藥用植物廣藿香內(nèi)生真菌的生物活性研究

馬連營(yíng) 陳玉嬋 李浩華 李賽妮 章衛(wèi)民

廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

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藥用植物廣藿香內(nèi)生真菌的生物活性研究

馬連營(yíng) 陳玉嬋 李浩華 李賽妮 章衛(wèi)民*

廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

目的：研究40株廣藿香內(nèi)生真菌的生物活性，為進(jìn)一步發(fā)掘活性代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。方法：采用SRB、PNPG和DPPH法分別測(cè)定內(nèi)生真菌提取物的細(xì)胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等活性。結(jié)果：21株內(nèi)生真菌對(duì)腫瘤細(xì)胞SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2中的至少3種細(xì)胞具有抑制活性，IC50值在0.03～20.30 μg/mL之間，其中菌株A616的抑制活性最為顯著，對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為0.044、0.031、0.030、0.032μg/mL；13株內(nèi)生真菌具有抑制α-葡萄糖苷酶活性，其中菌株A598的活性最為顯著，其IC50值為184.38μg/mL；15株內(nèi)生真菌具有DPPH自由基清除活性，其中菌株A594、A598、A630顯示出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，IC50值分別為36.33、20.63、59.93 μg/mL。結(jié)論：廣藿香內(nèi)生真菌具有多種生物活性，值得進(jìn)一步深入研究。

廣藿香；內(nèi)生真菌；細(xì)胞毒；α-葡萄糖苷酶；DPPH

植物內(nèi)生真菌生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，與宿主協(xié)同進(jìn)化，形成了互惠共生的關(guān)系，能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，且容易從中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎并具有多種生物活性的化合物[1]。因此，內(nèi)生真菌已成為發(fā)現(xiàn)新天然活性物質(zhì)的重要資源之一，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。

廣藿香Pogostemoncabin(Blanco)Benth是十大廣藥之一，主要用于濕濁中阻、胸悶不舒、寒濕閉暑、腹痛吐瀉、鼻淵頭痛的治療[2]，其主要化學(xué)成分為萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿等[3]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲(chóng)等作用，是《中華人民共和國(guó)藥典》收載的“藿香正氣丸”和“抗病毒口服液”的重要原料，也是鮮藿香露、藿黃散、藿膽丸等30多種中成藥的主要組成原料。目前，廣藿香的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理活性方面，但對(duì)其內(nèi)生真菌的研究鮮有報(bào)道。本課題組前期對(duì)廣藿香內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離鑒定、類(lèi)群分析和抗菌活性研究，發(fā)現(xiàn)廣藿香內(nèi)生真菌多樣性豐富，部分菌株提取物具有明顯的抑菌活性[4]，說(shuō)明廣藿香內(nèi)生真菌具有重要的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值。為了充分發(fā)掘廣藿香植物中具有重要生物活性的內(nèi)生真菌資源，筆者進(jìn)一步對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行了細(xì)胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等活性研究，從中發(fā)掘出活性菌株，為今后研究廣藿香內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 供試菌株40株內(nèi)生真菌從采自廣東省陽(yáng)春市馬水鎮(zhèn)的廣藿香植物中分離獲得[4]。詳見(jiàn)表1。所有菌株保存于廣東省微生物研究所。

表1 40株廣藿香內(nèi)生真菌菌株

1.1.2 供試腫瘤細(xì)胞株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460、人肝癌細(xì)胞HepG-2。以上腫瘤細(xì)胞株均保存于廣東省微生物研究所。

1.2 試劑 RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(10000U/mL青霉素+10000U/mL鏈霉素)均購(gòu)自Gibco公司；磺酰羅丹明B(SRB)、二甲基亞砜(DMSO)、α-葡萄糖苷酶、對(duì)硝基苯-硝基葡萄糖苷(PNPG)、維生素C、2,2-二苯基-1-苦肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)，均購(gòu)自Sigma公司；順鉑(齊魯制藥有限公司)；阿卡波糖(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；其它試劑均為分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器 2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱(Shellab公司)；DMI3000B倒置顯微鏡(Leica公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；超凈工作臺(tái)(上海恒益科技有限公司)；Multiskan酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.4 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，KH2PO43g，MgSO41.5g，維生素B 10mg，蒸餾水1L，pH自然；RMPI 1640完全培養(yǎng)基：RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基1L，胎牛血清0.1L，雙抗0.01L，混合均勻，4℃冰箱保存。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)及其提取物的制備 挑取經(jīng)活化的內(nèi)生真菌菌絲體接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、120r/min搖床培養(yǎng)7d，過(guò)濾，收集發(fā)酵液并用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得提取物浸膏。將提取物浸膏用DMSO溶解配制成50mg/mL濃度，備用。

