烏司他丁對大鼠重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障功能的影響

劉 梅 谷 玥 張家瑋 劉寶華

(長春市中醫(yī)院，吉林 長春 130022)

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烏司他丁對大鼠重癥急性胰腺炎腸黏膜屏障功能的影響

劉 梅 谷 玥1張家瑋1劉寶華1

(長春市中醫(yī)院，吉林 長春 130022)

目的 探討烏司他丁(UTI)對重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠腸黏膜屏障的影響及其作用機制。方法 SD大鼠60只分成對照組、假手術(shù)(SO)組、SAP組和UTI組。制模后每隔8 h進行腹腔內(nèi)注射UTI(濃度1.5萬IU/kg)作為UTI組。各治療組檢測制模后8、24、72 h血漿內(nèi)毒素水平，通過RT-PCR法和免疫組化法對腸黏膜Toll樣受體(TLR)4表達進行檢測，并在電鏡下觀察腸黏膜組織。結(jié)果 對照組腸黏膜未見TLR4表達。與對照組相比，SAP組在制模后8 h血漿內(nèi)毒素和腸黏膜TLR4表達即出現(xiàn)升高，并隨時間的延長而繼續(xù)進行性增高。血漿內(nèi)毒素與腸黏膜TLR4二者明顯相關(guān)。UTI組同時點內(nèi)毒素、TLR4低于SAP組，電鏡下檢查發(fā)現(xiàn)病理損傷也同時減輕，24 h時最為明顯。結(jié)論 UTI能有效保護SAP發(fā)生時的腸屏障功能，其保護機制可能與腸黏膜TLR4的表達下調(diào)有關(guān)。

烏司他?。籘oll樣受體4，胰腺炎；腸屏障

重癥急性胰腺炎(SAP)往往導致胰腺壞死并繼發(fā)腹腔感染，從而產(chǎn)生腹腔室隔綜合征，繼發(fā)出現(xiàn)多器官衰竭。而SAP出現(xiàn)繼發(fā)感染，細菌一般來源于腸道細菌移位〔1〕。如果能有效保護腸黏膜功能屏障，對于預防胰腺壞死，繼發(fā)腹腔感染，降低患者的死亡率至關(guān)重要〔2〕。本研究旨在探討烏司他丁(UTI)對SAP模型大鼠腸黏膜屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備 Wistar雄性大鼠60只，270～320 g，隨機分為對照組6只、假手術(shù)組(SO)、SAP組和UTI組均18只。戊巴比妥鈉麻醉。SO組開腹翻動胰腺后即關(guān)腹。SAP組采用微泵逆行胰膽管注射4%?；悄懰徕c制成SAP模型。SAP制模后腹腔定期注射UTI 1.5萬IU/kg，間隔時間8 h，作為UTI組。分別于術(shù)后8、24、72 h采血2 ml，高速低溫離心，分離血漿后低溫保存。切取距回盲部5 cm處回腸腸段6～8 cm，部分腸組織以2.5%戊二醛固定，電鏡下觀察。部分腸組織固定后用于免疫組化檢測。其余腸組織液氮凍存用于RT-PCR檢測Toll受體(TLR)4表達。

1.2 檢測指標

1.2.1 血漿內(nèi)毒素水平 使用Mp80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)檢測，操作過程按檢測系統(tǒng)的操作流程進行。

1.2.2 RT-PCR檢測腸黏膜組織TLR4表達 取凍存腸組織約100 mg，提取腸組織細胞的總RNA，取A260/A280>1.6的標本用于實驗。半定量檢測腸組織TLR4 mRNA的表達。PCR擴增，最后擴增產(chǎn)物條帶為356 bp。內(nèi)參照選擇β-actin。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。用軟件進行數(shù)據(jù)處理，測定目的基因表達的相對含量。

1.3 免疫組化方法檢測 腸黏膜TLR4蛋白表達：4%中性甲醛固定的腸組織，S-P法檢測TLR4表達。每例切片觀察10個具有代表性的高倍視野(400倍)，計數(shù)細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕色的陽性細胞數(shù)，切片中陽性細胞比≤5%計0分， 5%～25% 1分；26%～50% 2分； 51%～75%3分；>75% 4分。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組血漿內(nèi)毒素水平的動態(tài)變化 對照組各時間點間血漿內(nèi)毒素水平無變化。而SAP組在8 h即出現(xiàn)上升跡象，并呈現(xiàn)進行性增高趨勢，制模72 h時達最高。UTI組較對照組增高，但低于SAP組，24 h時下降非常明顯(P<0.01)。見表1。

