、高纖維、高維生素和低脂肪、低糖)的健康飲食標準， 由于其獨特的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和保健療效，在青藏高原地區(qū)有很高的利用價值，目前成為極具開發(fā)利用價值的高原特色農(nóng)作物之一[4]?！颈狙芯壳腥朦c】在進行青稞的各種遺傳突變實驗中，會出現(xiàn)后代籽粒稀少的情況，若將其繁殖，出現(xiàn)苗小、壞死、不出苗的情況[5]，會影響后續(xù)的實驗，所以本研究將青稞種子一分為二，一半用來提取DNA，另一半用作青稞種子萌發(fā)實驗，這樣一半用來基因型鑒定，一半用來表型鑒定[6]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究用了6種方法提取青稞整粒和半粒種子基因組DNA，旨在尋找最佳的提取方法，同時將另一半青稞種子進行萌發(fā)實驗，以期為青稞育種實驗提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青稞種子采自西藏拉薩農(nóng)牧區(qū)，將干燥的種子保存于4 ℃。

1.2 試劑

主要試劑有：無水乙醇，氯仿，異戊醇，異丙醇，CTAB，PVP，DTT，Tris，EDTA，SDS，λ-marker，marker-D，核苷酸染料，loading buffer，Agarose M，Taq酶，BPB，dNTP，MgCl2，10×Taq酶配套緩沖液(均購自生工生物工程(上海)有限公司)。

1.3 儀器

主要儀器有：Eppendorf 5417R型高速冷凍離心機，超低溫冰箱，水浴鍋-CD3192型恒溫控制器，研缽，1.5 mL離心管，不同量程的移液器及相應(yīng)的槍頭(購自上海生物公司)，核算蛋白測定儀(Eppendorf BioPhotometer plus)，WD-9413B凝膠成像分析儀(購自北京市六一儀器廠)，電泳槽(購自BIO-RAD公司)，PCR-T100(購自BIO-RAD公司)。

1.4 青稞種子萌發(fā)

選擇飽滿的青稞種子，將種子在1/2處用小刀切開，使胚完整，將有胚的半粒種種子和整粒種子在鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿中加入自來水(以浸透濾紙稍有剩余為宜[7])，于室溫下培養(yǎng)，每天適時給培養(yǎng)皿中加水，避免培養(yǎng)皿中水分完全蒸干，觀察種子生根發(fā)芽的情況。剩下的無胚的半粒青稞種子用來提取DNA。