2.2 內(nèi)生真菌提取物的活性測(cè)定

2.2.1 細(xì)胞毒活性測(cè)定 采用SRB[5]法，將內(nèi)生真菌提取液和順鉑用1640培養(yǎng)基稀釋至所需的濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞株SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2，用胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%后，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)3個(gè)空白孔調(diào)零，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20μL提取物稀釋液，陰性對(duì)照加20μL培養(yǎng)基，以順鉑作陽(yáng)性對(duì)照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，加入50μL 50%冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4℃放置1h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后每孔加入4mg/mL SRB 溶液100μL，室溫中染色30min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次。最后加入每孔10mmol/mL的Tris溶液200μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值(A)，用以下公式計(jì)算提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，采用SigmaPolot 10.0 軟件計(jì)算對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-A樣品組/A對(duì)照組)×100%

2.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 參照楊付梅[6]和《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]：將內(nèi)生真菌提取液和阿卡波糖用PH 7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至所需的濃度，α-葡萄糖苷酶凍干粉配成濃度為0.2 U/mL溶液，底物(PNPG)配成濃度為10mmol/L溶液。吸取提取10μL于96孔板中，加入α-葡萄糖苷酶溶液20μL和50μL PBS作樣品組，以PBS作參比溶液(空白對(duì)照組)，以PBS代替PNPG溶液作樣品背景組，以PBS代替提取物溶液作陰性對(duì)照組，以阿卡波糖作陽(yáng)性對(duì)照組，37℃孵育10min，然后加入20μL PNPG，37℃反應(yīng)15min，加入3%SDS終止反應(yīng)，405nm處測(cè)定吸光度值(A)，采用SigmaPolot 10.0軟件計(jì)算對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值。

抑制率(%)= [1-(A樣品組-A樣品背景組)/(A陰性對(duì)照組-A空白對(duì)組照)]×100%

2.2.3 DPPH自由基清除活性測(cè)定 參照Turkoglu等[8]方法：將內(nèi)生真菌提取液和維生素C用無(wú)水乙醇稀釋成濃度為10mg/mL溶液，DPPH配制成0.2mmol/L溶液。吸取提取稀釋液100μL于96孔板中，加入濃度為0.2mmol/L的DPPH溶液100μL作樣品組，以無(wú)水乙醇溶液作參比溶液(空白對(duì)照組)，以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液作樣品背景組，以無(wú)水乙醇代替提取物溶液作陰性對(duì)照組，以維生素C溶液代替提取物溶液作陽(yáng)性對(duì)照組。置30℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30min，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔517nm處的吸光值(A)，按以下公式計(jì)算提取物對(duì)DPPH自由基的抑制率，采用SigmaPolot 10.0軟件計(jì)算對(duì)DPPH自由基清除的IC50值。

清除率(%)=[1-(A樣品組-陽(yáng)性組-A背景組)/(A陰性組-A空白對(duì)照組)]×100%

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞毒活性 采用SRB法測(cè)定40株廣藿香內(nèi)生真菌發(fā)酵提取物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有33株真菌提取物至少對(duì)1種供試腫瘤細(xì)胞有抑制作用(抑制率≥50%)，對(duì)3種腫瘤細(xì)胞有抑制作用(抑制率≥50%)的活性菌株有21株，對(duì)4種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用(抑制率≥50%)的活性菌株有19株；分別對(duì)SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2有抑制作用(抑制率≥50%)的菌株分別有26、22、9、21株，其中至少對(duì)1種腫瘤細(xì)胞具有顯著抑制活性(抑制率≥90%)的菌株有6株；有8株菌株對(duì)SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2細(xì)胞的IC50值在0.03～20.30μg/mL之間，菌株A625和A658對(duì)以上4種細(xì)胞株的IC50值分別是2.19、1.31、9.67、2.76和1.81、3.99、1.85、8.79μg/mL，接近陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑的IC50值，表明這2株菌株的細(xì)胞毒活性與順鉑相當(dāng)；菌株A616對(duì)細(xì)胞毒活性尤為顯著，對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的IC50值分別是0.044、0.031、0.030、0.032 μg/mL，低于陽(yáng)性對(duì)照藥物順鉑的IC50值，細(xì)胞毒活性?xún)?yōu)于順鉑(表2、表3)。

