五味子乙素對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)細胞凋亡的影響

李佳芮 聶文博 張佳悅 董丹陽 李曉華 楊 擎 李 輝 李 娜 許 多

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021)

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五味子乙素對阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)細胞凋亡的影響

李佳芮 聶文博1張佳悅2董丹陽1李曉華3楊 擎 李 輝4李 娜3許 多1

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021)

目的 研究五味子乙素(Sch B)對阿爾茨海默病(AD)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法 50只BalB/C小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥對照組、Sch B低濃度組和Sch B高濃度組。應(yīng)用Morris水迷宮實驗檢測AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，HE染色觀察AD小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化，流式細胞術(shù)和TUNEL染色觀察小鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡，Western印跡法及免疫組織化學(xué)法檢測AD小鼠腦組織相關(guān)凋亡蛋白P53、Bax、Cyto C、C-caspase-9、C-caspase-3的表達。結(jié)果 與模型組比較，應(yīng)用Sch B小鼠水迷宮實驗路徑和潛伏期較短；HE染色顯示，與模型組比較，應(yīng)用Sch B干預(yù)后的AD小鼠海馬神經(jīng)細胞排列較為規(guī)整，細胞水腫明顯減輕；流式細胞術(shù)和TUNEL染色結(jié)果顯示，凋亡細胞比例明顯減少；Western印跡法與免疫組織化學(xué)實驗顯示，Sch B干預(yù)后AD小鼠腦組織內(nèi)P53、Bax、Cyto C、C-caspase-9、C-caspase-3蛋白的表達明顯降低(P<0.01)。結(jié)論 Sch B能明顯改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與抑制神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。

五味子乙素；阿爾茨海默?。坏蛲?/p>

阿爾茨海默病(AD)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?yōu)橹鞯睦夏昙膊　?〕，患者主要表現(xiàn)為記憶力減退、認知功能障礙及人格改變〔2〕。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，至2010年全世界共有3 650萬例AD患者〔3～5〕，尋找有效藥物預(yù)防和治療AD具有重要的意義。五味子乙素(Sch B)是中藥五味子中有效成分，具有抗衰老、抗氧化、抗凋亡等作用〔6〕。項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，Sch B對損傷神經(jīng)元具有保護作用〔7〕，本實驗觀察Sch B對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 實驗所用BalB/C小鼠購買于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。TUNEL染色試劑盒購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司，AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒購自天津三箭生物技術(shù)有限公司，兔抗Bax、P53、Cyto C、C-caspase-9、C-caspase-3、β-actin單克隆抗體購自Proteintech，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物及分組 50只健康BalB/C小鼠隨機分成5組，每組10只：空白組、模型組、陽性藥對照組、Sch B低濃度組，Sch B高濃度組。除空白組外，其余4組每天給予腹腔注射(60 mg/kg)D-半乳糖和氫溴酸東莨菪堿(0.5 mg/kg)，空白組給予等容量的生理鹽水進行腹腔注射和灌胃。Sch B低濃度組每日灌胃Sch B 0.1 g/kg，Sch B高濃度組每日腹腔注射Sch B 0.5 g/kg。陽性藥對照組每日給予鹽酸美金剛3 mg/kg灌胃。除空白外其余各組在造模前預(yù)先給藥2 w，繼續(xù)治療30 d后進行水迷宮檢測。

1.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮是具有自動成像及分析系統(tǒng)的水池，包括起點及放在水池中心的平臺，水面高于平臺1 cm，水中投入奶粉使其成為乳白色。將小鼠頭部染色，于起點處將小鼠頭朝水池壁放入水中，訓(xùn)練小鼠發(fā)現(xiàn)水池中的站臺，在120 s內(nèi)未發(fā)現(xiàn)站臺的小鼠將其引領(lǐng)至站臺，以2 d為訓(xùn)練期訓(xùn)練。第3日開始試驗并記錄小鼠運動軌跡，運動時間及距離。120 s內(nèi)未成功發(fā)現(xiàn)站臺者，記時間為120 s。

1.4 HE形態(tài)學(xué)染色 水迷宮試驗結(jié)束后，殺鼠取小鼠腦組織，4%甲醛固定，石蠟包埋，切片后進行HE染色，觀察小鼠腦組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5 流式細胞術(shù) 小鼠腦組織研磨后離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入100 μl染料結(jié)合緩沖液重懸后，先后加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI染液(50 mg/L)，混勻后室溫避光孵育15 min，補加400 μl結(jié)合緩沖液，靜置5 min后流式細胞術(shù)檢測凋亡率。

1.6 TUNEL染色 參照TUNEL說明書方法，小鼠腦組織石蠟切片，用無水乙醇清洗一次3 min，PBS浸洗5 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染等步驟后封片，以細胞核有棕黃色顆粒者為陽性細胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 Western印跡 腦組織提取蛋白后考馬斯亮藍法進行蛋白定量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。轉(zhuǎn)膜后用三羥甲基氨基甲烷緩鹽水(TBST)洗膜3次，每次5 min，3%牛血清白蛋白 (BSA)封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，顯色液中避光顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度值，進行半定量分析。

1.8 免疫組織化學(xué)染色 小鼠腦組織石蠟切片，浸泡于二甲苯溶液中浸潤15 min，用無水乙醇放置5 min，脫蠟水化，先后加入一抗、二抗孵育，DAB顯色后對組織進行蘇木精染色，光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析及Q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Sch B對AD小鼠水迷宮實驗潛伏時間和路徑的影響 水迷宮結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠運動軌跡更為復(fù)雜，潛伏時間較長(P<0.01)，說明AD模型出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶障礙；與模型組比較，Sch B組小鼠潛伏時間較短，運行路徑明顯縮小(P<0.01)，說明Sch B能明顯增強AD小鼠尋找目標(biāo)物體的記憶功能。見圖1、表1。

