法醫(yī)DNA快速檢驗研究進展

董 倩， 李彩霞， 趙 蕾， 郭瑜鑫， 馬溫華， 孫 輝，葉 健，李萬水，朱波峰，孫 敬

（1.西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；2.公安部物證鑒定中心 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室，北京 100038）

法醫(yī)DNA快速檢驗研究進展

董 倩1， 李彩霞2， 趙 蕾2， 郭瑜鑫1， 馬溫華2， 孫 輝2，葉 健2，李萬水2，朱波峰1，孫 敬2

（1.西安交通大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061；2.公安部物證鑒定中心 北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心 現(xiàn)場物證溯源技術(shù)國家工程實驗室，北京 100038）

法醫(yī)DNA快速檢驗技術(shù)是目前研究的熱點，主要應(yīng)用于個體識別和親子鑒定領(lǐng)域。該文分別從快速提取，快速擴增，快速設(shè)備，微流控芯片，全自動DNA分型檢測設(shè)備方面對現(xiàn)有DNA快速檢驗的技術(shù)方法，實驗原理進行充分說明和舉例論證，同時對該行業(yè)在快速檢驗方法的選擇問題上提出明確的建議——采用強抑制力的緩沖體系，高效酶并結(jié)合快速擴增程序?qū)崿F(xiàn)快速PCR檢測技術(shù)，同時提出芯片化DNA檢測的實現(xiàn)方式，指出國產(chǎn)的便攜式全自動快速檢測儀器是未來發(fā)展的主要方向。

快速檢驗；快速PCR；微流控芯片技術(shù)；全集成

0 引 言

1 生物檢材快速提取的研究現(xiàn)狀

DNA分型中，一般接觸性的檢材樣本DNA的提取通常要1 h以上[3]，而且會因提取樣本差異，面臨諸多挑戰(zhàn)以及花費更長時間。在樣本提取的載體方面，法醫(yī)DNA最常用的載體是棉簽或者拭紙，它們共同點是對DNA的吸附性強，但損害大，且分布不均一。早在2007年孫海汐等[4]發(fā)現(xiàn)了一種微量DNA的快速檢驗技術(shù)：生理鹽水簌口法，可快速獲取足以滿足PCR擴增的DNA，并且便宜、方便；而棉簽取材不穩(wěn)定，有一定吸附性，損害大，DNA含量少，牙簽效果則更差。在樣本提取所需環(huán)境方面，使用堿性裂解法可在5～10 min內(nèi)快速提取常規(guī)的生物檢材，2010年袁自闖等[5]采用差異裂解法，同時結(jié)合脫氧核苷酸核酶DNase I和堿性裂解法，調(diào)整溶液各成分的濃度及pH值，使用改良的堿性裂解液可在8min內(nèi)完成各類生物物證的提取，實現(xiàn)了快速獲得含有精斑的混合斑中的精子DNA。在樣本提取的試劑方面，Chelex 100最為常見，可用于全血、混合斑、毛發(fā)檢材，并在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成提取，但DNA純度不高。對于DNA含量少的檢材，通常采取M48磁珠法或是硅珠方法提取，2013年高林林等[6]利用PrepFiler Express BTA提取試劑盒結(jié)合AutoMate自動化法醫(yī)DNA提取工作站在3h內(nèi)實現(xiàn)了對骨粉和牙粉的裂解以及純化。在法醫(yī)DNA樣本提取的設(shè)備方面，一般體液樣本通常利用離心機分離DNA分子，或通過微型過濾器從流體樣本中抽提，需要20～30min才能完成，并在提取過程中使用過多的有毒化合物?，F(xiàn)今最新設(shè)備為2013年華盛頓大學(xué)的工程師聯(lián)合NanoFacture公司研發(fā)出的新型DNA提取設(shè)備——侵入流體樣本（唾液、痰液或血液）的顯微探針，通過在液體中施加電場，微型探針在其表面吸附DNA大小的顆粒，較大顆粒因擊中探針尖端而被彈開。采用這一技術(shù)，在3min內(nèi)就可分離和提純DNA分子。Ma C[7]用該顯微探針分別對4個不同來源樣本，包括細(xì)菌、酵母、人血和病毒進行了提取和比較，均可以獲得最大產(chǎn)量DNA，并進一步驗證了該新型顯微探針避開了傳統(tǒng)方法所有步驟，以更高效、環(huán)境更友好的簡單方式從流體樣本中提取DNA。

