ATP結(jié)合盒式蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)及其臨床意義

趙炳軍 屈 明 張曉麗 張林西

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

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·腫 瘤·

ATP結(jié)合盒式蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)及其臨床意義

趙炳軍 屈 明1張曉麗2張林西2

(河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

目的 探討多藥耐藥基因(MDR)1、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1及乳腺癌耐藥蛋白(ABCG2)在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用增強(qiáng)型二步法免疫組織化學(xué)方法檢測MDR1、MRP1及ABCG2三個基因在116例結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)，并分析其可能的臨床預(yù)后價值。結(jié)果 MDR1、MRP1及ABCG2在結(jié)直腸腺癌的陽性表達(dá)率顯著高于切端正常組織(P<0.05)。MDR1、MRP1及ABCG2的表達(dá)與病理學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duke分期密切相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別及腫瘤發(fā)生部位無關(guān)(P>0.05)。在結(jié)直腸腺癌中MDR1、MRP1及ABCG2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸腺癌中存在原發(fā)性耐藥現(xiàn)象，MDR1、MRP1及ABCG2可能在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中存在協(xié)同作用。聯(lián)合檢測MDR1、MRP1及ABCG2在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)對化療藥物的選擇、化療方案優(yōu)化及估計(jì)患者預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義。

ATP結(jié)合盒式蛋白(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；結(jié)直腸腺癌；多藥耐藥基因(MDR)1；多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1；乳腺癌耐藥蛋白(ABCG2)

ATP結(jié)合盒式蛋白(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族與多藥耐藥密切相關(guān)，部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過表達(dá)是腫瘤細(xì)胞重要的耐藥機(jī)制之一〔1〕，而在結(jié)直腸癌的相關(guān)報(bào)道甚少。本研究探討多藥耐藥基因(MDR)1、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)1、乳腺癌耐藥蛋白(ABCG2)這三個具有代表性的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)直腸腺癌的表達(dá)水平，并分析其與各臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2013年1月至2014年6月經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)直腸腺癌組織116例，年齡40～83歲，平均61.5歲；高分化30例，中分化52例，低分化34例。隨機(jī)抽取切端正常組織15例。病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，臨床資料完整，患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療。

1.2 主要試劑 即用型鼠抗人單克隆抗體MDR1、MRP1，乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液(pH8.0)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑及增強(qiáng)型二步法(PV6000)檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。濃縮型ABCG2鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)工程有限公司。

1.3 方法 免疫組化增強(qiáng)型兩步法(PV6000)檢測MDR1、MRP1和ABCG2基因的蛋白表達(dá)。蠟塊作4 μm厚的連續(xù)切片，組織切片常規(guī)脫蠟水化，95℃高溫EDTA修復(fù)抗原，H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，分別滴加一抗(ABCG2用抗體稀釋液進(jìn)行1∶100稀釋)4℃冰箱過夜，滴加二抗室溫孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染后，脫水透明封片。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 MDR1、MRP1、ABCG2蛋白染色結(jié)果以胞質(zhì)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色細(xì)胞為陽性細(xì)胞。評分標(biāo)準(zhǔn)采用1995年Sinicrope首次應(yīng)用的由Tanaka于2000年改良的定量計(jì)分法〔2〕，選取5個有代表性的不同區(qū)域，觀察5個400倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率和評定顯色強(qiáng)度。依照陽性細(xì)胞率計(jì)分：陽性細(xì)胞率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75為4分；依照顯色強(qiáng)度計(jì)分：未顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)得分相乘，并取5個高倍視野得分的平均值，得分<2分為陰性，得分≥2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 MDR1、MRP1、ABCG2在結(jié)直腸腺癌及切端正常結(jié)腸組織中的表達(dá) 三者均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，MDR1以細(xì)胞膜為主，ABCG2、MRP1以細(xì)胞質(zhì)為主，呈棕黃色顆粒狀，彌散分布見圖1。三者在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)顯著高于切端正常結(jié)腸組織(χ2=16.36、8.31、15.38，P<0.05)。見表1。

圖1 高、低分化結(jié)直腸癌組織MDR1、MRP1、ABCG2基因蛋白陽性表達(dá)(增強(qiáng)型二步法，×200)