1.5 DNA提取方法

1.5.1 傳統(tǒng)CTAB法[8]將飽滿的整粒和無胚的半粒種子，分別放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL預(yù)熱的提取液(0.015 mol/L EDTA(pH8.0)，0.075 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，1.5 % CTAB，1 mol/L NaCl)，浸泡30 min，然后將種子與提取液一同置于研缽中磨碎，再轉(zhuǎn)入離心管中，于65 ℃水浴保溫30 min，每隔幾分鐘顛倒混勻，使得粉末與提取緩沖液充分接觸；加入500 μl氯仿/異戊醇(24∶1)，震蕩混勻，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，重復(fù)離心，直至中間無白色物質(zhì)。取上清，加2倍體積的無水乙醇，于-20 ℃靜置30 min；取出于室溫14 000 r/min離心17 min，倒掉上清，用70 %乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥后溶于30 μl TE。-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 改良CTAB[9]將飽滿的整粒和無胚的半粒種子，分別放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.1 mol/L EDTA(pH8.0)，0.5 mol/L NaCl，2 % CTAB，3 % PVP，2 % DTT)，浸泡30 min，然后將種子轉(zhuǎn)移到研缽中磨碎，再轉(zhuǎn)入離心管中，65 ℃水浴30 min，不時顛倒混勻；稍冷卻后，4 ℃離心，12 000 r/min，10 min；取上清，加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，震蕩混勻，12 000 r/min，4 ℃，10 min，抽提2次；取上清，加等體積的異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置30 min；14 000 r/min，4 ℃，離心30 min，沉淀用70 %乙醇洗2次，風(fēng)干后溶于50 μl TE。-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 高鹽低pH法 將飽滿的整粒和無胚的半粒種子，分別放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液(0.1 mol/L NaAc，3 %可溶性PVP，2 % DTT，0.025 mol/L EDTA(pH 8.0),1.5 % SDS)，浸泡30 min，然后將種子與提取液一同置于研缽中磨碎，再轉(zhuǎn)入離心管中，于65 ℃水浴保溫30 min，不時顛倒混勻；稍冷卻后于4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取上清液加2/3倍體積的2.5 mol/L(pH4.8)的NaAc溶液，冰浴15 min；10 000 r/min，4 ℃，10 min。取上清液加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，震蕩混勻后10 000 r/min，4 ℃離心10 min；取上清，加等體積的異丙醇(-20 ℃預(yù)冷)，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置30 min；14 000 r/min，4 ℃離心20 min，用70 %乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶于30 μl TE。-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 改良SDS法 將飽滿的整粒和無胚的半粒種子，分別放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL冰上預(yù)冷提取液(0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.05 mol/L EDTA(pH8.0)，2 % DTT，3 %PVP)，浸泡30 min，然后將種子與提取液一同置于研缽中磨碎，再轉(zhuǎn)入離心管中于冰上放置10 min，然后6000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的裂解緩沖液，混勻后65 ℃水浴30 min，不時輕輕顛倒；取出后稍冷卻后，加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，震蕩至出現(xiàn)乳濁狀，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次；取上清液，加入1/4體積乙醇和1/3倍體積5 mol/L NaAC(pH 4.8)，立即10000 r/min離心10 min；取上清，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃靜置30 min；14 000 r/min，4 ℃離心23 min；并用70 %乙醇洗滌沉淀兩次，風(fēng)干后溶于50 μl TE。-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.5 高鹽CTAB法[10]將飽滿的整粒和無胚的半粒種子，分別放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的提取緩沖液(2 % CTAB，4 % PVP，2 mol/L NaCl，0.025 mol/L EDTA(pH8.0)，0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 % DTT)浸泡30 min，然后將種子與提取液一同置于研缽中磨碎，再轉(zhuǎn)入離心管中，于65 ℃水浴保溫30 min，不時顛倒混勻；稍冷卻后于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清，加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，震蕩混勻，10 000 r/min，4 ℃離心10 min，抽提2次；加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃靜置30 min；14 000 r/min，4 ℃離心10 min；棄上清，并用70 %乙醇洗滌沉淀2次，風(fēng)干后溶于50 μl TE。-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.6 Ezup柱式試劑盒法 基因組提取試劑盒購于生工生物工程(上海)有限公司。按照說明書進行操作。

1.6 DNA檢測方法

1.6.1 紫外分光光度計法 取2 μl DNA提取液用TE稀釋50倍，以100 μl TE作為空白對照，利用核酸蛋白測定儀測得DNA樣品的濃度，以及在波長260和280 nm處的吸光值，通過其比率可以判斷DNA的純度及提取效果。

1.6.2 瓊脂糖凝膠電泳 配制0.8 %的瓊脂糖凝膠，用λDNA作為對照，取4 μl DNA原液與1 μl的核酸染料混合，點入凝膠點樣孔，在TAE緩沖液中以110 V的電壓電泳50 min，并用凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器)進行拍照并保存。

1.6.3 PCR擴增 以提取的DNA為模板，配制25 μl的反應(yīng)體系：ddH2O：15.8 μl，Buffer：2 μl，MgCl2：2 μl，dNTP：2 μl，引物為RAPD12(CAATCGCCGT)：1 μl，Taq酶：0.2 μl，模板DNA：40 ng/10 μl PCR體系。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳(110 V、50 min)分離，在凝膠電泳成像儀上觀察，并保存圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞種子萌發(fā)培養(yǎng)

對整粒青稞種子和有胚的半粒青稞種子進行萌發(fā)培養(yǎng)，如圖1所示，整粒青稞種子和半粒青稞種子都生根發(fā)芽了，半粒青稞種子的根和芽的長度雖然比整粒種子的短，但是可以說明半粒有胚青稞種子基本能夠滿足青稞種子的生長需要，同時也可以作為遺傳實驗材料。