2 快速PCR擴增檢驗

快速PCR是指在保證PCR擴增反應(yīng)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提下，盡可能地縮短PCR反應(yīng)時間。國內(nèi)外已經(jīng)研發(fā)出各種商品化的試劑盒不同程度地縮短了PCR擴增時間。目前快速PCR的研究主要從對DNA聚合酶的改進、對緩沖體系（Buffer，Mix）的優(yōu)化和改進以及結(jié)合快速擴增程序等方面來實現(xiàn)，主要表現(xiàn)為免提取的擴增檢驗和快速擴增檢驗兩方面。

2.1 免提取的擴增檢驗

免提取擴增又稱直接PCR。它是指將未經(jīng)過處理的生物樣本直接加入PCR反應(yīng)體系并獲得擴增產(chǎn)物[8]。免提取擴增檢驗針對的樣本是血液、血卡、口腔拭紙、唾液卡、棉簽、毛發(fā)根部等常規(guī)檢材，對于混合檢材和疑難降解檢材目前沒有研究。國內(nèi)外早已有對全血DNA免提取而直接擴增的研究，Mercier等[9]在1990年就報道了全血擴增和以全血樣本提取DNA擴增的檢測具有同等效果。已上市的商品化直擴試劑盒針對的樣本均是血卡或是唾液卡。這些直擴試劑盒雖然會有位點選取和數(shù)目的差異，個體識別能力也不盡相同，并且對人群具有一定的選擇適用性，但相同點均是通過各自專用的酶及其配套的緩沖體系聯(lián)合相應(yīng)擴增程序來實現(xiàn)快速檢測（見表1[10]）。2013年Flores S報道的GloberFiler Express[11]采用更強效的抗抑制緩沖體系和專用酶，同時結(jié)合優(yōu)化的熱循環(huán)參數(shù)將PCR擴增時間縮短至40min。Myers等[12]將Direct進行比較，雖然兩種直擴試劑盒的性能不一樣，但通過改變樣本DNA的量，調(diào)整循環(huán)參數(shù)和適當(dāng)延長或減少毛細(xì)管進樣時間，最終使兩種試劑盒對同一樣本的檢測結(jié)果一致且分型準(zhǔn)確。

2.2 快速擴增檢驗

一種常用的快速擴增研究方法是選用合適的快速酶并結(jié)合快速循環(huán)程序?qū)ΜF(xiàn)有的常規(guī)試劑盒進一步優(yōu)化，以達到縮短PCR擴增時間為目的。如2008年Vallone等[13]將PyroStart和SpeedSTAR兩種酶結(jié)合使用，PyroStart酶（Fermentas，Glen Burnie，MD）可實現(xiàn)快速擴增，SpeedSTAR酶（Takara Bio USA，Madison，WI）可提高腺苷酸化，優(yōu)化各位點間的峰平衡，同時結(jié)合快速循環(huán)程序?qū)U增時間縮短為 36 min；Amanda Foster[14]選擇 SpeedSTARTMHS DNA聚合酶，使用Bio-Rad C1000TM擴增儀進一步提高升降溫循環(huán)的速率，同時修正每步的熱循環(huán)參數(shù)，并采用兩步代替3步的PCR方法使整個擴增的時間為 26 min；Bahlmann等[15]通過將試劑與分別與3種可替代酶相結(jié)合研究，并同時使用快速循環(huán)程序?qū)CR的擴增縮短為1 h；James White[16]通過使用快速啟動酶的快速循環(huán)程序，將16 HS擴增時間縮短為1h。另一種研究方法是將常規(guī)試劑盒與快速試劑盒相結(jié)合，或是將兩種或多種快速試劑聯(lián)合應(yīng)用。如王鴻迪等[17]聯(lián)合運用AmpFLSTR Sinofile試劑盒，QIAGENFast Cycling PCR試劑盒將擴增時間縮短至60min以內(nèi)。劉琳等[18]在2013年將分別與4種不同的快速PCR檢測試劑——TaKaRa，F(xiàn)ermentas，Invitrogen，Thermo聯(lián)合應(yīng)用初次構(gòu)建快速PCR擴增檢驗，并于2014年將試劑盒與TaKaRa快速PCR檢測試劑聯(lián)合使用，從而將常規(guī)的擴增時間175min縮短為為55min，并再次驗證了將 TyperTM19試劑盒與快速試劑結(jié)合可有效縮短PCR擴增時間。

由此可見，多種方法和途徑可以將常規(guī)PCR的擴增時間（3～5h）不同程度的縮短，所以可以使用國產(chǎn)試劑結(jié)合多種商品化的試劑盒中的酶或國產(chǎn)的酶結(jié)合多種商品化的試劑，或是采用多種高保真、強抗抑制力的酶與多種抑制能力更強的緩沖液（均從已上市的多種試劑盒中可以獲得）相互結(jié)合，多次比較，通過微調(diào)擴增體系各成分的比例、濃度，控制添加劑、抑制劑等措施來實現(xiàn)不同程度的快速擴增。

[16] Hermina Sutami, “Fungsi dan Kedudukan Bahasa Mandarin di Indonesia”, Paradigma, Vol. 2, No. 2 (2012), pp. 215-216.

