王 釗 楊東海 彭林濤
(邢臺市人民醫(yī)院普外科,河北 邢臺 054000)
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miR-638對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其分子機制
王 釗 楊東海1彭林濤
(邢臺市人民醫(yī)院普外科,河北 邢臺 054000)
目的 探討miR-638是否可通過直接調(diào)控靶向性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)通路從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲遷移。方法 qRT-PCR檢測miR-638在100對胃癌組織及癌旁組織中的表達、檢測miR-638在7株胃癌細(xì)胞系及1株正常胃黏膜細(xì)胞中的表達。Transwell和Wound Healing實驗驗證分別轉(zhuǎn)染miR-638模擬物(miR-638 mimics)及其無關(guān)對照寡核苷酸序列(scramble)到胃癌細(xì)胞AGS中時對細(xì)胞的侵襲和遷移能力的影響。TargetScan軟件預(yù)測miR-638的靶基因、將野生型或突變型SOX2的3'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因的下游(SOX2-wt或SOX2-mut)并分別與miR-638 mimics或scramble共轉(zhuǎn)染,熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C所預(yù)測的靶基因為SOX2,qRT-PCR和Western印跡分別檢測轉(zhuǎn)染miR-638 mimics和scramble后SOX2的mRNA和蛋白表達的及EMT相關(guān)蛋白表達。結(jié)果 miR-638在胃癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織,同時miR-638在胃癌細(xì)胞系中的表達水平也顯著低于正常胃黏膜細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染miR-638后,胃癌細(xì)胞AGS的侵襲和遷移能力顯著低于scramble組(P<0.05)。在共轉(zhuǎn)染miR-638或scramble和SOX2-wt的兩組中,共轉(zhuǎn)染miR-638和SOX2-wt組的熒光素酶活性強度降低了約43.1%(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-638后,SOX2的mRNA和蛋白表達水平均顯著下調(diào);EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物鈣黏附蛋白E(E-cadherin)的表達顯著增加,而EMT相關(guān)的間質(zhì)標(biāo)志物神經(jīng)鈣聯(lián)素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達則顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 miR-638可通過靶向調(diào)控SOX2而影響EMT,抑制胃癌細(xì)胞AGS的侵襲和遷移。
胃癌;miRNA-638;性別決定區(qū)Y框蛋白2;侵襲;遷移
MicroRNAs(miRNAs)是長度為19~25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA分子,在動植物的基因表達調(diào)控中發(fā)揮十分重要的作用〔1〕。miRNAs可通過與其靶基因的3′-UTR區(qū)域(3′-非翻譯區(qū))結(jié)合,使mRNA降解或(和)抑制其翻譯從而調(diào)控其表達〔2〕。miRNAs可參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多個過程。研究顯示miRNAs與多種惡性腫瘤的發(fā)生或發(fā)展密切關(guān)聯(lián)〔3〕。據(jù)報道,miR-638在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞系中表達下調(diào),并與多種惡性腫瘤的增殖、遷移、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移相關(guān)〔4〕。
處于中晚期的胃癌大多伴有胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者的治療效果及預(yù)后〔5〕。據(jù)報道,腫瘤的侵襲遷移常與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān),即當(dāng)腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移時,其上皮細(xì)胞通過特殊黏附復(fù)合體而連接,且間充質(zhì)細(xì)胞逐漸失去細(xì)胞間黏附成為梭形細(xì)胞。常見的EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物有鈣黏附蛋白E(E-cadherin),間質(zhì)標(biāo)志物有神經(jīng)鈣聯(lián)素(N-cadherin),波形蛋白(Vimentin)等〔6~8〕。EMT被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生侵襲遷移的中間階段,檢測EMT相關(guān)蛋白的變化可間接反映腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移狀態(tài)〔9〕。有文獻報道性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)2和EMT信號通路有密切關(guān)聯(lián)〔10〕。本研究擬論證miR-638是否可通過抑制其靶基因SOX2而抑制EMT通路,并對胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力產(chǎn)生影響。