組別nMDR1MRP1ABCG2結(jié)直腸腺癌11684(72.4)1)82(70.7)1)88(75.9)1)切端正常組織153(20.0)5(33.3)4(26.7)

與切端正常組織相比：1)P<0.05

2.2 MDR1、MRP1 和ABCG2蛋白在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系 MDR1、MRP1和ABCG2蛋白的表達(dá)分別為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、Duke分期A+B組顯著高于Duke分期C+D組，而高、中分化腫瘤組織顯著低于低分化癌組織(均P<0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 MDR1、MRP1和ABCG2在結(jié)直腸癌中陽性表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.3 MDR1、MRP1和ABCG2在結(jié)直腸腺癌表達(dá)的相關(guān)性 MDR1蛋白與MRP1蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.196，P<0.05)；MDR1蛋白與ABCG2蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.463，P<0.05)；ABCG2蛋白與MRP1蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.345，P<0.05)。

3 討 論

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)直腸癌臨床化療中發(fā)揮著重要作用，其中MDR1、MRP1和ABCG2最具有代表性，與結(jié)直腸癌等腫瘤耐藥關(guān)系密切〔3〕。MDR1介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制被稱為經(jīng)典機(jī)制，MDR1基因編碼的糖蛋白相對分子量為170 kD，被命名為P-糖蛋白(P-gp)，是一種具有ATP結(jié)合區(qū)域的跨膜糖蛋白，能夠利用水解ATP獲得能量，將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的天然疏水性化療藥物逆濃度梯度泵出細(xì)胞外，使化療藥物療效下降，甚至失效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明MDR1高表達(dá)是導(dǎo)致大多數(shù)結(jié)直腸腺癌存在原發(fā)性耐藥的原因之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸腺癌浸潤進(jìn)展過程中結(jié)果與Ding等〔4〕研究結(jié)果相同，并且其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDR1與低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1存在顯著共表達(dá)。研究〔5〕顯示MDR1與突變型P53表達(dá)高度相關(guān)，提示MDR1可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究在結(jié)直腸癌分化方面與魏學(xué)明等〔6〕報(bào)道一致。也有學(xué)者認(rèn)為MDR1的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的病理分化無關(guān)〔7〕，還有學(xué)者認(rèn)為MDR1在中高分化的結(jié)直腸癌組織中高于低分化組織〔8〕。這些分歧可能與MDR1基因單核苷酸多態(tài)性有關(guān)〔9〕。

MRP1與MDR1同屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜均有表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)為主。與MDR1不同的是，可以將與谷胱甘肽結(jié)合的多種抗癌藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，也可以將抗癌藥物隔離在高表達(dá)MRP1的囊泡內(nèi)，使抗癌藥物不能接近靶點(diǎn)從而耐藥。這種耐藥具有飽和性，隨著谷胱甘肽耗竭化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)也將停止〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)〔11〕報(bào)道較相似，MRP1在結(jié)直腸腺癌低分化組顯著高于中高分化組提示MRP1的高表達(dá)可能與結(jié)直腸腺癌的原發(fā)性耐藥產(chǎn)生及浸潤進(jìn)展有關(guān)。

ABCG2是近年來發(fā)現(xiàn)的一個與多藥耐藥相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCG2基因定位于人類染色體4q22上，編碼的蛋白質(zhì)由665個氨基酸構(gòu)成。它與MDR1和MRP1在結(jié)構(gòu)上有顯著的不同，只有一個三磷酸腺苷(ATP)結(jié)構(gòu)域和一個跨膜結(jié)構(gòu)域，所以又被稱為半分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要轉(zhuǎn)運(yùn)的底物為親水或半親水的分子。在尋找ABCG2的拮抗劑的研究中發(fā)現(xiàn)，能夠逆轉(zhuǎn)MDR1耐藥的傳統(tǒng)藥物，并不能夠逆轉(zhuǎn)ABCG2引起的耐藥〔12〕，說明ABCG2與MDR1的耐藥機(jī)制不盡相同。一項(xiàng)回顧性研究顯示高表達(dá)ABCG2的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌對奧沙利鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶(FOLFOX)的治療反應(yīng)顯著低于ABCG2弱表達(dá)者〔13〕。本研究提示ABCG2也參與結(jié)直腸癌原發(fā)性耐藥的產(chǎn)生。在結(jié)直腸癌Duke分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的對比中，本文結(jié)果與梁燕等〔14，15〕研究一致，ABCG2在細(xì)胞膜強(qiáng)表達(dá)與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。ABCG2可能在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程及耐藥產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。

