VEGFR-2靶向超順磁性氧化鐵磁性納米探針構建及肝癌細胞磁共振分子成像

梅 蘋 全姬善 宋曉偉 延光海 金恩浩 金光玉

(延邊大學附屬醫(yī)院影像一科，吉林 延吉 133000)

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VEGFR-2靶向超順磁性氧化鐵磁性納米探針構建及肝癌細胞磁共振分子成像

梅 蘋 全姬善1宋曉偉 延光海2金恩浩 金光玉

(延邊大學附屬醫(yī)院影像一科，吉林 延吉 133000)

目的 制備血管內皮生長因子受體(VEGFR)-2靶向磁共振(MR)分子探針，探討其對肝癌細胞的特異性靶向作用。方法 采用共沉淀法制備超順磁性氧化鐵(SPIO)，用殼聚糖對其表面進行修飾，耦聯(lián)anti-VEGFR2抗體，制備VEGFR-2靶向MR分子探針(anti-VEGFR2-CS@SPION)，以未修飾的SPIO納米粒作為對照組。DLS法測量粒徑大小、分布及Zeta電位，3.0T MR檢測T2弛豫率。MTT法評價探針的安全性，通過激光共聚焦顯微鏡檢測以及普魯士藍染色的方法驗證探針與肝癌細胞結合的特異性。3.0T MR觀察探針的體外MR成像能力。結果 SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION的粒徑分別為 20.6 nm和38.4 nm；Zeta電位分別為-(20.3±1.32)mV、(3.58±1.28)mV。T2弛豫率分別為0.179×106M-1S-1、0.201×106M-1S-1。細胞毒性實驗表明探針在高濃度下對細胞沒有毒性；激光共聚焦顯微鏡檢測顯示，抗體探針與HepG2細胞特異性結合；anti-VEGFR2-CS@SPION與HepG2細胞孵育后經普魯士藍染色，細胞內見較多的藍染顆粒，而單純SPIO組細胞內未見藍色顆粒。體外MR成像顯示，anti-VEGFR2-CS@SPION組、單純SPIO組和空白對照組的T2值分別為(55.6± 1.4)ms、(99.8±0.77)ms和(110.8±0.95)ms，差異有統(tǒng)計學意義(F=317.547，P<0.01)。結論 殼聚糖修飾和SPIO標記的anti-VEGFR2抗體探針具有良好的生物學特性和體外肝癌細胞MR顯像能力。

VEGFR-2；超順磁性氧化鐵；殼聚糖；腫瘤靶向；磁共振分子成像

磁共振(MR)分子成像可以實現肝癌特異性診斷和早期檢測。血管內皮生長因子(VEGF)及其受體(VEGFR)是重要的血管生成顯像劑，VEGF與VEGFR在腫瘤細胞的表達程度與腫瘤新生血管的增殖、侵襲、轉移及預后相關〔1〕。VEGF可以與3種特異性VEGFR結合，其中VEGFR-2是血管內皮細胞表面與VEGF反應的主要受體，VEGF與VEGFR-2相互作用而調節(jié)生理或病理條件下新生血管的生成〔2〕。惡性腫瘤中存在VEGFR的高表達，而在正常組織中局限表達特性使其成為腫瘤診斷和免疫治療理想的靶分子。超順磁性氧化鐵(SPIO)納米粒具有良好的生物安全性，可以連接抗體、蛋白質、藥物等特異地靶向作用于腫瘤，實現MR靶向診斷和治療〔3〕。殼聚糖是天然高分子多糖，具有氨基和羥基基團，修飾氧化鐵納米粒表面使其具有親水性、生物相容性及穩(wěn)定性，并有抗腫瘤、強化肝功能等多種藥理活性〔4〕。本研究利用VEGFR-2抗體主動靶向的特性，以殼聚糖為修飾材料，標記SPIO構建VEGFR-2靶向MR分子成像探針，體外探測其對肝癌細胞的靶向效果，為肝癌的MR特異性分子成像提供基礎。