表1 常用的直接擴增試劑盒

3 快速設(shè)備

實現(xiàn)法醫(yī)DNA快速檢驗設(shè)備主要包括快速擴增設(shè)備，快速電泳分析設(shè)備。

3.1 快速擴增設(shè)備

不同擴增設(shè)備的性能，效率明顯不同。Phillip Belgrader[19]最初在1998年報道使用了比9700擴增儀具有更快升降溫速率和更好溫控性能的微型裝置充電型熱循環(huán)儀器MATCI，可在21min內(nèi)完成PCR擴增。Amanda Foster[14]在建立快速PCR的方法時，將SpeedSTARTMHS DNA聚合酶分別與擴增儀器聯(lián)合使用，最終選用Bio-RadC1000TM擴增儀提高升降溫循環(huán)的速率，使整個時間為26min。所以盡可能選用升降溫速率快，溫控性能好的快速PCR，如Bio-Rad C1000TM，Eriti擴增儀（美國AB公司），LifePro擴增儀（杭州博日科技有限公司）等可以進一步有效縮短檢測時間。

3.2 快速電泳分析設(shè)備

目前國內(nèi)實驗室普遍配置的快速電泳檢測設(shè)備有3130XL型遺傳分析儀，可在45min完成16個樣本的同時檢測，3730型或3730XL型遺傳分析儀一次可同時完成48或96個樣本檢測，新型的3500XL型遺傳分析儀可在30 min內(nèi)完成24個樣本的同時檢測，但是這些檢測設(shè)備仍然滯后于當(dāng)前大批量生物物證檢驗和當(dāng)代法庭科學(xué)的需求。對快速電泳分析方面的研究，2011年平原等[20]用6+1 STR試劑盒結(jié)合一種新型毛細(xì)管電泳凝膠EX-Q20進行快速電泳分析，與SinofilerTM試劑盒結(jié)合POP4膠進行比較，6+1 STR試劑盒結(jié)合新型毛細(xì)管電泳凝膠能夠得到全部分型結(jié)果且耗時較短。在快速電泳部，該新型毛細(xì)管電泳凝膠EX-Q20合成丙烯酰胺-N，N-二甲丙基烯酰胺，形成一種新型準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)，解決了傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳凝膠不能兼顧分離效果與自涂敷功能的難題，同時通過局部改良和電泳參數(shù)的設(shè)置可節(jié)約成本。

4 微流控芯片技術(shù)

4.1 微流控芯片技術(shù)在法醫(yī)DNA領(lǐng)域的發(fā)展現(xiàn)狀

微流控芯片技術(shù)又稱微全分析系統(tǒng)（miniaturized total analytical system，μTAS），是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域。近年來諸多學(xué)者基于微流控芯片技術(shù)的角度，對涉及快速檢驗芯片DNA提取、芯片PCR擴增、毛細(xì)管芯片電泳及集成式芯片均進行了深入的研究。

在芯片DNA提取技術(shù)方面，國內(nèi)研究最多的是以二氧化硅微球為載體的固相提取，它是M48磁珠法和硅珠法提取DNA的微型化。原理如下：以二氧化硅微球、磁性微球等介質(zhì)作為DNA的固相載體，首先采用高離子鹽液進行DNA吸附、有機溶劑洗脫，最后使用低離子緩沖液洗脫DNA。如2010年Duarte[21]報道了基于固相萃取原理的玻璃材質(zhì)DNA提取芯片，如圖1所示，腔室的大小1.5 cm×1.4 mm×200μm，以確保預(yù)提取的DNA溶液量恒定；在磁場作用下整個腔室充滿磁性微球和鹽酸胍（GuHCl），整個裝置完成DNA的提取和純化。Cady等[22]也報道了基于固相萃取原理的DNA提取芯片，硅珠、sol-gel等固相載體填充于芯片中，實現(xiàn)了血樣等的DNA提純。陳興等[23]驗證了在多孔氧化硅芯片和普通芯片上進行DNA提取實驗，多孔氧化硅芯片提取DNA的效率更高。目前各種聚合物基底如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）等由于價格低廉、加工方便已經(jīng)被成功用于DNA提取系統(tǒng)。如2007年劉慣超等[24]制作的塑料基（PMMA）的DNA 提取芯片表明:經(jīng)過溶膠涂漬、在內(nèi)表面制作二氧化硅層的芯片能夠?qū)崿F(xiàn)從血液中提取DNA。王聿佶等[25]采用PDMS（聚二甲基硅氧烷）芯片，能對生物樣品中的DNA進行有效快速提取，并且在30min內(nèi)完成PCR產(chǎn)物的提純。國外還有報道基于pH誘導(dǎo)的靜電吸附DNA提取，基于UV活化的聚碳酸酯表面的DNA提取[26]，基于納米多孔過濾膜的DNA提取[27]。