1.1 主要材料 miR-638模擬物(miR-638 mimics)及其陰性對照scramble購于Ambion公司。兔抗人SOX2,β-actin,E-cadherin,N-cadherin和Vimentin抗體均購于CAT公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于武漢博士德公司。突變型SOX2的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的熒光素酶報告載體(SOX2-mut)和野生型SOX2的3′-UTR的熒光素酶報告載體(SOX2-wt)均由GeneCopoeia公司構(gòu)建。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購購于Promega公司,Lipofectamine 2000和Trizol試劑購于Invitrogen公司。蛋白提取試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒和BCA蛋白定量檢測試劑盒均購于Thermo公司。Transwell小室購于BD公司。TaqMan miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies,UK)。
1.2 臨床樣本 選取2012年9月至2015年9月經(jīng)邢臺市人民醫(yī)院病理科確診并存檔的100對胃癌組織及癌旁對照組織,病人的所有臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)被妥善保存且可隨時查閱。所有過程遵從赫爾辛基宣言的標(biāo)準(zhǔn),得到我院倫理委員會的支持。病例均簽署了知情同意書,研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。100例胃癌組織和癌旁對照組織均保存于液氮中用于提取RNA后檢測胃癌組織及癌旁對照組織樣本中miR-638的表達情況。
1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株MKN-28,MKN-45,BGC-823,MGC-803,AGS,SGC-7901和HGC-27以及人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1均來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所。培養(yǎng)細(xì)胞于含10%胎牛血清(FBS,Gibco)和100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素(雙抗,Invitrogen)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)中,細(xì)胞放置于37℃,含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。后期用于提取細(xì)胞系RNA并檢測各細(xì)胞系中miR-638的表達情況。
1.4 RNA提取 取液氮保存的胃癌組織和癌旁對照組織樣品各100 mg,每份分別加入700 ml的Trizol試劑,充分研磨(細(xì)胞系總RNA的提取則每6孔板中加入100 μl Trizol,其余試劑則按比例遞減)。室溫放置5 min后加入140 ml氯仿,劇烈震蕩15 s,室溫放置5 min 12 000 r/min,4℃離心15 min,吸取上層液體到另一干凈的EP管中,按0.5 ml異丙醇/ml Trizol的比例加入異丙醇混勻,室溫放置10 min,離心去上清。1 ml 75%乙醇洗滌沉淀,轉(zhuǎn)速7 500 r/min,4℃離心離心5 min,棄上清,室溫干燥,加入30 μl無RNase雙蒸水溶解,取1 μl測RNA濃度和純度,剩余RNA立即放入-20℃保存?zhèn)溆?。將分裝出的1 μl總RNA用于濃度測定,紫外可見分光光度計(Thermo,Nanodrop 2000)測定A260/A280比值,以1 μl的RNAase-free水作空白校對測定,當(dāng)測定值<3時可正常進行樣本測定。RNA樣本測定前簡單離心,充分混勻后測定。當(dāng)A260/A280在1.8~2.0之間時表示血清RNA的濃度合適,可進行后續(xù)實驗。
1.5 qRT-PCR檢測 以1.4中提取的組織或細(xì)胞總RNA為模板,按TaqMan的miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,以cDNA為模板,按qSYBR-Green-containing PCR kit (Qiagen,USA)說明書進行操作,檢測設(shè)備為BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(tǒng)(USA)。miR-638的引物由Invitrogen公司合成,miR-638引物序列為正義:GAGAGGATCCTGCCGCAGATCGCTG;反義:GAGTAAGCTTCAGGGAGTCCTCTGCC。U6為內(nèi)參,2-ΔΔCT用于計算相對表達量,ΔΔCT =(CT miRNA-CT U6)target-(CT miRNA-CT U6)control。反應(yīng)體系為20 μl,每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔,分別檢測組織樣本和細(xì)胞系中miR-638的表達情況。
