miR-638對胃癌細胞侵襲和遷移的影響及其分子機制

王 釗 楊東海 彭林濤

(邢臺市人民醫(yī)院普外科，河北 邢臺 054000)

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miR-638對胃癌細胞侵襲和遷移的影響及其分子機制

王 釗 楊東海1彭林濤

(邢臺市人民醫(yī)院普外科，河北 邢臺 054000)

目的 探討miR-638是否可通過直接調(diào)控靶向性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)通路從而抑制胃癌細胞的侵襲遷移。方法 qRT-PCR檢測miR-638在100對胃癌組織及癌旁組織中的表達、檢測miR-638在7株胃癌細胞系及1株正常胃黏膜細胞中的表達。Transwell和Wound Healing實驗驗證分別轉(zhuǎn)染miR-638模擬物(miR-638 mimics)及其無關(guān)對照寡核苷酸序列(scramble)到胃癌細胞AGS中時對細胞的侵襲和遷移能力的影響。TargetScan軟件預(yù)測miR-638的靶基因、將野生型或突變型SOX2的3'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因的下游(SOX2-wt或SOX2-mut)并分別與miR-638 mimics或scramble共轉(zhuǎn)染，熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C所預(yù)測的靶基因為SOX2，qRT-PCR和Western印跡分別檢測轉(zhuǎn)染miR-638 mimics和scramble后SOX2的mRNA和蛋白表達的及EMT相關(guān)蛋白表達。結(jié)果 miR-638在胃癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，同時miR-638在胃癌細胞系中的表達水平也顯著低于正常胃黏膜細胞系。轉(zhuǎn)染miR-638后，胃癌細胞AGS的侵襲和遷移能力顯著低于scramble組(P<0.05)。在共轉(zhuǎn)染miR-638或scramble和SOX2-wt的兩組中，共轉(zhuǎn)染miR-638和SOX2-wt組的熒光素酶活性強度降低了約43.1%(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-638后，SOX2的mRNA和蛋白表達水平均顯著下調(diào)；EMT相關(guān)的上皮標志物鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的表達顯著增加，而EMT相關(guān)的間質(zhì)標志物神經(jīng)鈣聯(lián)素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達則顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 miR-638可通過靶向調(diào)控SOX2而影響EMT，抑制胃癌細胞AGS的侵襲和遷移。

胃癌；miRNA-638；性別決定區(qū)Y框蛋白2；侵襲；遷移

MicroRNAs(miRNAs)是長度為19～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子，在動植物的基因表達調(diào)控中發(fā)揮十分重要的作用〔1〕。miRNAs可通過與其靶基因的3′-UTR區(qū)域(3′-非翻譯區(qū))結(jié)合，使mRNA降解或(和)抑制其翻譯從而調(diào)控其表達〔2〕。miRNAs可參與細胞的增殖、分化、凋亡等多個過程。研究顯示miRNAs與多種惡性腫瘤的發(fā)生或發(fā)展密切關(guān)聯(lián)〔3〕。據(jù)報道，miR-638在多種惡性腫瘤組織及細胞系中表達下調(diào)，并與多種惡性腫瘤的增殖、遷移、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移相關(guān)〔4〕。