圖1 以磁珠為載體的微流體芯片動態(tài)提取DNA裝置[21]

芯片PCR擴增與普通PCR擴增儀相比，擴增速度有明顯優(yōu)勢。普通臺式PCR擴增儀的產(chǎn)物擴增管升降溫度總是遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于擴增儀腔本身的溫度，而芯片PCR則具有明顯優(yōu)勢。Heidi Giese[28]報導(dǎo)對比普通臺式PCR儀器和微流控芯片使用SpeedSTAR試劑對樣本進行擴增，圖2為顯示的結(jié)果，普通臺式PCR儀器擴增所用時間為145.1min，芯片PCR的擴增所用時間為19.6 min，遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于普通臺式PCR儀器。采用升降溫速率性能佳的PCR擴增儀可以明顯縮短PCR的擴增時間，同樣，提高芯片溫度控制是實現(xiàn)芯片PCR快速擴增的關(guān)鍵，代表性的研究有Hagan等[29]以非接觸的紅外加熱方式進行熱循環(huán)擴增，結(jié)合SpeedSTARTDNA聚合酶，僅在45 min內(nèi)完成就完成了16個STR位點在微芯片上的擴增。Mathies小組[30]則以接觸式溫度控制方式實現(xiàn)芯片上PCR的快速擴增，同時證明了芯片PCR-CE的可行性。此外微機電技術(shù)和溫度傳感器等方面的研究也證明了可以縮短芯片PCR擴增時間。

芯片毛細(xì)管電泳具有進樣量少，靈敏度高，分析速度快等特點，非常適合法醫(yī)DNA-STR的快速檢驗。毛細(xì)管電泳芯片由于尺寸小，可施加較大場強，所以在幾秒鐘內(nèi)就可完成對樣品的分離，微陣列毛細(xì)管電泳芯片可實現(xiàn)高通量檢測則成為目前學(xué)者研究的熱點。2002年Emrich CA等[31]報道的將高通量384孔毛細(xì)管陣列微電泳芯片集成在半徑僅為8 cm的圓盤上，7 min內(nèi)實現(xiàn)了同時對384份樣品的檢測；2006年Yeung等[32]制作的高通量96孔毛細(xì)管陣列微電泳芯片可在30min內(nèi)同時實現(xiàn)96個樣本檢驗，這些均進一步顯示了微芯片技術(shù)在DNA-STR快速分析方面的巨大潛力和優(yōu)勢。為了防止樣品間發(fā)生交叉污染，降低成本，可以構(gòu)建一次性的塑料材質(zhì)的微整列電泳平臺。

圖2 普通臺式PCR儀器與芯片PCR的擴增對比[28]

集成式芯片是當(dāng)前微流控芯片研究的核心，如Hagan等[29]將DNA提取和RCR擴增集于一塊芯片上，通過采用固相提取，使用快速啟動DNA聚合酶及紅外加熱方式，在45min內(nèi)完成了口腔拭子的提取和PCR擴增；Roux等[33]將芯片PCR擴增和電泳檢測集成在一次性的塑料芯片上，通過非接觸式紅外加熱方法僅在7 cm芯片上完成了電泳分離；季旭等[34]研制的一種集成PCR反應(yīng)室與毛細(xì)管電泳CE的生物芯片，將硅片上制造的通過電阻加熱的凹槽作為擴增池，在擴增池下游設(shè)計制造毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，并通過紫外光等檢測器判斷結(jié)果，從而實現(xiàn)了樣品擴增、電泳分離和紫外光檢測的單片集成。Liu等[35]將特定DNA模板的純化、PCR擴增、進樣以及電泳全集成于一張微流控芯片上，并可在3h內(nèi)實現(xiàn)對樣本DNA的檢驗（如圖3所示），該全集成芯片原理結(jié)構(gòu)為兩個完全相同的分析系統(tǒng)在4in（1in=2.54cm）玻璃晶片上形成對稱的雙峰，每個分析系統(tǒng)包括聚二甲基硅氧烷（PDMS）微泵和兩個PDMS微型閥用于流體控制，首先通過4cm長的珠捕獲結(jié)構(gòu)用于DNA分叉通道系統(tǒng)模板的捕獲。圖3（b）為加熱器和電阻溫度檢測器（RTD），用于控制250nL PCR室的擴增。圖3（c）為500 mm長的雙T通道錐形結(jié)構(gòu)，用于控制PCR的純化和進樣，24 cm和14 cm長的通道用于CE分離，同時這兩個系統(tǒng)共享陽極、陰極，進一步節(jié)省了芯片的使用空間。文獻[36]在2014年將全集成芯片技術(shù)成功應(yīng)用于對模擬犯罪現(xiàn)場樣本檢材的檢驗。全過程包括制備特殊酶的反應(yīng)液用于DNA的提取，采用紅外非接觸式控溫技術(shù)完成PCR擴增和高分辨的電泳分離方法在2h內(nèi)完成了對樣本的準(zhǔn)確分型，并與傳統(tǒng)方法分型結(jié)構(gòu)一致。