本研究說明MDR1、MRP1、ABCG2三者在結(jié)直腸腺癌的原發(fā)性耐藥的產(chǎn)生及浸潤、轉(zhuǎn)移存在協(xié)同作用。因此，聯(lián)合檢測MDR1、MRP1、ABCG2在結(jié)直腸腺癌的表達(dá)有助于客觀評估患者原發(fā)多藥耐藥狀態(tài)，以便于選擇更敏感的化療藥物，制定更為合理的個體化治療方案，從而提高化療效果。

1 Vadlapatla RK，Vadlapudi AD，Pal D，etal.Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy：coordinated role and regulation of efflux transporters and metabolizing enzymes〔J〕.Curr Pharm Des，2013；19(40)：7126-40.

2 Tanaka K，Iwamoto S，Gon G，etal.Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas〔J〕.Clin Cancer Res，2000；6(1)：127-34.

3 張久聰，王彪猛，常宗宏，等.ABC細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其介導(dǎo)的細(xì)胞多藥耐藥研究進(jìn)展〔J〕.生物技術(shù)通訊，2014；25(6)：862-6.

4 Ding Z，Yang L，Xie X，etal.Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2010；136(11)：1697-707.

5 Zhang Z，Deng X，Ren X，etal.Expression of mutant p53 and of the multidrug resistant proteins P-glycoprotein and glutathione S-transferase-pi correlated in colorectal adenocarcinoma〔J〕.Scand J Gastroenterol，2010；45(7-8)：925-34.

6 魏學(xué)明，顧國利，任 力，等.多藥耐藥基因產(chǎn)物在大腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.世界華人消化雜志，2009；17(24)：2463-8.

7 饒 歆，林從堯，馮茂輝，等.結(jié)直腸癌P170蛋白表達(dá)的檢測及意義〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010；31(1)：58-60.

8 Shi H，Lu D，Shu Y，etal.Expression of multidrug resistance-related proteins p-glycoprotein，glutathione-s-transferases，topoisomerase-Ⅱ and lung resistance protein in primary gastric cardiac adenocarcinoma〔J〕.Hepatogastroenterology，2008;55(86-87)：1530-6.

9 Samanian S，Mahjoubi F，Mahjoubi B，etal.MDR1 gene polymorphisms：possible association with its expression and clinicopathology characteristics in colorectal cancer patients〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2011；12(11)：3141-5.

10 Chen ZS，Tiwari AK.Multidrug resistance proteins (MRPs/ABCCs) in cancer chemotherapy and genetic diseases〔J〕.FEBS J，2011；278(18)：3226-45.

11 Ji L，Wei Y，Jiang T，etal.Correlation of Nrf2，NQO1，MRP1，cmyc and p53 in colorectal cancer and their relationships to clinicopathologic features and survival〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2014；7(3)：1124-31.

12 Robey RW，Honjo Y，Morisaki K，etal.Mutations at amino-acid 482 in the ABCG2 gene affect substrate and antagonist specificity〔J〕.Br J Cancer，2003；89(10)：1971-8.

13 Lin PC，Lin HH，Lin JK，etal.Expression of ABCG2 associated with tumor response in metastatic colorectal cancer patients receiving first-line FOLFOX therapy-preliminary evidence〔J〕.Int J Biol Markers，2013；28(2)：182-6.

14 梁 燕，王新穎，彭 亮，等.ABCG2在大腸癌中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響〔J〕.現(xiàn)代消化及介入診療，2011；16(4)：260-6.

15 Liu HG，Pan YF，You J，etal.Expression of ABCG2 and its significance in colorectal cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2010；11(4)：845-8.

〔2016-02-17修回〕

(編輯 苑云杰/杜 娟)

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.ZD20131004)

張林西(1968-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤病因及發(fā)病機(jī)制研究。

趙炳軍(1976-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事消化道腫瘤發(fā)病機(jī)制及臨床研究。

R735.3

A

1005-9202(2017)14-3479-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.044

1 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科

2 河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心