1 材料與方法

1.1 VEGFR-2靶向MR分子探針的制備及表征

1.1.1 分子探針的構建 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 購自Pierce 公司。利用共沉淀法制備磁性氧化鐵納米顆粒，用殼聚糖對其表面進行修飾。將0.2 g殼聚糖加入到1%(V/V)的醋酸水溶液中，充分溶解后，加入一定量的經充分超聲分散的SPIO 0.5 ml，室溫下攪拌4 h后，磁分離法洗滌4～5遍，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

利用化學耦聯(lián)劑EDC/NHS制備免疫磁性納米探針。取0.2 mg CS-SPION用雙蒸水磁分離洗滌3遍后，用1 ml 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)緩沖液(0.1 mol/L，pH4.7)重懸并超聲分散，然后加入適量的經過EDC/NHS活化的VEGFR-2抗體，混勻，室溫下輕輕搖動2 h。將混合物用PBS磁分離洗滌3次，以除去游離抗體，然后將磁性納米顆粒重懸于含10 g/L PEG-COOH的PBS溶液中，室溫振蕩2 h。同樣進行磁分離洗滌除去游離分子，最后重懸于等體積的PBS(0.1 mol/L，pH7.4)中，4℃保存。

1.1.2 分子探針的表征 探針合成后，利用激光納米粒度儀測量SPIO及anti-VEGFR2-CS@SPION的粒徑及Zeta電位。

1.2 T2弛豫率測量 anti-VEGFR2-CS@SPION與SPIO分別稀釋至鐵濃度為0.02、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18和0.20 mmol/L的溶液，依次取這些濃度的樣品液1 ml置于EP管中，另取1 ml蒸餾水作為對照，應用Philips Verio 3.0T MR掃描儀進行橫斷位T2 Mapping掃描。將anti-VEGFR2-CS@SPION與SPIO不同鐵濃度為橫坐標(X)、1/T2為縱坐標(Y)分別作圖，得到直線的斜率即anti-VEGFR2-CS@SPION和SPIO的弛豫率。

1.3 細胞存活率檢測 應用四甲基偶氮唑(MTT)比色法檢測細胞毒性。anti-VEGFR2-CS@SPION和SPIO分別稀釋成20、40、60、80 μg/ml。將HepG2細胞以1×104/孔細胞數接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT溶液25 μl，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除各孔原液，加DMSO 100 μl，振蕩混勻，酶標儀測定540 nm波長各孔光吸收值(OD)。試驗中設3個平行樣品，重復3次。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測 將Cy5.5熒光染料耦聯(lián)至探針，配置鐵濃度為40 μg/ml的Cy5.5-anti-VEGFR2-CS@SPION和Cy5.5-SPIO溶液，分別與HepG2細胞孵育1 h后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.5 普魯士藍染色 將生長良好的HepG2細胞制成細胞懸液接種于24孔板內，37℃、5 % CO2條件下孵育24 h后，用PBS洗滌3遍。分別加入anti-VEGFR2探針和SPIO(鐵濃度為40 μg/ml)，放入CO2培養(yǎng)箱內孵育，PBS洗滌3遍，用4%多聚甲醛1 ml固定20 min后，置于含2%亞鐵氰化鉀和2 % 氯化氫混合液避光孵化30 min，用1 % 核固紅復染1 min，流水沖洗，置于倒置顯微鏡下觀察。