2.2 紫外分光光度計檢測結(jié)果

由表1可知，傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA濃度和純度最低；改良CTAB法比傳統(tǒng)CTAB法的效果好，但A260/A280的值低于1.6，說明所提DNA中有蛋白質(zhì)、多糖等，A260/A230的值小于2.0，有小分子物質(zhì)的污染；高鹽低pH法提取的DNA的A260/A280的值符合標準，說明蛋白質(zhì)、多糖等去除比較干凈，A260/A230的值略低于2.0，說明DNA中有小分子物質(zhì)的殘留；Ezup柱式試劑盒法提取的DNA的A260/A230的值大于2.0，說明沒有小分子物質(zhì)的污染，A260/A280的值大于2.0說明有DNA中有RNA，試劑盒法提取的DNA濃度較低；高鹽CTAB法提取的DNA中也有蛋白質(zhì)、多糖、小分子物質(zhì)的污染，且DNA濃度低。

1～2：半粒有胚青稞種子；3～4：整粒青稞種子1-2:Half-grain embryo seeds;3-4:Whole-grain seeds圖1 整粒和半粒青稞種子萌發(fā)情況Fig.1 Germination situation of whole-grain and half-grain Hordeum vulgare var.nudum seeds

方法Methods編號Number濃度(μg/mL)ConcentrationA260/280A260/230傳統(tǒng)CTAB法TraditionalCTABmethod半粒1(Half-grain1)301.140.90整粒2(Whole-grain2)401.220.70改良CTAB法ImprovedCTABmethod半粒3(Half-grain3)1101.591.65整粒4(Whole-grain4)1251.501.60高鹽低pH法HighsaltandlowpH半粒5(Half-grain5)3351.761.80整粒6(Whole-grain6)5151.781.74Ezup柱式試劑盒法Ezupkitmethod半粒7(Half-grain7)1802.312.20整粒8(Whole-grain8)2552.162.10改良SDS法ImprovedSDSmethod半粒9(Half-grain9)751.611.63整粒10(Whole-grain10)1051.581.20高鹽CTAB法HighsaltCTABmethod半粒11(Half-grain11)1301.501.43整粒12(Whole-grain12)2101.781.65

整粒和半粒青稞種子用同一種方法提取的效果基本相同，半粒青稞種子的DNA濃度比整粒?。涣N方法中高鹽低pH法提取效果最好。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

由圖2可知，傳統(tǒng)CTAB和改良SDS法的泳道上沒有DNA條帶，點樣孔中有殘留物質(zhì)，結(jié)合表1，這2種方法提取的DNA的濃度很低，雜質(zhì)多，少量的DNA被大量的雜質(zhì)粘到點樣孔中；改良CTAB法和Ezup柱式試劑盒法提取的DNA有明顯的拖尾現(xiàn)象，DNA降解嚴重；高鹽CTAB法提取的DNA條帶明亮，但是略有降解，高鹽CTAB法的點樣孔中有殘留物質(zhì)，說明雜質(zhì)較多；高鹽低pH法提取的DNA條帶最亮點樣孔中也幾乎沒有雜質(zhì)，說明這種方法效果最好；半粒種子提取的DNA的條帶不如整粒種子提取的DNA的條帶量，說明半粒種子提取的DNA的濃度低。

M：λDNA；1，2：傳統(tǒng)CTAB法；3，4：改良CTAB法；5，6：高鹽低pH法；7，8：Ezup柱式試劑盒法；9，10：改良SDS法；11，12：高鹽CTAB法；1，3，5，7，9，11：半粒青稞種子；2，4，6，8，10，12：整粒青稞種子圖2 6種方法提取的青稞整粒和半粒種子DNA的電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of DNA extracted by six methods from whole-grain and half grain Hordeum vulgare var.nudum seeds

2.4 RAPD-PCR擴增結(jié)果

由圖3可知，傳統(tǒng)CTAB法和改良SDS法提取的DNA沒有PCR擴增產(chǎn)物，高鹽CTAB法提取的半粒青稞種子DNA和改良CTAB法提取的整粒青稞種子DNA沒有PCR擴增產(chǎn)物，高鹽低pH法和Ezup柱式試劑盒法提取的DNA用于RAPD-PCR擴增條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富，可用于RAPD分子標記。