處于中晚期的胃癌大多伴有胃癌細胞的轉(zhuǎn)移，嚴重影響患者的治療效果及預(yù)后〔5〕。據(jù)報道，腫瘤的侵襲遷移常與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)，即當腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時，其上皮細胞通過特殊黏附復(fù)合體而連接，且間充質(zhì)細胞逐漸失去細胞間黏附成為梭形細胞。常見的EMT相關(guān)的上皮標志物有鈣黏附蛋白E(E-cadherin)，間質(zhì)標志物有神經(jīng)鈣聯(lián)素(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)等〔6～8〕。EMT被認為是腫瘤發(fā)生侵襲遷移的中間階段，檢測EMT相關(guān)蛋白的變化可間接反映腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移狀態(tài)〔9〕。有文獻報道性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2和EMT信號通路有密切關(guān)聯(lián)〔10〕。本研究擬論證miR-638是否可通過抑制其靶基因SOX2而抑制EMT通路，并對胃癌細胞的侵襲遷移能力產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 miR-638模擬物(miR-638 mimics)及其陰性對照scramble購于Ambion公司。兔抗人SOX2，β-actin，E-cadherin，N-cadherin和Vimentin抗體均購于CAT公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購于武漢博士德公司。突變型SOX2的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的熒光素酶報告載體(SOX2-mut)和野生型SOX2的3′-UTR的熒光素酶報告載體(SOX2-wt)均由GeneCopoeia公司構(gòu)建。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購購于Promega公司，Lipofectamine 2000和Trizol試劑購于Invitrogen公司。蛋白提取試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購于Thermo公司。Transwell小室購于BD公司。TaqMan miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies，UK)。

1.2 臨床樣本 選取2012年9月至2015年9月經(jīng)邢臺市人民醫(yī)院病理科確診并存檔的100對胃癌組織及癌旁對照組織，病人的所有臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)被妥善保存且可隨時查閱。所有過程遵從赫爾辛基宣言的標準，得到我院倫理委員會的支持。病例均簽署了知情同意書，研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準。100例胃癌組織和癌旁對照組織均保存于液氮中用于提取RNA后檢測胃癌組織及癌旁對照組織樣本中miR-638的表達情況。

1.3 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株MKN-28，MKN-45，BGC-823，MGC-803，AGS，SGC-7901和HGC-27以及人正常胃黏膜細胞GES-1均來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細胞所。培養(yǎng)細胞于含10%胎牛血清(FBS，Gibco)和100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素(雙抗，Invitrogen)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)中，細胞放置于37℃，含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。后期用于提取細胞系RNA并檢測各細胞系中miR-638的表達情況。

1.4 RNA提取 取液氮保存的胃癌組織和癌旁對照組織樣品各100 mg，每份分別加入700 ml的Trizol試劑，充分研磨(細胞系總RNA的提取則每6孔板中加入100 μl Trizol，其余試劑則按比例遞減)。室溫放置5 min后加入140 ml氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min 12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上層液體到另一干凈的EP管中，按0.5 ml異丙醇/ml Trizol的比例加入異丙醇混勻，室溫放置10 min，離心去上清。1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，轉(zhuǎn)速7 500 r/min，4℃離心離心5 min，棄上清，室溫干燥，加入30 μl無RNase雙蒸水溶解，取1 μl測RNA濃度和純度，剩余RNA立即放入-20℃保存?zhèn)溆?。將分裝出的1 μl總RNA用于濃度測定，紫外可見分光光度計(Thermo，Nanodrop 2000)測定A260/A280比值，以1 μl的RNAase-free水作空白校對測定，當測定值<3時可正常進行樣本測定。RNA樣本測定前簡單離心，充分混勻后測定。當A260/A280在1.8～2.0之間時表示血清RNA的濃度合適，可進行后續(xù)實驗。

1.5 qRT-PCR檢測 以1.4中提取的組織或細胞總RNA為模板，按TaqMan的miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR kit (Qiagen，USA)說明書進行操作，檢測設(shè)備為BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(tǒng)(USA)。miR-638的引物由Invitrogen公司合成，miR-638引物序列為正義：GAGAGGATCCTGCCGCAGATCGCTG；反義：GAGTAAGCTTCAGGGAGTCCTCTGCC。U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT用于計算相對表達量，ΔΔCT =(CT miRNA-CT U6)target-(CT miRNA-CT U6)control。反應(yīng)體系為20 μl，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔，分別檢測組織樣本和細胞系中miR-638的表達情況。