4.2 芯片化法醫(yī)DNA檢測的實現(xiàn)方式

4.2.1 微流控芯片DNA提取條件的優(yōu)化

對提取進液量進行篩選，包括提取過程中的水，NaOH，HCL以及最后沖洗的水和TE緩沖液的體積，通過控制變量法，分別設(shè)置不同的體積梯度和停留時間，進行自動化提取，按照正常的擴增體系，并同時設(shè)置陽性對照和空白對照進行比較確定出最佳進液量；對于提取進液的管道可以設(shè)置多種不同的長度并運行自動化提取流程，提取后取出芯片上的載體物質(zhì)進行常規(guī)的PCR擴增并檢測，通過比較不同長度管道的擴增效果確定出最佳管道長度。

4.2.2 微流控芯片PCR擴增與優(yōu)化

對芯片PCR材料進行生物相容性驗證是芯片PCR正常擴增的前提，因為一般芯片的結(jié)構(gòu)是兩種以上的材料通過鍵和組成，在此過程中可能會有抑制物釋放出來從而影響后續(xù)的PCR擴增。直接將芯片的原材料剪取小塊，放入擴增體系，加陽性標(biāo)準(zhǔn)品，擴增檢測，同時設(shè)立不添加原材料的陽性對照，3個重復(fù)；分別用高溫浸泡的芯片材料和去離子水配置PCR反應(yīng)體系進行擴增檢測，同時設(shè)置正常去離子水為陽性對照，3個重復(fù)；用去離子水沖洗鍵合芯片材料3次，配置PCR反應(yīng)體系進行擴增檢測，同時設(shè)置正常去離子水為陽性對照，3個重復(fù)；對提取裝置最后的沖洗水進行研究，配置PCR反應(yīng)體系進行擴增檢測，同時設(shè)置正常去離子水為陽性對照，3個重復(fù)，對以上結(jié)果進行比較，如果熒光信號基本無差異則相容性良好。

微流控芯片PCR的實現(xiàn)重點在于對芯片材料屬性的研究和芯片擴增體系的優(yōu)化兩部分。首先了解芯片的基本結(jié)構(gòu)，一般芯片腔室的實際溫度和PCR擴增儀顯示的溫度有較大差別，所以需進行芯片溫度校準(zhǔn)，以保證規(guī)定時間內(nèi)有足夠的退火溫度和延伸時間；由于芯片材料的不同，即使對芯片PCR沒有抑制作用，但是由于芯片比表面系數(shù)的增加，對蛋白酶的吸附逐漸增加，以及載體的存在，吸附會更明顯，所以通常對芯片進行預(yù)處理，使內(nèi)壁和反應(yīng)體系隔絕，可以采用一定濃度的BSA、PEG進行芯片涂布預(yù)處理。微流控芯片對PCR某些成分的吸附，會影響PCR的擴增效果，通過對擴增體系中不同反應(yīng)液的分析和濃度調(diào)節(jié)，盡量改善擴增效果。采用控制變量法，分別對不同成分設(shè)置濃度梯度，進行擴增檢測，并且同時設(shè)立常規(guī)檢測進行比較；操作者可在擴增體系中加入不同濃度梯度的BSA、PEG，并設(shè)立常規(guī)陽性對照，3個重復(fù)進行比較，從而確定出最佳擴增體系。

圖3 全集成芯片原理結(jié)構(gòu)[35]

4.2.3 毛細(xì)管芯片電泳系統(tǒng)的優(yōu)化

根據(jù)毛細(xì)管電泳技術(shù)的基本原理，影響電泳的因素主要有電場強度、毛細(xì)管的材料和內(nèi)壁、緩沖液的成分、溶液的pH值和濃度、溫度等。對于電泳篩分介質(zhì)的制備，參考已有成果制作篩分介質(zhì)并同時選擇3種商品化的篩分介質(zhì)進行比較；對于管道表面修飾，參考已有研究成果進行動態(tài)涂布、靜態(tài)涂布處理，填充自制的篩分介質(zhì)后備用。芯片毛細(xì)管電泳實驗采用懸浮式的進樣方式，參考已報道的研究成果，選取合適的電壓、時間、光信號進行電泳檢測。