表1 各組血漿內(nèi)毒素水平比較

與SAP組比較：1)P<0.05

2.2 各組腸黏膜TLR4 mRNA的表達 對照組腸黏膜未檢測出明顯TLR4 mRNA，SAP組表達從8 h逐漸上升，并在72 h出現(xiàn)最高水平(P<0.01)。UTI組與SAP組比較，表達量在各時點均有所降低，24 h組最低(P<0.05)。見表2。

表2 各組腸黏膜TLR4 mRNA表達比較

與同組8 h比較：1)P<0.01；與SAP組比較：2)P<0.05

2.3 各組腸黏膜TLR4表達比較 見表3。對照組腸黏膜無TLR4陽性表達，SAP組在8 h表達即開始升高，表達量隨時間的延長而逐漸增高，72 h達到最高。UTI組與SAP同時點相比TLR4表達量明顯降低，其中24 h組最低(P<0.05)。

表3 各組腸黏膜TLR4表達比較

與SAP組比較：1)P<0.05

3 討 論

目前SAP的病死率仍居高不下。研究表明，在SAP發(fā)病早期，由于腸道缺血缺氧、缺血-再灌注損傷及微生物屏障的破壞等多種因素均直接引起患者腸屏障功能障礙。腸道是人體中最大的細菌儲存器官，腸屏障一旦受到損傷，腸黏膜通透性隨即增加，腸道內(nèi)細菌及產(chǎn)生的內(nèi)毒素移位，造成胰腺及胰周組織的嚴重感染，甚至誘發(fā)腹腔室隔綜合征和多器官衰竭綜合征(MODS)，使胰腺炎病情加重，死亡率上升〔3〕。

UTI能有效抑制內(nèi)源性氧自由基的產(chǎn)生，阻止多種炎癥介質(zhì)以及內(nèi)源性休克性因子如白細胞介素(IL)-6、IL-8、髓過氧化物酶(MPO)等產(chǎn)生，進一步增加腸道微循環(huán)供血，起到抗休克、預防MODS的作用。UTI還可有效抑制多種消化酶的活性，這些分泌的酶均對胰腺炎發(fā)生及發(fā)展起到關(guān)鍵作用。

血漿內(nèi)毒素升高是由于在腸黏膜屏障破壞后，來源于腸道的細菌會通過淋巴系統(tǒng)和門靜脈流到血液循環(huán)，從而發(fā)生腸源性感染。而細菌的細胞壁在血液中破裂會產(chǎn)生內(nèi)毒素，可進入血液，產(chǎn)生內(nèi)毒素血癥〔4〕。故評估腸黏膜通透性時可以用血漿內(nèi)毒素水平作為腸黏膜屏障功能的重要指標。TLR4表達升高說明內(nèi)毒素對腸道黏膜屏障損傷作用加重，它是介導內(nèi)毒素信號傳導的主要受體。本研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁能夠有效降低血漿內(nèi)毒素水平，并且降低腸黏膜TLR4表達水平。

SAP大鼠腸黏膜TLR4的持續(xù)高表達可能是介導腸黏膜過度炎性反應，加重腸黏膜屏障功能障礙的重要原因，而UTI則可能通過下調(diào)腸黏膜TLR4受體的表達，抑制炎性反應。本研究發(fā)現(xiàn)UTI組與同時相點SAP組相比較，能夠明顯降低血漿內(nèi)毒素水平，同時減輕腸黏膜病理損傷。這可能為臨床治療SAP時治療腸道屏障功能障礙提供一個新的相應措施。

1 Zhang JW,Zhang GX,Chen HL.Therapeutic effect of Qingyi decoction in severe acute pancreatitis-induced intestinal barrier injury〔J〕.World J Gastroenterol，2015;21(12):3537-46.

2 Luan ZG，Zhang H，Ma XC，etal.Role of high-mobility group box 1 protein in the pathogenesis of intestinal barrier injury in rats with severe acute pancreatitis〔J〕.Pancreas，2010;39(2)：216-23.

3 Merilainen S，Makela J，Koivukangas V，etal.Intestinal bacterial translocation and tight junction structure in acute porcine pancreatitis〔J〕.Hepatogastroenterology，2012;59(114)：599-606.

4 王思珍，李維勤.重癥急性胰腺炎腸源性細菌易位的研究進展〔J〕.中國實用外科雜志，2013；33(6)：515-8.

〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

北京協(xié)和醫(yī)學基金會“睿意基金”急診醫(yī)學研究專項基金 (No.R2015024)

劉寶華(1977-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事急重癥醫(yī)學研究。

劉 梅(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)急癥研究。

R657.5

A

1005-9202(2017)14-3436-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.024

1 吉林大學第一醫(yī)院