1.6 miRNA/質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞生長至匯合度達到80%~90%時,用0.25%Trypsin-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化,1 000 r/min離心10 min后收集胃癌細(xì)胞株(AGS)細(xì)胞,用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成密度為5×104/ml的AGS細(xì)胞懸液,6孔板中每孔加入2 ml細(xì)胞,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞匯合度約80%~90%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染,用無菌EP管配制Lipofectamine 2000和轉(zhuǎn)染試劑(miR-638、scramble、SOX2-mut或SOX2-wt);兩者混勻并室溫放置20 min。將混合物加入到無血清培養(yǎng)液(不含抗生素)中混勻,加入到待轉(zhuǎn)染的6孔中;培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換成常規(guī)RPMI-1640培養(yǎng)基,可進行后續(xù)的劃痕實驗和侵襲實驗。或者在48 h后,收集細(xì)胞提取蛋白或RNA,進行后續(xù)實驗。
1.7 劃痕實驗 細(xì)胞的遷移能力通過wound-healing實驗(劃痕實驗)來驗證,所有器械均提前滅菌,直尺和marker筆在實驗開始前也要在超凈臺中紫外臺中照射30 min,用marker筆在6孔板背后均勻劃橫線,每孔至少畫5條線,每孔加入約5×105個細(xì)胞。第二天用槍頭垂直于背后橫線劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞3次,加入無血清培養(yǎng)基,溫度為37℃,CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每0、6、12、24 h取樣拍照一次,評估m(xù)iR-638對細(xì)胞遷移能力的影響。
1.8 侵襲實驗 將實驗分成2組:miR-638組和scramble組。鋪加適量基質(zhì)膠稀釋液(無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按比例為1∶5稀釋)到Transwell小室中,培養(yǎng)箱放置4~6 h后成膜。取100~200 μl細(xì)胞密度為(1~5)×105個/ml的AGS細(xì)胞懸液加入到Transwell小室上腔,下腔中加入500 μl含血清的完全培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取空白的24孔板,每孔加入600 μl的4%多聚甲醛溶液,小心用鑷子將小室夾出,將小室內(nèi)殘余液體倒掉,輕輕放入加有多聚甲醛的24孔板中,15~20 min后取出小室,輕輕地用棉簽擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞并將小室反轉(zhuǎn)晾干。另取一個空白24孔板,給每孔加入600 μl的0.1%結(jié)晶紫甲醇溶液,將小室放入,染色30 min,取出小室用PBS洗凈。在顯微鏡(奧林巴斯研究級倒置熒光顯微鏡OLYMPUS IX73)下觀察并拍照。每個小室10個視野,計數(shù)取平均值。
1.9 熒光素酶活性檢測 將實驗分成四組:miR-638與SOX2-wt;scramble與SOX2-wt;miR-638與SOX2-mut;scramble與SOX2-mut,分別共轉(zhuǎn)染上述4組到胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞中,48 h后收集細(xì)胞。按試劑盒說明書操作,單光子檢測儀(Biorad,USA)檢測熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值,每組實驗設(shè)3個復(fù)孔,驗證SOX2是否為miR-638直接調(diào)控的靶基因。
1.10 Western印跡 將實驗分四組:miR-638 mimics(miR-638)組、miR-638 inhibitor組與其各自的對照(scramble-1,scramble-2)。分別轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞AGS中,48 h后提取各組細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。分別取30 μg樣本,進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5% BSA室溫封閉1~2 h,加入1∶2 000的兔抗人SOX2抗體和1∶1 000兔抗人β-actin抗體(CAT,USA),4℃過夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次,每次10 min,加入1∶800的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗(博士德,武漢),室溫孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入ECL發(fā)光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描并保存條帶圖片。Quantity One軟件分析,以目的蛋白SOX2條帶的灰度值和內(nèi)參β-actin的蛋白灰度值比值來確定目的蛋白的相對表達水平,每組實驗設(shè)置3個復(fù)孔,檢測miR-638對SOX2和EMT相關(guān)標(biāo)志物的蛋白表達的影響。
1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件,兩組間數(shù)據(jù)比較采用T檢驗,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one way ANOVA)。
2.1 miR-638在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達 與癌旁組織進行比較,發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-638的表達顯著下調(diào)(P<0.05)。隨后分別檢測miR-638在胃癌細(xì)胞株MKN-28,MKN-45,BGC-823,MGC-803,AGS,SGC-7901和HGC-27及人胃黏膜細(xì)胞GES-1中的表達,發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞株MKN-28,MKN-45,BGC-823,MGC-803,AGS,SGC-7901和HGC-27中miR-638的表達均下調(diào),且AGS中miR-638的表達最低(P<0.05),選擇AGS進行后續(xù)實驗。