圖1 各組小鼠水迷宮路徑比較

組別運動時間(s)運動距離(m)空白組61.39±31.11867.44±356.12模型組113.28±10.831)1907.92±509.251)陽性藥對照組29.84±20.722)383.59±259.312)SchB低濃度組87.74±39.241556.41±515.19SchB高濃度組30.93±13.262)530.78±226.312)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，下表同

2.2 Sch B對AD小鼠腦形態(tài)學(xué)改變的影響 HE染色結(jié)果顯示，與空白組細胞凋亡率〔(4.63±1.40)%〕比較，模型組AD小鼠腦內(nèi)海馬細胞排列紊亂，組織排列疏松，神經(jīng)細胞出現(xiàn)水腫；而與模型組比較，給予Sch B預(yù)保護后小鼠腦組織中海馬細胞排列相對整齊，細胞水腫現(xiàn)象明顯減輕。見圖2。

2.3 Sch B對AD小鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組細胞凋亡率〔(4.63±1.40)%〕相比，模型組正常細胞數(shù)量減少，凋亡細胞明顯增加〔(37.92±7.23)%，P<0.05〕。與模型組比，給予Sch B預(yù)保護后，凋亡神經(jīng)細胞明顯減少(P<0.05)，且Sch B低濃度組與高濃度組有顯著差異〔(19.18±3.47)% vs (13.93±3.71)%，P<0.05〕，陽性藥對照組細胞凋亡率為(19.43±7.22)%。TUNEL染色檢測凋亡結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組中凋亡細胞明顯升高，凋亡細胞密度更大。給予Sch B干預(yù)后，AD小鼠腦組織凋亡細胞明顯減少。見圖3。

圖2 各組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的比較(HE，×400)

圖3 TUNEL染色比較各組小鼠神經(jīng)細胞凋亡情況(×400)

2.4 Sch B對AD小鼠腦組織凋亡蛋白表達的影響 見圖4、表2。Western印跡結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組P53、Bax、C-caspase-9和C-caspase-3蛋白表達含量明顯增加(P<0.01)。給予Sch B后，小鼠腦組織中P53、Bax、C-caspase-9和C-caspase-3凋亡相關(guān)蛋白含量明顯減少(P<0.01)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，組織切片中顯示神經(jīng)細胞染色為黃色或棕褐色為陽性細胞。與空白組對比，模型組陽性細胞數(shù)相對較多，給予Sch B干預(yù)后，陽性細胞數(shù)量明顯下降。見圖5。

1～5：空白組，模型組，陽性藥對照組，Sch B低濃度組，Sch B高濃度組圖4 Western印跡法檢測各組小鼠腦組織相關(guān)凋亡蛋白表達水平

表2 Western印跡檢測各組小鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白情況

圖5 免疫組織化學(xué)法檢測各組小鼠神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)蛋白表達(DAB，×200)

3 討 論

AD與腦組織氧化損傷所致的細胞凋亡有關(guān)，其典型病理變化有腦神經(jīng)節(jié)纏繞，淀粉樣斑塊形成〔8〕。中藥在防治AD疾病具有明顯療效，Sch B是從傳統(tǒng)中藥五味子的果實中分離出的二苯并環(huán)辛二烯衍生物，臨床上用于治療抗氧化、保護神經(jīng)元等藥理作用〔9〕。項目組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)Sch B對損傷的神經(jīng)元細胞具有保護作用〔7〕，但其保護作用是否通過抑制腦組織神經(jīng)細胞凋亡尚不清楚。

線粒體凋亡是經(jīng)典的凋亡途徑，主要受促凋亡基因Bax及原癌基因Bcl-2量的調(diào)控〔10〕。正常狀態(tài)下Bax蛋白與Bcl-2蛋白形成的二聚體Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，Bax蛋白允許小分子物質(zhì)通過線粒體膜，而其拮抗蛋白Bcl-2作用是封閉Bax孔道活性，從而維持平衡〔11～13〕。當(dāng)細胞內(nèi)Bax含量增多時，線粒體膜上的Bax蛋白孔道開放增加，可引起Cyto C的釋放〔14〕。從線粒體釋放出的Cyto C會與凋亡蛋白酶活化因子(A paf-1)相結(jié)合形成的復(fù)合物，從而激活Caspase-9蛋白，而活化的Caspase-9會使Caspase的下游Caspase-3蛋白活化〔15〕，從而造成細胞凋亡。P53是多種細胞活動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可以誘導(dǎo)Bax蛋白的表達，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生〔16〕，引起細胞衰老或死亡〔17〕。

綜上所述，Sch B通過下調(diào)AD小鼠腦組織P53和Bax蛋白的表達，從而降低細胞質(zhì)中Cyto C含量，繼而下調(diào)下游蛋白Caspase-9、Caspase-3的表達，抑制AD小鼠神經(jīng)元線粒體凋亡，保護受損神經(jīng)元，改善其記憶能力。

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〔2017-04-07修回〕

(編輯 曹夢園)

吉林省自然科學(xué)基金項目(No.20160101229JC);吉林省衛(wèi)生廳項目(No.2014Z024)

李 娜(1978-)，女，副研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

李佳芮(1995-)，女，本科在讀，主要從事神經(jīng)康復(fù)研究。

R741.05

A

1005-9202(2017)14-3390-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.005

1 吉林大學(xué)護理學(xué)院 2 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院

3 長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心 4 吉林省前衛(wèi)醫(yī)院