1.6 miRNA/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 待細胞生長至匯合度達到80%～90%時，用0.25%Trypsin-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，1 000 r/min離心10 min后收集胃癌細胞株(AGS)細胞，用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成密度為5×104/ml的AGS細胞懸液，6孔板中每孔加入2 ml細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中。細胞匯合度約80%～90%時準備轉(zhuǎn)染，用無菌EP管配制Lipofectamine 2000和轉(zhuǎn)染試劑(miR-638、scramble、SOX2-mut或SOX2-wt)；兩者混勻并室溫放置20 min。將混合物加入到無血清培養(yǎng)液(不含抗生素)中混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的6孔中；培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換成常規(guī)RPMI-1640培養(yǎng)基，可進行后續(xù)的劃痕實驗和侵襲實驗?；蛘咴?8 h后，收集細胞提取蛋白或RNA，進行后續(xù)實驗。

1.7 劃痕實驗 細胞的遷移能力通過wound-healing實驗(劃痕實驗)來驗證，所有器械均提前滅菌，直尺和marker筆在實驗開始前也要在超凈臺中紫外臺中照射30 min，用marker筆在6孔板背后均勻劃橫線，每孔至少畫5條線，每孔加入約5×105個細胞。第二天用槍頭垂直于背后橫線劃痕，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，溫度為37℃，CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每0、6、12、24 h取樣拍照一次，評估m(xù)iR-638對細胞遷移能力的影響。

1.8 侵襲實驗 將實驗分成2組：miR-638組和scramble組。鋪加適量基質(zhì)膠稀釋液(無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按比例為1∶5稀釋)到Transwell小室中，培養(yǎng)箱放置4～6 h后成膜。取100～200 μl細胞密度為(1～5)×105個/ml的AGS細胞懸液加入到Transwell小室上腔，下腔中加入500 μl含血清的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取空白的24孔板，每孔加入600 μl的4%多聚甲醛溶液，小心用鑷子將小室夾出，將小室內(nèi)殘余液體倒掉，輕輕放入加有多聚甲醛的24孔板中，15～20 min后取出小室，輕輕地用棉簽擦去膜內(nèi)側(cè)的細胞并將小室反轉(zhuǎn)晾干。另取一個空白24孔板，給每孔加入600 μl的0.1%結(jié)晶紫甲醇溶液，將小室放入，染色30 min，取出小室用PBS洗凈。在顯微鏡(奧林巴斯研究級倒置熒光顯微鏡OLYMPUS IX73)下觀察并拍照。每個小室10個視野，計數(shù)取平均值。

1.9 熒光素酶活性檢測 將實驗分成四組：miR-638與SOX2-wt；scramble與SOX2-wt；miR-638與SOX2-mut；scramble與SOX2-mut，分別共轉(zhuǎn)染上述4組到胃癌細胞株AGS細胞中，48 h后收集細胞。按試劑盒說明書操作，單光子檢測儀(Biorad，USA)檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值，每組實驗設(shè)3個復(fù)孔，驗證SOX2是否為miR-638直接調(diào)控的靶基因。

1.10 Western印跡 將實驗分四組：miR-638 mimics(miR-638)組、miR-638 inhibitor組與其各自的對照(scramble-1，scramble-2)。分別轉(zhuǎn)染到胃癌細胞AGS中，48 h后提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。分別取30 μg樣本，進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5% BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶2 000的兔抗人SOX2抗體和1∶1 000兔抗人β-actin抗體(CAT，USA)，4℃過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，每次10 min，加入1∶800的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔的二抗(博士德，武漢)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL發(fā)光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描并保存條帶圖片。Quantity One軟件分析，以目的蛋白SOX2條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin的蛋白灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達水平，每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔，檢測miR-638對SOX2和EMT相關(guān)標志物的蛋白表達的影響。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用T檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-638在胃癌組織和細胞系中的表達 與癌旁組織進行比較，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-638的表達顯著下調(diào)(P<0.05)。隨后分別檢測miR-638在胃癌細胞株MKN-28，MKN-45，BGC-823，MGC-803，AGS，SGC-7901和HGC-27及人胃黏膜細胞GES-1中的表達，發(fā)現(xiàn)胃癌細胞株MKN-28，MKN-45，BGC-823，MGC-803，AGS，SGC-7901和HGC-27中miR-638的表達均下調(diào)，且AGS中miR-638的表達最低(P<0.05)，選擇AGS進行后續(xù)實驗。