2.2 過表達miR-638對胃癌細(xì)胞AGS的侵襲與遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-638模擬物48 h后,AGS細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制(P<0.05)。見圖1。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-638后,AGS的穿膜細(xì)胞數(shù)量為(35 ± 6),而對照組即轉(zhuǎn)染scramble組的穿膜細(xì)胞數(shù)為(130±8),AGS細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制(P<0.05)。
2.3 miR-638抑制胃癌細(xì)胞AGS侵襲與遷移的作用機制 通過TargetScan軟件預(yù)測,初步推斷SOX2是miR-638直接調(diào)控的靶基因(圖2A)。檢測熒光素酶的活性,結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染SOX2-wt和miR-638 mimics時,熒光素酶活性強度下降了約43.1%(P<0.05);而共轉(zhuǎn)染SOX2-mut的miR-638 mimics和scramble之間的熒光素酶活性強度則無顯著差異,即SOX2是miR-638直接調(diào)控的靶基因。與scramble組比較,miR-638可顯著抑制SOX2的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05),EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達顯著增加,而EMT相關(guān)的間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達則顯著降低。見圖2B。即miR-638可通過靶向SOX2抑制EMT相關(guān)通路,從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲遷移。
圖1 過表達miR-638對胃癌細(xì)胞AGS遷移和侵襲能力的影響
A:TargetScan軟件預(yù)測SOX2是miR-638的靶基因;B:Western印跡檢測轉(zhuǎn)染miR-638后SOX2及EMT相關(guān)蛋白的表達改變圖2 miR-638抑制胃癌細(xì)胞AGS遷移與侵襲的內(nèi)在作用機制
腫瘤的轉(zhuǎn)移是胃癌病人發(fā)生死亡的主要原因之一,發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌病人5年生存率普遍較低〔11〕。目前關(guān)于胃癌細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移從而引起胃癌轉(zhuǎn)移的內(nèi)在作用機制尚不明確,因此也缺乏治療轉(zhuǎn)移性胃癌的有效治療手段。侵襲遷移和間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化是發(fā)生轉(zhuǎn)移時的主要過程〔12〕,因此本研究中主要目標(biāo)是找到一個與胃癌侵襲遷移和EMT相關(guān)的miRNA。
miRNAs是一類與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的調(diào)節(jié)基因表達的小分子,miRNAs在人類腫瘤中異常表達是一種較為常見的現(xiàn)象,例如miR-21,miR-106b,miR-17,miR-18a,miR-20a等常在胃癌中表達異?!?3〕。通過轉(zhuǎn)染miR-638到胃癌細(xì)胞AGS中,證實miR-638在胃癌中可發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移的作用。
轉(zhuǎn)錄因子SOX2被認(rèn)為是一種癌基因,可負(fù)調(diào)控下游相關(guān)靶基因的啟動子活性〔14〕。研究報道顯示異常的SOX2表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān),通過刺激表皮生長因子受體(EGFR)和人Bcl2樣蛋白(BCL2L1)信號通路,SOX2可引起癌細(xì)胞的增殖〔15〕,通過Wnt/β-catenin通路刺激EMT、SOX2可促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移〔16〕。通過轉(zhuǎn)染miR-638模擬物到AGS細(xì)胞中,檢測EMT相關(guān)蛋白的變化,本文發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達增加,間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin則表達下調(diào),上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程得到逆轉(zhuǎn),胃癌細(xì)胞AGS的侵襲轉(zhuǎn)移被抑制。
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〔2016-09-14修回〕
(編輯 袁左鳴)
本刊啟事
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王 釗(1982-),男,碩士,主治醫(yī)師,主要從事普外腸胃方面研究。
R73
A
1005-9202(2017)14-3419-04;
10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.017
1 邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院普外科