5 全自動DNA分型檢測設(shè)備

近幾年，國外相繼有3種全自動DNA分型檢測設(shè)備上市（見表2）。2013年美國 IntegenX公司全球首家推出RapidHIT200 DNA快速檢測儀，針對唾液、血液、血斑、唾液斑等樣品，通過選用Promega PowerPlex 16HS試劑，分型成功率均在89%以上，并且可在現(xiàn)場90min內(nèi)快速完成DNA檢測[37-38]，并且輸出的結(jié)果可與CODIS及中國 DNA數(shù)據(jù)庫比對。2016年最新升級的RapidHIT200 DNA快速檢測儀與GlobalFiler Express試劑相結(jié)合，可同時檢測7個樣本。文獻[39]用150份口腔樣本進行驗證，進一步說明了檢測準(zhǔn)確率更高，設(shè)備靈敏度高（從6 260個細(xì)胞中獲得37.5ng DNA）。DNAScanTM快速檢測設(shè)備是美國多政府部門合作在法律部門，刑事實驗和生物測定實驗室推行快速DNA檢測技術(shù)項目（Acceleted Nuclear Equipment，ANDE）研究成果之一。該快速設(shè)備使用一體化BioChipset試劑盒，在85min內(nèi)同時完成5個單一來源樣本的DNA檢測，符合美軍用810F耐用標(biāo)準(zhǔn)，并且通過沖擊試驗、振動試驗、墜落實驗及環(huán)境變化檢測實驗均證實該設(shè)備經(jīng)久耐用。Tan E等[40]對該儀器設(shè)備的性能，檢測的靈敏度等進行了進一步的驗證。2014年，LGC法醫(yī)刑偵科學(xué)協(xié)會成功研發(fā)的ParaDNA Screening快速檢驗系統(tǒng)可在75min內(nèi)同時實現(xiàn)對4個樣本的DNA檢測。

表2 商業(yè)化全集成DNA分析儀的比較

6 結(jié)束語

綜上，縮短對樣本DNA提取，擴增，純化，電泳檢測中任意環(huán)節(jié)所消耗的時間均可實現(xiàn)不同程度的法醫(yī)DNA的快速檢驗。國內(nèi)外成熟的方法是使用商品化的提取試劑，快速試劑，或是通過將快速試劑與性能好的快速擴增設(shè)備，電泳設(shè)備相結(jié)合來實現(xiàn)。但是本文認(rèn)為直接PCR會因為樣本中各種潛在的未知抑制物影響酶的活性，缺乏定量步驟會影響DNA的分型結(jié)果，所以使用商業(yè)化直擴試劑盒時，要嚴(yán)格按照試劑盒所規(guī)定的樣本量進行實驗。目前DNA-STR快速檢驗主要適用于常規(guī)檢材，但對于一些疑難檢材，混合樣品，以及高度降解的檢材的使用仍然是個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，但是要明確：快速檢驗的目的主要是協(xié)助公檢法處理一些棘手和特殊的案件，如處理案件性質(zhì)惡劣但必需在極其有限時間需要得到分型結(jié)果。雖然國外商業(yè)化的3種便攜式的全自動快速檢驗儀器已經(jīng)上市，但普遍存在的問題是檢測成本過高，并且不能自主選擇樣本數(shù)，國內(nèi)普及困難。全集成微流控芯片技術(shù)是目前快速檢驗研究的核心，即使芯片的適用具有一定的樣本選擇性，并且芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜，成本高，但是國內(nèi)的研究面臨的主要瓶頸是如何開發(fā)配套的軟件來分析自制的微芯片的電泳結(jié)果。法醫(yī)DNA快速檢驗需從檢測樣本數(shù)目的自主選擇、再檢測樣本能力以及疑難，混合樣本的角度出發(fā)，研制出我國國產(chǎn)的便攜式全自動快速檢測儀器，并實現(xiàn)推廣普及。

[1]CHAKRABORTY R， STIVERS D N， SU B， et al.The utility of short tandem repeat loci beyond human identification：implications for development of new DNA typing systems[J].Electrophoresis，1999，20（8）：1682.

[2]DANI S U， GOMES-RUIZ A C， DANI M A.Evaluation of a method for high yield purification of largely intact mitochondrial DNA from human placentae[J].Genetics&Molecular Research Gmr，2003，2（2）：178-84.