3 討 論

青稞種子中蛋白質(zhì)含量為10.1 %，高于其它谷類作物，礦質(zhì)元素和維生素高于其它谷類作物[11]，去除這些物質(zhì)是提取青稞種子DNA的關(guān)鍵。提取過程中，先用提取液將種子浸泡30 min，然后轉(zhuǎn)入研缽中研磨，這樣既有利于青稞種子的研磨，而且研磨過程中緩沖液中的PVP可以防止種子種的酚類物質(zhì)被氧化，進而阻止其于DNA發(fā)生不可逆的結(jié)合[12]，EDTA、SDS、CTAB等可以及時的和蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)等反應(yīng)，進而保護DNA，最后有利于得到更純凈、完整的DNA，DNA在研磨過程中速度要快，減少其在空氣中暴露的時間，防止DNA在空氣中被氧化[13]。在提取過程中，用氯仿/異物醇等進行抽提時，吸取上清的過程中避免將中間的蛋白質(zhì)雜質(zhì)吸進。純DNA樣品的A260/A280的值應(yīng)在1.7～1.9之間，如果比值大于1.9說明有RNA的污染，如果比值小于1.6說明有蛋白質(zhì)、多糖、多酚等的污染[13]；A260/A230的值應(yīng)大于2.0，如果小于2.0說明有小分子物質(zhì)(鹽類、氨基酸、核苷酸)的污染[14]。

M：Marker-D；1，2：高鹽CTAB法；3，4：改良SDS法；5，6：Ezup柱式試劑盒法；7，8：高鹽低pH法；9，10：改良CTAB法；11，12：傳統(tǒng)CTAB法其中1，3，5，7，9，11：整粒青稞種子，2，4，6，8，10，12：半粒青稞種子圖3 6種方法提取的DNA的RAPD-PCR擴增電泳圖譜Fig.3 RAPD-PCR amplification electrophoretogram of DNA extracted by six methods

4 結(jié) 論

青稞種子胚位于種子的一端，將含有胚的一端進行種子萌發(fā)培養(yǎng)，半粒種子DNA的提取主要是含有胚乳的部分。6種方法中，傳統(tǒng)CTAB法和改良SDS法提取的DNA電泳圖譜中沒有條帶，RAPD-PCR擴增產(chǎn)物中也沒有條帶，說明這2種方法沒有成功提取到青稞種子DNA；高鹽CTAB法和改良CTAB法提取的DNA純度較低，DNA所含雜質(zhì)的量比較多，高鹽CTAB法提取的半粒青稞種子DNA和改良CTAB法提取的整粒青稞種子DNA沒有PCR擴增產(chǎn)物，可能和種子的選取和操作的過程有關(guān)系，種子不飽滿、半粒種子切割時胚乳部分取樣太少、操縱過程中的步驟疏漏都可能導(dǎo)致DNA提取效果，從而影響PCR反應(yīng)；試劑盒法提取的DNA的A260/A280大于2.0，說明DNA中有RNA，A260/A230大于2.0，說明小分子物質(zhì)去除干凈，但是DNA濃度很低，試劑盒價格昂貴，所以這種方法不是最佳方法；高鹽低pH法提取的DNA沒有蛋白質(zhì)和多糖等的污染，DNA濃度較大，成本低，這種方法提取的青稞整粒和半粒種子DNA樣品的擴增產(chǎn)物基本是均勻一致的，所以高鹽低pH法為6種方法中最佳提取方法。同時還可以得出：半粒種子可以用來提取基因組DNA，所提取的DNA滿足PCR反應(yīng)的要求，可以用PCR分析來分析青稞基因組的任何DNA序列[15]，半粒青稞有胚種子也能夠正常生根發(fā)芽，可作為遺傳實驗的材料。

[1]郭本兆.青海經(jīng)濟植物志[M].西寧:青海人民出版社, 1987:701.

[2]姚 丹，張 揚，曲 靜，等.用于SSR分析的大豆干種子DNA提取條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(23):10917-10921.

[3]王曉蘭.青稞苗中總黃酮提取工藝研究[J].食品科技, 2010, 36(5):59-62.

[4]臧靖巍，闞建全，陳宗道，青稞的成分研究及其應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國食品添加劑, 2004(4):43-46.