2.2 過表達miR-638對胃癌細胞AGS的侵襲與遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-638模擬物48 h后，AGS細胞的遷移能力被顯著抑制(P<0.05)。見圖1。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-638后，AGS的穿膜細胞數(shù)量為(35 ± 6)，而對照組即轉(zhuǎn)染scramble組的穿膜細胞數(shù)為(130±8)，AGS細胞的遷移能力被顯著抑制(P<0.05)。

2.3 miR-638抑制胃癌細胞AGS侵襲與遷移的作用機制 通過TargetScan軟件預(yù)測，初步推斷SOX2是miR-638直接調(diào)控的靶基因(圖2A)。檢測熒光素酶的活性，結(jié)果顯示：共轉(zhuǎn)染SOX2-wt和miR-638 mimics時，熒光素酶活性強度下降了約43.1%(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染SOX2-mut的miR-638 mimics和scramble之間的熒光素酶活性強度則無顯著差異，即SOX2是miR-638直接調(diào)控的靶基因。與scramble組比較，miR-638可顯著抑制SOX2的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)，EMT相關(guān)的上皮標志物E-cadherin的表達顯著增加，而EMT相關(guān)的間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin的表達則顯著降低。見圖2B。即miR-638可通過靶向SOX2抑制EMT相關(guān)通路，從而抑制胃癌細胞的侵襲遷移。

圖1 過表達miR-638對胃癌細胞AGS遷移和侵襲能力的影響

A:TargetScan軟件預(yù)測SOX2是miR-638的靶基因;B:Western印跡檢測轉(zhuǎn)染miR-638后SOX2及EMT相關(guān)蛋白的表達改變圖2 miR-638抑制胃癌細胞AGS遷移與侵襲的內(nèi)在作用機制

3 討 論

腫瘤的轉(zhuǎn)移是胃癌病人發(fā)生死亡的主要原因之一，發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌病人5年生存率普遍較低〔11〕。目前關(guān)于胃癌細胞發(fā)生侵襲遷移從而引起胃癌轉(zhuǎn)移的內(nèi)在作用機制尚不明確，因此也缺乏治療轉(zhuǎn)移性胃癌的有效治療手段。侵襲遷移和間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化是發(fā)生轉(zhuǎn)移時的主要過程〔12〕，因此本研究中主要目標是找到一個與胃癌侵襲遷移和EMT相關(guān)的miRNA。

miRNAs是一類與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的調(diào)節(jié)基因表達的小分子，miRNAs在人類腫瘤中異常表達是一種較為常見的現(xiàn)象，例如miR-21，miR-106b，miR-17，miR-18a，miR-20a等常在胃癌中表達異?！?3〕。通過轉(zhuǎn)染miR-638到胃癌細胞AGS中，證實miR-638在胃癌中可發(fā)揮抑制胃癌細胞的侵襲和遷移的作用。

轉(zhuǎn)錄因子SOX2被認為是一種癌基因，可負調(diào)控下游相關(guān)靶基因的啟動子活性〔14〕。研究報道顯示異常的SOX2表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過刺激表皮生長因子受體(EGFR)和人Bcl2樣蛋白(BCL2L1)信號通路，SOX2可引起癌細胞的增殖〔15〕，通過Wnt/β-catenin通路刺激EMT、SOX2可促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移〔16〕。通過轉(zhuǎn)染miR-638模擬物到AGS細胞中，檢測EMT相關(guān)蛋白的變化，本文發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)的上皮標志物E-cadherin表達增加，間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin則表達下調(diào)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程得到逆轉(zhuǎn)，胃癌細胞AGS的侵襲轉(zhuǎn)移被抑制。

1 Kushlinskii NE，F(xiàn)ridman MV，Braga EA.Molecular mechanisms and microRNAs in osteosarcoma pathogenesis〔J〕.Biochemistry，2016；81(4)：315-28.