1.6 體外MR成像 將鐵濃度為40 μg/ml的anti-VEGFR2-CS@SPION和SPIO分別與HepG2細胞孵育24 h后，PBS洗滌3遍，0.25 % 胰酶消化后收集細胞懸液，離心，用4%多聚甲醛固定，PBS重懸后，置于EP管中進行MR掃描。未做任何處理的HepG2細胞作為空白對照組。采用Philips Verio 3.0T MR掃描儀進行橫斷位T2 mapping掃描。SE序列掃描參數為：TR 1 000 ms，TE 分別為16 ms、32 ms、48 ms、64 ms和80 ms，TR 2 500 ms，FOV 12 cm×12 cm，矩陣320 × 300，層厚3 mm，間隔0.6 mm，測量每管內連續(xù)3個ROI的T2值，每個ROI測量3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 磁性納米粒的表征 激光納米粒度儀檢測，SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION粒度分布較均勻，粒徑分別為 20.6 nm、38.4 nm，合成后的抗體探針粒徑較SPIO粒徑增大，說明抗體成功耦聯(lián)到SPIO上，見圖1。 Zeta電位分別為-(20.3±1.32)mV、(3.58±1.28)mV。

圖1 透射電鏡下SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION納米粒的照片

2.2 T2弛豫率 隨著鐵濃度的增加，anti-VEGFR2-CS@SPION組和SPIO組的T2值逐漸下降，符合MR陰性對比劑的基本特征。anti-VEGFR2-CS@SPION組和SPIO組的T2弛豫率分別為0.201×106M-1S-1、0.179×106M-1S-1。T2弛豫率大，則表明縮短質子馳豫時間的能力越強，在MR圖像上造成組織之間的信號差別就越大，即T2信號減低。

2.3 細胞存活率 MTT實驗結果表明，anti-VEGFR2-CS@SPION組細胞與SPIO組細胞OD值之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，在80 μg/ml鐵濃度下具有較高的細胞存活率，表明合成的抗體探針具有良好的生物相容性及安全性，見圖2。

2.4 激光共聚焦顯微鏡檢測 使用激光共聚焦顯微鏡觀察探針與HepG2細胞的結合情況，結果顯示，抗體探針可以特異性與HepG2細胞結合，細胞膜和細胞質內有較多的熒光染色(圖3A)，而單純SPIO未見熒光染色(圖3B)。

2.5 普魯士藍染色 anti-VEGFR2-CS@SPION與HepG2細胞孵育后，細胞內可見較多的藍色顆粒(圖4A)，而未修飾的SPIO與HepG2細胞孵育后，細胞內未見藍色顆粒(圖4B)。

2.6 體外MR成像 體外MR成像顯示，anti-VEGFR2-CS@SPION與HepG2細胞共孵育后明顯縮短T2信號，T2信號明顯低于SPIO和空白對照組，見圖5。anti-VEGFR2-CS@SPION組、單純SPIO組和空白對照組的T2值分別為(55.6± 1.4)ms、(99.8±0.77)ms和(110.8±0.95)ms，差異有統(tǒng)計學意義(F=317.547，P<0.01)。

圖2 MTT法檢測探針的細胞毒性

圖3 探針與HepG2細胞結合情況(×600)

圖4 HepG2細胞與探針孵育后普魯士藍染色

圖5 細胞體外MR成像

3 討 論

抗體具有高度特異性和靶向性，通過抗原與抗體的特異性結合，將腫瘤新生血管上某些特異性配體負載順磁性造影劑SPIO表面，可增加MR分子探針的靶向性與特異性，可以實現腫瘤特異性靶向MR成像。SPIO與抗體結合后不會改變MR顯像特性，且毒性低，也不影響體內正常組織的分化，可無創(chuàng)、動態(tài)地定量檢測腫瘤血管表達，并對腫瘤新生血管進行磁共振顯像，是近年來MR分子成像研究的熱點〔5，6〕。VEGFR-2是血管內皮細胞表面與VEGF反應的主要受體〔7〕，是調節(jié)血管生成、內皮細胞增殖和遷移等的關鍵調控因子，VEGF/VEGFR-2是目前報道的最重要的血管生成抑制劑作用的靶點〔8〕。殼聚糖是自然界廣泛存在的高分子多糖，具有氨基和羥基基團，修飾氧化鐵納米顆粒表面，不僅使納米粒具有親水性、生物相容性及穩(wěn)定性〔9〕，且能幫助納米粒穿過細胞屏障，利于細胞攝取，能夠獲得良好的MR圖像對比〔10〕。