[5]任 強，張增艷，黃 鵬.半粒小麥種子DNA提取的研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 45(4):59-62.

[6]閆雙勇，蘇京平，王勝軍，等.一種同時適用于水稻種子和葉片的簡單快速DNA提取方法[J].中國稻米, 2011, 17(5):11-13.

[7]姚曉華，吳昆侖.PEG預(yù)處理對青稞種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響[J].西北植物學(xué)報, 2012, 32(7):1403-1411.

[8]湯 潔，劉連生，許娜娜，等.絞股藍葉片DNA提取方法的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008,35(3):445-448.

[9]郝豆豆，雷 鳴，武俊喜，等.拉薩蒲公英基因組DNA不同提取方法的比較及PCR檢測[J].時珍國醫(yī)國藥, 2016, 27(8):2034-2037.

[10]郭 彬，侯思宇，黃可勝，等.大豆總RNA提取方法比較及其在基因克隆和表達分析中的應(yīng)用[J].分子植物育種, 2013, 11(2):255-261.

[11]呂遠平，熊茉君，賈利蓉，等.青稞特性及在食品中的應(yīng)用[J].食品科學(xué), 2005, 26(7):266-270.

[12]李 靜，曾德賢，吳子欣，等.麻瘋樹(JatrophacurcasL.)種子總DNA提取方法的建立和優(yōu)化[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2011, 24(2):728-731.

[13]李 榮，牛建新，王 林，等.適合核桃AFLP分析用的DNA提取方法研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006, 15(3):175-178.

[14]吉日木圖，李俊喬.不同方法提取青藏高原蕨麻總DNA的比較研究[J].北方園藝, 2011(6):152-154.

[15]翟文學(xué)，陸朝福，朱立煌.谷類作物半粒種子的PCR分析及其在標記輔助選擇育種中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報, 1996, 12(4):416-421.

(責(zé)任編輯 李 潔)

DNA Extraction and RAPD Detection of Half-grain and Whole-grainHordeumvulgarevar.nudum

HAO Dou-dou1, ZHANG Yong-qun1 *, GAO Yu-hua2, LEI Ming2, WU Jun-xi3, LHA-duo2

(1.Hospital of Chengdu Office of People’s Government of Tibetan Autonomous Region, Sichuan Chengdu 610000, China; 2.Tibet University, Tibet Lhasa 850000, China; 3.Institute of Geographical Sciences, Tibet Lhasa 850000, China)

【Objective】 The high-quality DNA could be extracted fromHordeumvulgarevar.nudum. 【Method】 The genomic DNA was extracted by six different methods from half-grain embryoless seeds and whole-grain seeds ofHordeumvulgarevar.nudum, UV Spectrophotometry and agarose gel electrophoresis were used to detect the concentration, purity and completeness of DNA. RAPD-PCR amplification was carried out on the extracted DNA.At the same time, the left half-grain embryo seeds were cultured for germination experiments. 【Result】High-quality DNA was able to be extracted from both half-grain and whole-grainHordeumvulgarevar.nudumseeds. The extracted DNAs were employed as the template for RAPD-PCR amplification detection,and the products of amplification have clear and rich polymorphism bands, the quality of extracted DNA could meet the requirement of RAPD molecular marker experiment. 【Conclusion】 High salt and low pH which could extract high quality DNA is the best method of six methods.In addition, the sprouting experiments indicated that the left half-embryo seed was able to sprout normally and can be used as material of genetic experiment.

Hordeumvulgarevar.nudumseed;Genomic DNA;RAPD-PCR amplification

1001-4829(2017)6-1257-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.003

2016-10-12

湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點實驗室(2014年)開放課題“幾種瀕危藏藥材的DNA條形碼研究”(2015DF03)；西藏自治區(qū)科技廳自然科學(xué)基金項目“瀕危藏藥材的生物信息學(xué)研究”(2015ZR-13-5)

郝豆豆(1992-)，女，碩士在讀，研究方向為植物學(xué)，Tel：15289095670，E-mail：31724478@qq.com，*為通訊作者：張勇群(1976-)，女，博士，副教授，從事藏藥材基因與功能研究，E-mail：yongqunzhang@yahoo.com。

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