[3]駱繼懷，陳曉軍，孫紅兵，等.接觸性生物檢材提取DNA方法的比較[J].蘭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，41（1）：18-22.

[4]孫海汐，蔡金挺，朱琳楠，等.一種改良的人DNA微量快速檢驗技術(shù)[J].中國實驗診斷學(xué)，2007，11（6）：788-790.

[5]袁自闖，金洪年，賴躍，等.DNase-I純化結(jié)合堿性裂解法提取混合斑精子 DNA[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（1）：10-12.

[6]高林林，徐念來，謝煒，等.利用AutoMateExpressTM自動化法醫(yī)DNA提取系統(tǒng)提取骨骼及牙齒DNA[J].法醫(yī)學(xué)雜志， 2013，29（2）：127-129.

[7]MA C， LI C， WANG F， et al.Magnetic nanoparticles-based extraction and verification of nucleic acids from differentsources[J].Journal of Biomedical Nanotechnology， 2013（9）：703-709.

[8]LINACRE A， PEKAREK V， SWARAN Y C， et al.Generation of DNA profiles from fabrics without DNA extraction.[J].Forensic Science International Genetics，2010，4（2）：137-141.

[9]MERCIER B， GAUCHER C， FEUGEAS O， et al.Direct PCR from whole blood，without DNA extraction[J].Nucleic Acids Research，1990（18）：5908.

[10]ROMSOS E L，VALLONE P M.Rapid PCR of STR markers：applications to human identification[J].Forensic Science International Genetics，2015（18）：90-99.

[11]FLORES S， SUN J， KING J， et al.Internal validation of the globalFiler express PCR amplification kit for the direct amplification of referenceDNA samples on a high-throughput automated workflow[J].Forensic Science International Genetics，2014（10）：33-39.

[12]MYERS B A， KING J L， BUDOWLE B.Evaluation and comparative analysis of direct amplification of STRs usingScience International Genetics，2012，6（5）：640-645.

[13]VALLONE P M，HILL C R，BUTLER J M.Demonstration of rapid multiplex PCR amplification involving 16 genetic loci[J].Forensic Science International Genetics，2008，3（1）：42-45.

[14]FOSTER A，LAURIN N.Development of a fast PCR protocol enabling rapid generation ofprofiles for genotyping of human DNA[J].Investigative Genetics，2012，3（1）：1-11.

[15]BAHLMANN S， HUGHES-STAMM S， GANGITANO D.Development and evaluation of a rapid PCR method for theS5 system for forensic DNA profiling[J].Legal Medicine，2014，16（4）：227-233.

[16]WHITE J， HUGHESSTAMM S， GANGITANO D.Development and validation of a rapid PCR method for the16 HS system for forensic DNA identification[J].International Journal of Legal Medicine，2014，129（4）：1-9.

[17]王鴻迪，董海成，于俊峰，等.AmpFISTR Sinofiler快速PCR 擴增初探[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27（5）：397-398.

[18]劉琳，項林平，郭磊，等.4種快速PCR檢測試劑法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的初步研究[J].生命科學(xué)研究，2013，17（5）：431-435.

[19]BELGRADER P，SMITH J K，WEEDN V W，et al.Rapid PCR for identity testing using a battery-powered miniature thermal cycler[J].Journal ofForensic Sciences，1998，43（2）：315-319.

[20]平原，周懷谷，許炎，等.6+1 STR試劑盒和電泳凝膠EX-Q20用于DNA快速檢驗[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（6）：444-446.

[21]DUARTE G R，PRICE C W，LITTLEWOOD J L，et al.Characterization of dynamic solid phase DNA extraction from blood with magnetically controlled silica beads[J].Analyst，2010，135（3）：531-537.

[22]CADY N C， STELICK S， BATT C A.Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures[J].Biosensors&Bioelectronics，2003，19（1）：59-66.

[23]陳興，崔大付，劉長春，等.多孔氧化硅微流控DNA提取芯片的研制[C]∥全國微全分析系統(tǒng)學(xué)術(shù)會議，2005.

[24]劉慣超，肖宏，李荔，等.溶膠-凝膠法制作塑料基DNA提取芯片以及應(yīng)用于從人血中提取DNA[J].材料科學(xué)與工程學(xué)報，2007，25（1）：122-124.

[25]王聿佶，陳翔，曹慧敏，等.一種新型微流體DNA提取芯片的研究[J].微納電子技術(shù)，2007，44（9）：853-856.

[26]MALGORZATA A W， LLOPIS S D， WHEATLEY A，et al.Purification and preconcentration of genomic DNA from whole cell lysates using photoactivated polycarbonate（PPC） microfluidic chips[J].2006，34（10）：74.