本研究成功構建殼聚糖修飾的VEGFR-2靶向MR分子探針及非靶向探針。SPIO和anti-VEGFR2-CS@SPION在電子顯微鏡下顆粒形態(tài)較規(guī)則，呈球形，分散性良好，具有良好的生物相容性與穩(wěn)定性，表明SPIO表面修飾殼聚糖后穩(wěn)定性增加，且保持原有的生物活性。弛豫率是反映造影劑性能的主要參數之一，弛豫率大則T2信號減低，造影劑的成像效果也越顯著〔11〕。SPIO與抗VEGFR-2抗體結合后MR顯像特性沒有改變。另外，anti-VEGFR2-CS@SPION不影響細胞存活率，為進一步體外MR研究提供了可靠的保障。經激光共聚焦顯微鏡及普魯士藍染色法驗證，VEGFR-2抗體造影劑可以與肝癌細胞特異性結合，對肝癌細胞具有很好的靶向效果。體外MR證實VEGFR-2抗體造影劑與肝癌細胞結合后信號強度顯著降低，具有肝癌細胞特異性靶向增強效果。

綜上，本實驗構建的殼聚糖修飾的VEGFR-2抗體負載SPIO納米探針具有無毒、良好的生物相容性及理化性質，體外細胞結合實驗及體外細胞MR成像證明抗體造影劑對肝癌細胞具有很好的靶向性，可為肝癌特異性診斷提供依據，也為腫瘤血管生成的深入研究奠定實驗基礎。

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〔2016-11-29修回〕

(編輯 李相軍)

Preparation of VEGFR-2-loaded superparamagnetic iron oxide nanoprobes and MRI molecular imaging with liver cancer cells

MEI Ping，QUAN Ji-Shan，SONG Xiao-Wei，etal.

The Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin, China

Objective To prepare a targeting MR molecular probe with vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)-2, to determine the specific targeting function in human hepatoma cell.Methods The superparamagnetic iron oxide nanoparticles was prepared by coprecipitation methods, then the VEGFR-2-loaded MR molecular probe waS prepared by modifying SPIO with chitosan in surface and coupling anti-VEGFR2. The SPIO nanoparticles with unmodified was treated as control group. The particle size, distributed and Zeta potential were tested by DLS, its T2 relaxivity rate was tested by 3.0T MR. The security of probe was determined by MTT assay. The combination probe in HepG2 cell was detected by laser confocal microscopy.Results The particle sizes of SPIO and anti-VEGFR2-CS@SPION were 20.6 nm and 38.4 nm respectiviey, the Zeta potentials were (20.3±1.32) mV and (3.58±1.28) mV respectively, and the T2 relaxivity rates were 0.179×106M-1S-1and 0.201×106M-1S-1respectively. The laser confocal microscopy showed HepG2 cell specific binding with antibody probe. More blue-stained particles appeared in cells. But only few blue-stained particles appeared in control group. T2 values of anti-VEGFR2-CS@SPION, simple SPIO and empty control groups were (55.6± 1.4) ms, (99.8±0.77) ms and (110.8±0.95) ms respectively, there were significant differences (F=317.547，P<0.01) between them.Conclusions The anti-VEGFR2 molecular probe modified by chitosan and labeled by SPIO has good biological characteristics and vitro MR imaging for hepatoma cell.

VEGFR-2；Superparamagnetic iron oxide particle；Chitosan；Tumor targeting；Molecular magnetic resonance imaging

國家自然科學基金資助項目( No.81160176)；吉林省科技發(fā)展計劃項目(20150101199JC)

金光玉(1975-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事分子影像學研究。

梅 蘋(1992-)，女，在讀碩士，主要從事分子影像學研究。

R445

A

1005-9202(2017)14-3406-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.011

1 延邊大學藥學院 2 延邊大學解剖學教研室