2 Zheng Z，Jiao Y，Du X，etal.Computational prediction of candidate miRNAs and their potential functions in biomineralization in pearl oyster Pinctada martensii〔J〕.Saudi J Biol Sci，2016；23(3)：372-8.

3 張金梅，李桃榮，陳 靜，等.癌癥的miRNA基因治療〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2013；13(11)：2172-4，2009.

4 Christenson SA，Brandsma CA，Campbell JD，etal.miR-638 regulates gene expression networks associated with emphysematous lung destruction〔J〕.Genome Med，2013；5(12)：114.

5 Inoue M，Otsuka K，Shibata H.Circulating tumor cell count as a biomarker of a specific gastric cancer subgroup characterized by bone metastasis and/or disseminated intravascular coagulation-an early indicator of chemotherapeutic response〔J〕.Oncol Lett，2016；11(2)：1294-8.

6 Li D，Zhang L，Zhou J，etal.Cigarette smoke extract exposure induces EGFR-TKI resistance in EGFR-mutated NSCLC via mediating Src activation and EMT〔J〕.Lung Cancer，2016；93：35-42.

7 Sougleri IS，Papadakos KS，Zadik MP，etal.Helicobacter pylori CagA protein induces factors involved in the epithelial to mesenchymal transition (EMT) in infected gastric epithelial cells in an EPIYA-phosphorylation-dependent manner〔J〕.FEBS J，2016；283(2)：206-20.

8 Mao Y，Wu S，Zhao R，etal.MiR-205 promotes proliferation，migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells by activation of AKT signalling〔J〕.J Int Med Res，2016；44(2)：231-40.

9 Zhang J，Liu D，F(xiàn)eng Z，etal.MicroRNA-138 modulates metastasis and EMT in breast cancer cells by targeting vimentin〔J〕.Biomed Pharmacother，2016；77：135-41.

10 Han YT，Chen XH，Gao H，etal.Physcion inhibits the metastatic potential of human colorectal cancer SW620 cells in vitro by suppressing thetranscription factor SOX2〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2016；37(2)：264-75.

11 Umemura A，Koeda K，F(xiàn)ujiwara H，etal.Totally laparoscopic total gastrectomy for gastric cancer at a single institutional experience and changes in technique of esophagojejunostomy〔J〕.Indian J Surg，2016；78(3)：249-53.

12 Cui F，Wang S，Lao I，etal.MiR-375 inhibits the invasion and metastasis of colorectal cancer via targeting SP1 and regulating EMT-associated genes〔J〕.Oncol Rep，2016；36(1)：487-93.

13 Tsai MM，Wang CS，Tsai CY，etal.Potential diagnostic，prognostic and therapeutic targets of micrornas in human gastric cancer〔J〕.Int J Mol Sci，2016；17(6)：E945.

14 Du XM，Wang LH，Chen XW，etal.Prognostic value of Sox2 expression in digestive tract cancers：A meta-analysis〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2016；36(3)：305-12.

15 Chou YT，Lee CC，Hsiao SH，etal.The emerging role of SOX2 in cell proliferation and survival and its crosstalk with oncogenic signaling in lung cancer〔J〕.Stem Cells，2013；31(12)：2607-19.

16 Li X，Xu Y，Chen Y，etal.SOX2 promotes tumor metastasis by stimulating epithelial-to-mesenchymal transition via regulation of WNT/β-catenin signal network〔J〕.Cancer Lett，2013；336(2)：379-89.

〔2016-09-14修回〕

(編輯 袁左鳴)

本刊啟事

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王 釗(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事普外腸胃方面研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3419-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.017

1 邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院普外科