[27]KIM J，GALE B K.Quantitative and qualitative analysis of a microfluidic DNA extraction system using a nanoporous AlO（x） membrane[J].Lab on A Chip，2008，8（9）：1516-1523.

[28]GIESE H，LAM R，SELDEN R，et al.Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis[J].Journal of Forensic Sciences，2009，54（6）：1287-1296.

[29]HAGAN K A，REEDY C R，BIENVENUE J M，et al.A valveless microfluidic device for integrated solid phase extraction and polymerase chain reaction for short tandem repeat（STR） analysis.[J].Analyst，2011，136（9）：1928-1937.

[30]LAGALLY E T， MEDINTZ I， MATHIES R A.Singlemolecule DNA amplification and analysis in an integrated microfluidic device[J].Analytical Chemistry，2001，73（3）：565-570.

[31]EMRICH C A， TIAN H， MEDINTZ I L， et al.Microfabricated 384-lane capillary array electrophoresis bioanalyzer for ultrahigh-throughput genetic analysis[J].2002，74（19）：5076-5083.

[32]YEUNG S H， GREENSPOON S A， MCGUCKIAN A，et al.Rapid and high-throughput forensic short tandem repeat typing using a 96-lane microfabricated capillary array electrophoresis microdevice[J].Journal of Forensic Sciences，2006，51（4）：740-747.

[33]ROUX D L， ROOT B E， REEDY C R， et al.DNA analysisusing an integrated microchip formultiplex PCR amplification and electrophoresis for reference samples[J].Analytical Chemistry，2014，86（16）：8192-8199.

[34]季旭，劉理天.一種集成PCR反應(yīng)室與CE的生物芯片的研究[J].儀器儀表學(xué)報，2003（S2）：201-202.

[35]LIU P， LI X， GREENSPOON S A， et al.Integrated DNA purification， PCR， sample cleanup,and capillary electrophoresis microchip for forensic human identification[J].Lab on A Chip，2011，11（6）：1041-1048.

[36]LE R D， ROOT B E， HICKEY J A， et al.An integrated sample-in-answer-out microfluidic chip for rapid human identification by STR analysis[J].Lab on A Chip，2014，14（22）：4415-4425.

[37]JOVANOVICH S， BOGDAN G， BELCINSKI R， et al.Developmental validation of a fully integrated sampleto-profile rapid human identification system for processing single-source reference buccal samples[J].Forensic Science International Genetics，2015，16（1）：181-194.

[38]HOLLAND M，WENDT F.Evaluation of the RapidHITTM200，an automated human identification system for STR analysis ofsingle source samples[J].Forensic Science International Genetics，2015（14）：76-85.

[39]DATECHNONG M，HUDLOW W R，BUONCRISTIANI M R.Evaluation of the RapidHITTM200 and RapidHITExpress kit for fully automated STR genotyping[J].Forensic Science International Genetics，2016，23：1-8.

[40]TAN E， TURINGAN R S， HOGAN C， et al.Fully integrated，fully automated generation of short tandem repeat profiles[J].Investigative Genetics，2013，4（1）：16.

（編輯：莫婕）

Advances in forensic DNA rapid test

DONG Qian1，LI Caixia2，ZHAO Lei2，GUO Yuxin1，MA Wenhua2，SUN Hui2，
YE Jian2，LI Wanshui2，ZHU Bofeng1，SUN Jing2（1.Xi’an Jiaotong University Forensic Medicine，Xi’an 710061，China；2.A Key Laboratory of Forensic Genetics，Beijing Engineering Rersearch Center of Crime Scene Evidence Examination，National Engineering Laboratory for Forensic Science，Institute of Forensic Science，Beijing 100038，China）

Forensic DNA typing technology has become a hot topic，mainly used in individual identification and paternity tests.This paper fully explains and illustrates the experiment principle about the forensic DNA test rapid research progress including rapid extraction，rapid amplification，rapid equipment，micro-fluidic chip technology and full integration.The author not only suggests that using strong suppression of buffer system，high efficiency enzyme and simultaneous rapid amplification can achieve rapid PCR detection technology but also puts forward the realization of chip DNA detection.Therefore the domestic portable automatic detection equipment is the main direction of the future development.

rapid testing；rapid PCR；micro-fluidic chip technology；full integration

A

：1674-5124（2017）07-0059-07

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.07.012

2016-08-10；

：2016-10-20

國家重點研發(fā)課題（2017YFC0803507）；公安部技術(shù)研究計劃項目（2015JSYJC46）

董 倩（1990-），女，陜西延安市人，碩士研究生，專業(yè)方向為法醫(yī)遺傳學(xué)。

孫 敬（1980-），男，天津市人，副主任法醫(yī)師，博士，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究。