表2 廣藿香內(nèi)生真菌提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用(n=3)

注：提取物的作用濃度為100μg/mL。

表3 廣藿香內(nèi)生真菌提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的IC50值

3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 通過(guò)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13株內(nèi)生真菌提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，抑制率均在50%以上；抑制率在90%以上有5株，其中菌株A593、A630、A646、A651對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為440.63、443.75、403.16、426.56μg/mL，抑制效果接近陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖，菌株A598表現(xiàn)出顯著的抑制效果，IC50值為184.38μg/mL，優(yōu)于阿卡波糖。詳見(jiàn)表4、5。

表4 廣藿香內(nèi)生真菌提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用 (n=3)

注：提取物的作用濃度為1000μg/mL。

表5 廣藿香內(nèi)生真菌提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶IC50值 (n=3)

3.3 DPPH自由基清除活性 通過(guò)DPPH自由基清除活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有15株內(nèi)生真菌提取物對(duì)DPPH自由基的清除率均在50%以上，其中9株清除率在90%以上，菌株A594、A598、A630顯示出較強(qiáng)的清除效果，IC50值分別為36.33、20.63、59.93μg/mL。詳見(jiàn)表6、7。

表6 廣藿香內(nèi)生真菌提取物對(duì)DPPH自由基的清除率

注：提取物的作用濃度為1000μg/mL。

表7 廣藿香內(nèi)生真菌提取物對(duì)DPPH自由基的IC50值 (x±s,n=3)

4 小結(jié)

筆者對(duì)40株分離自廣藿香植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行了細(xì)胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和DPPH自由基清除等活性篩選，從中發(fā)現(xiàn)了21株內(nèi)生真菌至少對(duì)供試的3種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制活性；13株具有抑制α-葡萄糖苷酶活性；15株具有清除DPPH自由基活性。菌株A625和A658對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性接近陽(yáng)性藥物順鉑，菌株A616對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性?xún)?yōu)于順鉑；菌株A598對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性藥物阿卡波糖；菌株A594、A598、A630顯示出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，IC50值均≤60μg/mL。研究結(jié)果表明，廣藿香內(nèi)生真菌具有多種生物活性，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

本研究通過(guò)活性測(cè)試從廣藿香內(nèi)生真菌中篩選獲得了多株具有細(xì)胞毒、抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等生物活性的菌株，為后續(xù)深入發(fā)掘廣藿香內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物提供了理論依據(jù)。

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Study on Biological Activities of Endophytic Fungi FromPogostemoncabin

MA Lianying CHEN Yuchan LI Haohua LI Saini ZHANG Weimin*

State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangdong Institute of Microbiology, Guang zhou 510070, China

Objective To investigate biological activities of 40 endophytic fungal strains derived fromPogostemoncabin, thus providing a theoretical basis for further searchfor biologically activemetabolites.Methods Cytotoxic, α-glucosidaseinhibitoryand DPPH free radical scavenging activities of endophytic fungal extractswere examined by the SRB,PNPG and DPPHmethods, respectively.Results 21 strains showed inhibitory activity against at least three tumor cell lines of SF-268, MCF-7, NCI-H460 and HepG-2 with IC50values ranging from 0.03 to 20.30 μg/mL.Among them, the strain A616 exhibited the strongest cytotoxicity against the four tumor cell lines with IC50values of 0.044, 0.031, 0.030 and 0.032 μg/mL, respectively.13 strains showed α-glucosidaseinhibitory activity, among which the strain A598 displayed the strongest inhibitory activity with an IC50of 184.38μg/mL.15 strains showed DPPH free radical scavenging activity, and among them the strains A594, A598 and A630 exhibited the stronger free radical scavenging capacity with IC50of 36.33, 20.63 and 59.93 μg/mL, respectively.Conclusion Endophytic fungi derived fromP.cabinshowed several biological activities and deserved further study.

PogostemonCabin; Endophytic Fungus; Cytotoxic; α-glucosidase; DPPH

國(guó)家973前期專(zhuān)項(xiàng)(2014CB460613)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030302060，2014A030304050)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015A030313710)。

馬連營(yíng)(1973-)，男，漢族，本科，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與應(yīng)用。E-mail: mly@gdim.cn

章衛(wèi)民(1965-)，男，漢族，博士，研究員，研究方向?yàn)樗幱梦⑸镔Y源及其活性物質(zhì)研究。 E-mail: wmzhang58@qq.com

R285.5

A

1007-8517(2017)13-0028-05

2017-05-04 編輯：穆麗華)